Immunfluoreszenz ist eine grundlegende Methode, die helfen kann, wichtige Fragen im Nebennierenfeld über Nebennierenzonation, Zellidentität und Funktion zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie das Studium mehrerer Proteine ermöglicht und gleichzeitig die Morphologie des Nebennierengewebes bewahrt. Um die murine Nebenniere zu entfernen, schneiden Sie das umgebende Fettgewebe um und legen Sie die Drüse in einen Brunnen einer 24-Multiwell-Platte mit frischen PBS auf Eis.
Übertragen Sie die Drüse auf eine Petrischale oder Glasstütze unter einem Seziermikroskop und verwenden Sie zwei 25-Meter-Nadeln, um das angrenzende Fettgewebe zu entfernen. Wenn das gesamte Fett entfernt wurde, fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius mit Schaukeln für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation spülen Sie die Drüse mit drei 15-minütigen Wäschen bei vier Grad Celsius in ein bis zwei Millilitern frischer PBS pro Wäsche.
Nach der letzten Wäsche die Drüse in zwei sequenziellen Ethanol-Eintauchen bei vier Grad Celsius mit Schaukeln für zwei Stunden pro Inkubation dehydrieren. Um das Nebennierengewebe für die Verarbeitung vorzubereiten, wickeln Sie die Drüse in Gaze und umschließen Sie die Nebenniere in einer Gewebeeinbettungskassette. Dann legen Sie die Kassette in ein Glas gefüllt mit 70% Ethanol für vier Grad Celsius Lagerung bis zur Verarbeitung.
Um das Gewebe zu verarbeiten, legen Sie die Kassette zur Verarbeitung in den Gewebeprozessor ein, wie in der Tabelle angegeben. Übertragen Sie die Kassette am Ende des Programms in eine einbettende Station, die mit geschmolzenem 65-Grad-Paraffin gefüllt ist, und verwenden Sie ein Paar Zangen, um die Gaze auszupacken. Übertragen Sie die Nebenniere in der entsprechenden Position in der Mitte der Basis der Einbettform vorsichtig und gießen Sie das geschmolzene Paraffin auf die Drüse.
Dann bewegen Sie die Einbettform vorsichtig in eine Kühlschale, um das Aushärten des Paraffins zu erleichtern. Vor dem Schnitt durch Rotationsmikrotome eine Reihe von Mikroskop-Dias beschriften und die Dias auf einen 37-Grad-Celsius-Diawärmer legen. Geben Sie ca. 450 Mikroliter autoklaviertes Typ ein ultrareines Wasser auf jeden Schlitten und stellen Sie die Schnittdicke des Mikrotomes auf fünf Mikrometer ein.
Laden Sie das eingebettete Gewebe auf den Schneidblock und senken Sie den Paraffinblock, bis sich die Probe mit der Kante der Mikrotomklinge auf Flächenhöhe befindet. Drehen Sie das Handrad mit einem gleichmäßigen Rhythmus, führen Sie eine erste Trimmung, um das Paraffin zu entfernen und das Nebennierengewebe freizulegen. Erwerben Sie dann fünf Mikrometerabschnitte durch das Ende der Nebenniere mit Zangen, um jeden Abschnitt in den Wassertropfen auf eine der vorbeschrifteten Dias zu übertragen, während sie gesammelt wird.
Nachdem Sie das Vorhandensein von Gewebe in den Abschnitten durch Mikroskopie bestätigt haben, trocknen Sie die Dias auf der Kochplatte für etwa zwei Stunden und backen Sie sie mindestens über Nacht auf einer Rutschschale bei 37 Grad Celsius, bis kein Wasser mehr sichtbar ist. Nach dem Trocknen die Dias in einer Diabox bei Raumtemperatur aufbewahren. Für Immunfluoreszenz-Antigen-Retrieval, de-paraffinieren Sie die Dias mit zwei fünfminütigen 100%xylol-Tauchionen, gefolgt von Rehydrierung in einer absteigenden Ethanol- und Wasser-Immersion-Serie.
Nach dem Eintauchen ins Wasser die Dias auf einen Metallschieberhalter übertragen und den Halter 10 Minuten lang in ein Becherbecher aus kochendem 0,01 Molar-Citrat auf eine Kochplatte legen. Am Ende der Inkubation, entfernen Sie das Becherglas von der Kochplatte und lassen Sie es für 20 Minuten abkühlen, wobei darauf zu achten, dass alle Nebennierenabschnitte noch mit Puffer bedeckt sind. Wenn der Becher gekühlt ist, übertragen Sie die Dias in ein Coplin-Glas für drei 10-minütige Wärerungen in frischem PBS mit sanftem Schaukeln.
Wischen Sie nach dem letzten Waschen die Oberfläche jedes Dias sorgfältig ab, ohne die Gewebeabschnitte zu beschädigen, und verwenden Sie einen hydrophoben Marker, um einen Kreis um jeden Abschnitt zu bilden. Legen Sie die Dias in eine befeuchtete Kammer und fügen Sie schnell mindestens 50 Mikroliter Blockierlösung zu jedem Abschnitt für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Am Ende der blockierenden Inkubation die Dias dreimal in frischem PBS für fünf Minuten pro Wäsche mit Schaukeln waschen und diagleitet in die Kammer zurück.
Als nächstes fügen Sie den primären Antikörpercocktail von Interesse zu jedem Abschnitt für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius hinzu. Am nächsten Morgen die Proben mit drei 15-minütigen Wärten in frischem PBS pro Waschgang waschen und die Dias mit der entsprechenden Sekundärantikörperlösung für eine Stunde lichtgeschützt beschriften. Am Ende der Inkubation die Proben mit drei 15-minütigen Wäschen auf einer lichtgeschützten Wippe waschen und die Kerne der Abschnitte sieben Minuten lang bei Lichtschutz nach der letzten Wäsche mit DAPI beschriften.
Nach drei fünfminütigen PBS-Waschungen mit Schaukeln 60 Mikroliter Montagemittel hinzufügen, die für die Immunfluoreszenz geeignet sind, entlang der Oberfläche eines Deckglases pro Probe, und jede Schiebegewebeseite leicht auf ein Deckglas drücken, wobei darauf zu achten ist, Blasen zu vermeiden. Legen Sie dann jede Rutsche flach in einen dunklen Behälter, um sie bei Raumtemperatur mindestens 24 Stunden lang zu härten, bevor sie gebildert werden. Während des Fettentfernungsprozesses ist es wichtig, die Nebenniere nicht austrocknen zu lassen, da Dehydrierung die Gewebestruktur schädigen kann.
Nach erfolgreicher Entfernung des umgebenden Fettgewebes sollte die Nebenniere ohne zusätzliches sichtbares Fett leicht nachweisbar sein. Immunostaining of adrenal drüsen abschnitte wie gezeigt zeigt kernnuklearen steroidogenen Faktor eine Färbung der adrenocortical Zellen, Tyrosin Hydroxylase Färbung der medullären Zellen, DAPI Färbung der Kerne der nicht-steroidogenen Zellen der äußeren Kapsel, und Co-Färbung mit adrenocortical und medullary Zellen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Maus-Adrenale klein sind und dass ihre Positionen etwas variabel sind, was ihre Erkennung erschwert.
Daher ist es entscheidend, während der Zerlegung einen klaren Blick auf das Gebiet zu haben. Diese Verfahren sind grundlegende Techniken für die Untersuchung der Nebenniere in vivo. Im Anschluss daran können zusätzliche Methoden der Immunfärbung durchgeführt werden, um spezifische wissenschaftliche Bedürfnisse zu erfüllen.
Nach seiner Entwicklung ebnete die Immunfärbung den Weg für Forscher in den biomedizinischen Wissenschaftsbereichen, um die In-situ-Proteinexpression zu erforschen, ein nützliches Werkzeug in vielen Disziplinen und Bereichen.
