Dieses Protokoll hilft bei der Untersuchung der Rolle von Immunzellen in bestimmten Organen in Gesundheit und Pathologie. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass dies eine kostengünstige Technik ist, da es sich um eine manuelle Technik handelt. Demonstriert wird das Verfahren von Zhengkang Luo, einem Doktoranden aus meinem Labor.
Zunächst sollten die Thymiandrüsen und Milz von zuvor eingeschläferten Mäusen in 20 ml Szintillationsphiale oder 15 ml konische Röhrchen, gefüllt mit 5 ml Hanks ausgewogener Salzlösung, gegeben werden. Die Pankreas-Entwässerungs-Lymphknoten in 1,5 ml Mikroröhrchen geben, die mit 1 ml RPMI-1640 gefüllt sind. Achten Sie darauf, den gesamten Thymus und die Milz sowie alle PDLNs zu verwenden.
Halten Sie die Organe während des gesamten Verfahrens auf Eis. Mit einer Schere, gründlich drücken Sie den Thymus und Milz, um die Immunzellen zu befreien. Entsorgen Sie die restlichen thymischen und milden Kapseln.
Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr. Zentrifugieren Sie bei 433 mal g und bei 4 Grad Celsius für fünf Minuten, und werfen Sie den Überstand. Um die roten Blutkörperchen zu lysieren, setzen Sie die Zellsuspension in 5 ml 0,2 Molammoniumchlorid wieder auf und inkubieren Sie bei Raumtemperatur zehn Minuten lang.
Alle zwei Minuten die Rohre sanft umkehren. Am Ende der Inkubation 5 ml HBSS hinzufügen, um die Lyse zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 mal g und bei 4 Grad Celsius für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in ca. 5 ml HBSS wieder auf. Füllen Sie dann die Rohre mit HBSS. Wiederholen Sie diesen Vorgang, vom Zentrifugieren der Proben bis zum einmaligen Befüllen des Rohres mit HBSS.
Zentrifugieren Sie die Rohre noch einmal bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet in HBSS erneut aus. Erhalten Sie 5 ml Rundbodenröhrchen mit Zell-Siebkappen.
1 ml der thymischen Zellsuspension und 500 Mikroliter der Milzzellsuspension auf die Röhrchen übertragen, indem Sie die Suspension auf die Zellsiebkappen auftragen. Legen Sie zunächst eine 15 ml konische Röhre in ein Rack. Legen Sie ein steriles 250 Mikrometer Metallgitter über das Rohr.
Spülen Sie das Netz mit 1 ml RPMI. Als nächstes übertragen Sie die Lymphknoten auf das Metallnetz und verwenden Sie eine Pinzette, um sie durch das Netz zu schleifen. Tragen Sie 1 ml RPMI auf das Netz auf, um die Zellen in die Röhre zu spülen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang des Übertragens und Schleifens der Lymphknoten dreimal für jede Probe, und entfernen Sie dann das Netz. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in ca. 5 ml RPMI wieder auf.
Füllen Sie dann die Rohre mit RPMI. Wiederholen Sie diesen Vorgang, vom Zentrifugieren der Proben bis zum einmaligen Befüllen des Rohres mit RPMI. Zentrifugieren Sie die Rohre wieder bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet in 2 ml RPMI wieder auf. 2 ml der Zellsuspension in 5 ml Rundbodenrtuben mit Zellsiebkappen übertragen. Zunächst zentrifugieren Sie die Zellsuspension aus den Thymus-, Milz- und PDLN-Proben bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand. Färben Sie die Zellen mit Oberflächenantikörpern, wie im Textprotokoll beschrieben, und inkubieren Sie die Rohre 40 Minuten lang auf Eis. Als Nächstes fügen Sie 200 Mikroliter FACS-Puffer zu jedem Rohr hinzu.
Zentrifugieren Sie bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, und werfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang, fügen Sie den Puffer hinzu, zentrifugieren und verwerfen Sie den Überstand einmal. Setzen Sie das Zellpellet in 500 Mikroliter Permeabilisationsfixierungspuffer wieder aus, um die Zellen zu fixieren und zu permeabilisieren.
Übertragen Sie die Schläuche über Nacht bei vier Grad Celsius in einen Kühlschrank. Am nächsten Tag zentrieren Sie die Rohre bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet in 500 Mikroliter Permeabilisationswaschpuffer wieder auf.
Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Färben Sie die Zellen mit intrazellulären Antikörpern, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Rohre 1 Stunde auf Eis bebrüten.
Danach 500 Mikroliter Permeabilisation Waschpuffer zu jedem Rohr hinzufügen. Zentrifuge bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie das Pellet in 500 Mikroliter Permeabilisationswaschpuffer wieder auf.
Zentrifugieren Sie noch einmal bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 300 Mikroliter FACS-Puffer wieder auf. Analysieren Sie dann die Zellen auf einem Durchflusszytometer, wie im Textprotokoll beschrieben.
In dieser Studie werden einzelne Zellen aus thymischen Drüsen, PDLNs und Milz normaler glykämischer NOD-Mäuse isoliert und mit Treg-Zellmarkern, CD4, CD25, Foxp3, Helios und Neuropilin-1 für die zytometrische Analyse des Durchflusses gefärbt. Die Ergebnisse werden analysiert und hier als repräsentative Gating-Strategien dargestellt. Der Anteil der Helios-positiven Zellen unter den CD4-positiven, CD8-negativen, CD25-positiven, Foxp3-positiven Treg-Zellen ist in allen drei Organen höher als der der Nrp1-positiven Zellen.
Mehr als 80% der Treg-Zellen im Thymus sind als Ausdruck helios, das höher als in der PDLN ist, und die Milz. Der Anteil der NrP1-positiven Zellen unter Helios-positiven Treg-Zellen ist in der PDLN höher als in der Thymus- oder Milz. Die Mehrheit der Nrp1-positiven Treg-Zellen drückt auch Helios aus, und der Anteil der Helios-positiven Zellen unter den Nrp1-positiven Treg-Zellen ist im Thymus und milden höher als in der PDLN.
Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Helios ein besserer Marker ist, um T Treg-Zellen zu erkennen als Nrp1. Lymphknoten sind klein, aber einige intrazelluläre Marker benötigen eine große Anzahl von Zellen, um ein gutes Signal in der Durchflusszytometrie zu geben. Andere Methoden können nach diesem Verfahren nicht ausgeführt werden, da die Zellen bereits befleckt und tot sind.
Aber die vier Zellmarker des Tieres können ersetzt werden, um andere Arten von Immunzellen zu untersuchen.
