Hallo, mein Name ist Bartolomeo Bosco, und ich bin Doktorand am Laboratory of Transcriptional Network am Zentrum für Integrative Biologie der Universität Trient in Italien. Wie Sie wissen, ist die Transkription ein äußerst komplexer Prozess, bei dem der Transkriptionsfaktor und der Kofaktor räumlich und zeitlich organisiert werden. Die meisten von ihnen, einschließlich der menschlichen P53, erkennen bestimmte cis-wirkende Elemente, sogenannte Response-Elemente, und die Bindung an diese DNA-Sequenzierung ist für die Modulation der Transkription von Zielgenen erforderlich.
In dieser Arbeit möchten wir Ihnen das Protokoll zeigen, um P53-Sequenz spezifisch in Transaktivierungsfunktionen zu untersuchen, indem Hefe als Modellsystem als Protein in einem Farbreporter-Gen oder der Luziferase oder über die Quantifizierung des Zellwachstums verwendet wird, um die wichtigsten experimentellen Schritte und die Vielseitigkeit dieser Ansätze hervorzuheben. Protokoll eins, Konstruktion von Reporterhefestämmen, die ein bestimmtes P53-Antwortelement vor dem Adenin-2 oder dem Galleififegen enthalten. Um einen Reporterstamm zu konstruieren, folgen Sie zunächst den Schritten 1.1 bis 1.15, um Hefezellen mit Oligonukleotiden zu transformieren, die auf die gewünschte Promotorregion abzielen.
Die Transformation basiert auf dem Standard-Lithiumacetat-basierten Protokoll. Sobald Die Transformationsmittel auf 5-FOA-Platten erscheinen, in der Regel nach drei Tagen inkubationsgrad bei 30 Grad, verkleben Sie sie auf nicht-selektive YPDA-Platten und auch auf YPDA-Platten, die G418 enthalten, und markieren jede Platte, um ihren späteren Vergleich zu erleichtern. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 30 Grad.
Am nächsten Tag, identifizieren Sie den Kandidaten Reporter Stämme aus Kolonien, die G418-empfindlich sind, aber auf YPDA-Platten wuchs. Streifen Sie die identifizierten Kolonien auf einer neuen YPDA-Platte, um einzelne Kolonieisolate zu erhalten, und lassen Sie sie für zwei Tage bei 30 Grad wachsen. Überprüfen Sie die korrekte Integration des gewünschten P53-Antwortelements und führen Sie eine PCR-Reaktion mit den in Schritt 1.20 genannten Bedingungen durch.
Laden Sie ein Aliquot des PCR-Produkts auf Agarose-Gel, um die korrekte Amplikonlänge vor der Sanger-Sequenzierung zu überprüfen. Protokoll zwei, wir präsentieren ein Beispiel, wie P53 Protein-Transaktivierungsfähigkeit mit dem qualitativen farbbasierten Adenin-2-Hefe-Assay zu bewerten. Transformieren Sie Hefezellen mit P53-Expressionsvektoren nach demselben Lithiumacetat-basierten Protokoll, das in Abschnitt 1 beschrieben wird.
Streifen einzelne Hefe transformant Kolonien, bis zu sechs pro Platte, auf einer neuen selektiven Platte, und lassen Sie sie über Nacht bei 30 Grad wachsen. Am Tag danach, mit sterilem Samt, Nachbildung Platte die Streifen auf neue selektive Platten, die für die Beurteilung der Farbe Phänotyp ermöglichen, d.h. selektive Platten mit begrenzender Menge an Adenin.
Drei Tage lang bei 30 Grad inkubieren. Dieselben Streifen können mehrmals nachgebaut werden. Protokoll drei, wir präsentieren jetzt ein Beispiel für die Bewertung der P53 Protein-Transaktivierungsfähigkeit mit dem quantitativen Lumineszenz-basierten LUC1-Hefe-Assay.
Erstens transformieren Sie Hefezellen mit P53-Expressionsvektoren, die wiederum dem in Abschnitt 2 beschriebenen Lithiumacetat-basierten Protokoll folgen. Patch einzelne Transformantien auf neuen selektiven Platten, die Glukose als Kohlenstoffquelle enthalten, und lassen Sie sie bei 30 Grad über Nacht wachsen. Erstellen Sie für jeden Transformationstyp fünf bis sieben verschiedene Patches.
Nach dem nächtlichen Wachstum eine kleine Menge von Zellen mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Pipettenspitze in synthetischen selektiven Mediums, das Raffinose als Kohlenstoffquelle enthält, wieder aussetzen. Diese Zellsuspensionen sollten eine optische Dichte von 600 Nanometern um 0,4 aufweisen und können dann in mehrere 96-Well-Platten aufgeteilt werden, um sie bei unterschiedlichen Temperaturen, Behandlungen oder zur Expression von Zellen einer unterschiedlichen Galaktosemenge auszusetzen, um die P53-Expression zu aktivieren. Um die Galle-Reporteraktivität zu messen, übertragen Sie 10 bis 20 Mikroliter Zellsuspension von der transparenten 96-Well-Platte in eine weiße 384-Well-Platte und mischen Sie die Zellen mit einem gleichen Volumen von Lysepuffer, inkubieren für 10, 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Shaker.
10, 20 Mikroliter Galleifife Substrat hinzufügen. Und messen Sie Lichteinheiten mit einem Multilabel-Plattenleser. Messen Sie auch die optische Dichte der Kulturen in der 96-Well-Platte.
Protokoll vier, wir präsentieren jetzt ein Beispiel dafür, wie die Hemmung des Wachstums von Hefe durch P53 induziert zu nutzen. Transformieren Sie Hefezellen mit P53-Expressionsvektoren oder transformieren Sie sie mit Expressionsvektoren, um P53 und einen seiner Cofaktoren, wie MDM2, zu koexieren, und folgen Sie dem in Abschnitt 1 beschriebenen Lithiumacetat-basierten Protokoll. Wachsen Sie transformierende Zellen in selektiven mittleren bis etwa eine optische Dichte.
Und verdünnen Sie sie auf 0,05, und fügen Sie ein ausgewähltes Molekül zu der entsprechenden Konzentration hinzu. Inkubieren Sie Zellen bei 30 Grad auf einem Shaker für 42 Stunden. Dann säen Sie 100 Mikroliter Hefezellkultur in minimalen selektiven mitteltellern.
Zwei Tage bei 30 Grad inkubieren. Die korrekte RE-Integration anstelle der ICORE-Kassette kann durch Kolonie-PCR überprüft werden, beginnend mit einer winzigen Menge von Zellen aus Kandidatenhefe-Klonen und mit Primern, die in Tabelle 3 beschrieben sind, um den Zielort zu verstärken. PCR-Produkte, ein Band von etwa 500 Nukleotiden, können dann durch Sanger-Sequenz überprüft werden, um die Sequenz der bearbeiteten genomischen Position auf das Vorhandensein der richtigen P53-Antwortelementsequenz zu bestätigen.
Die Reporter-Sorte ist bereit, in funktionellen Assays verwendet zu werden. Um die Transaktivierungsfähigkeit des P53-Proteins zu bewerten, überprüfen Sie die Farbe der Hefekolonien. Zum Beispiel präsentieren wir einen Vergleich zwischen Wildtyp P53 und den Mutanten R175H und R282W mit zwei verschiedenen Reportern, P21-5-prime und PUMA, und zwei verschiedenen Temperaturen, 30 Grad und 37 Grad.
Interessanterweise ist R175H ein Funktionsverlust P53-Allel, rote Kolonien unter allen Bedingungen, R282W zeigt Temperaturempfindlichkeit mit Resttransaktivierungsaktivität bei 30 Grad, was zu weißen Kolonien, aber Verlust der Aktivität bei 37 Grad, was zu roten oder rosa Kolonien. Ein erweiterter Datensatz wird in Abbildung zwei B.Wild-Typ P53 in vier mutierten Allelen dargestellt, die auf Transaktivierung mit 10 verschiedenen P53-Antwortelement-Reporterstämmen, drei Temperaturen und konstitutiven Expressionswerten getestet wurden. Die Ergebnisse werden in einem Farbcode zusammengefasst, der an den Hefekolonie-Farbphänotyp erinnert.
Das Mutantallel P53 K139E behält eine Teilaktivität und ist kälteempfindlich. Zum Beispiel sind Kolonien in der GADD45 Reporter-Sorte bei 24 und 30 Grad rot, aber sie sind mit 37 Grad weiß. Hier stellen wir ein Beispiel für Ergebnisse vor, die mit dieser Methode erzielt wurden, und vergleichen die Transaktivierungssspezifität von humaner und C.eleganer P53-Hefe.
Die Ergebnisse im Balkendiagramm werden als durchschnittliche relative Lichteinheiten mit einem Standardfehler von vier Replikationen ausgedrückt. Fünf verschiedene P53-Antwortelemente wurden verglichen. Drei verschiedene Konzentrationen der P53-Proteinexpression wurden getestet, indem die Galaktosekonzentration im Medium variiert wurde.
Die beiden P53-Orthologs weisen eine deutlich unterschiedliche Transaktivierungssspezifität auf. Dies wird durch die Ergebnisse mit ced13- und V1-Antwortelementen veranschaulicht, die dieselbe Sequenz aufweisen, mit Ausnahme des Vorhandenseins oder Fehlens eines 28-Nukleotid-Abstandsers. Human P53 weist eine viel höhere Transaktivierung mit der V1-Bindungsstelle auf, während C.elegans P53 das Gegenteil zeigt.
Die Ergebnisse sind unabhängig von der Ebene des P53-Ausdrucks unter dem galactose-induzierbaren Promotor. Messen Sie das Hefewachstum, indem Sie die Anzahl der Kolonien zählen, die in der 100-Mikroliter-Kulturabsenkungen erhalten wurden. Berechnen Sie die mutierte reaktivierende Wirkung von Verbindungen unter Berücksichtigung des Wachstums von Wildtyp P53, die Hefe als maximal möglichen Effekt ausdrücken, der auf 100% eingestellt ist, während das Wachstum von Zellen, die mutiertep P53 exdrücken, null Reaktivierungsniveau darstellt.
In diesem Beispiel entlastet Nutlin-3a die Hemmung des Wildtyps P53, die durch die Koexpression von MDM2 verursacht wird, während PhiKan083 die Y220C P53-Mutation teilweise reaktiviert. In beiden Fällen führt dies zu einer P53-abhängigen Verringerung des Hefewachstums. Hefebasalzellen haben sich als nützlich erwiesen, um Werte, Aspekte der P53-Proteinfunktionen zu untersuchen.
Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll ist besonders empfindlich für die Bewertung des Transaktivierungspotenzials von Wildtyp- oder krebsassoziierten Mutanten P53 zu Varianten von Zielstandorten. Darüber hinaus kann der Ansatz verwendet werden, um kleine Moleküle zu identifizieren, die P53-Funktionen beeinflussen, und die P53-Interaktion mit Cofactor zu untersuchen. Der Einsatz der Farbreporter, die Miniaturisierung der Luziferase sowie der Wachstumshemmungstest führen zu kostengünstigen und skalierbaren Assays, die für das Screening chemischer Bibliotheken potenziell geeignet sind.
Schließlich kann das in dieser Arbeit beschriebene System leicht mit der Untersuchung anderer sequenzspezifischer Transkriptionsfaktoren übernommen werden.
