Die posttranslationale Modifikation von Proteinen durch das kleine Protein Ubiquitin ist an vielen Ereignissen in der Zelle beteiligt. Diese Studie stellt eine originelle Ergänzung der Toolbox für die Protein-Ubiquitinationsanalyse dar. Wir verwenden Anreicherungstechniken und Massenspektrometrie, um das tiefe Ubiquitinom aufzudecken.
Wir haben einige Verbesserungen an der Analyse von diGly Peptiden vorgenommen, die aus ubiquitinierten Proteinen stammen. Dazu gehören rohe Peptidfraktionierung vor der Anreicherung und die Anwendung von fortgeschritteneren Peptidfragmentierungseinstellungen im Orbitrap. Insgesamt führt dies zu einer größeren Abdeckung des Ubiquitinoms.
Mehrere Aspekte des Protokolls sind schwer in Worte zu fassen. Die Visualisierung einiger wichtiger Schritte ist wichtig, um diese Analysen von verschiedenen Operatoren in einem anderen Labor wiederholen zu können. Das Verfahren wird von Karel Bezstarosti demonstriert, der ein leitender Techniker in meinem Labor ist.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung kultivierter Zellen oder Maus-Hirngewebe für das Experiment. Wenn Sie mit Zellen arbeiten, lysieren Sie das Zellpellet aus einer 150 Zentimeter quadratischen Kulturplatte in zwei Millilitereis, 50 Millimolar Tris HCL mit 0,5% Natriumdesoxycholat. Kochen Sie das Lysat bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten.
Dann beschallen Sie es bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Wenn Sie in vivo Maus-Hirngewebe verwenden, lysieren Sie es in einem eiskalten Puffer mit 100 Millimolaren Tris HCL, 12 Millimolar Natriumdeoxycholat und 12 Millimolar-Natrium N-Lauroylsarcosinat. Beschallen Sie das Lysat für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Dann kochen Sie es für fünf Minuten bei 95 Grad Celsius. Als nächstes quantitieren Sie die Gesamteinmenge des Proteins mit einem kalorimetrischen Absorber-BCA-Protein-Assay-Kit, das mindestens mehrere Milligramm für eine erfolgreiche diGly-Peptid-Immunpräzipitation betragen sollte. Mischen Sie bei SILAC-Experimenten die leichten und schwer beschrifteten Proteine in einem Verhältnis von eins zu eins, basierend auf der Gesamteniammenge.
Reduzieren Sie alle Proteine mit fünf Millimolaren DTT für 30 Minuten bei 50 Grad Celsius. Und anschließend alkyliern sie mit 10 Millimolar Iodoacetamid für 15 Minuten im Dunkeln. Dann führen Sie die Proteinverdauung mit Lys-C für vier Stunden durch.
Und Trypsin-Verdauung über Nacht bei 30 Grad Celsius oder bei Raumtemperatur. Teilen Sie die Probe am nächsten Tag in zwei Zwei-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen auf und fügen Sie der verdauten Probe TFA zu einer Endkonzentration von 0,5% Zentrifugieren bei 10.000-fachem G für 10 Minuten hinzu, um das gesamte Waschmittel auszufallen und zu entfernen. Sammeln Sie das Peptid, das Überstand für die nachfolgende Fraktionierung enthält.
Verwenden Sie die Chromatographie der C18-Chromatographie mit hohem pH-Wert, um die tryptischen Peptide zu fraktionieren. Bereiten Sie eine leere Sechs-Milliliter-Säulenpatrone mit 0,5 Gramm stationärem Phasenmaterial für etwa 10 Milligramm Proteinverdauung vor. Die Peptide auf die vorbereitete Säule laden und mit ca. 10 Volumina von 0,1%TFA, gefolgt von 10 Volumen Wasser, waschen.
Elute die Peptide in drei Fraktionen mit 10 SpaltenVolumen von 10 Millimolar Ammoniumformat mit sieben, 13,5 bzw. 50%Acetonitril. Dann, leuchten alle Brüche. Eine Charge von Ubiquitin-Restmotiv-Antikörpern, die mit Protein A Agarose-Perlenschlämme konjugiert sind, wird in sechs gleiche Fraktionen aufgeteilt.
Lösen Sie die drei Peptidfraktionen entsprechend den Manuskriptrichtungen auf und drehen Sie die Trümmer herunter. Fügen Sie die Überräube der drei Fraktionen in die Perlenschlämme ein, während die anderen drei Fraktionen auf Eis gehalten werden. Und bebrüten sie für zwei Stunden bei vier Grad Celsius auf einer Rotatoreneinheit.
Dann drehen Sie die Perlen herunter. Übertragen Sie den Überstand auf eine frische Charge von Perlen. Und wiederholen Sie die Inkubation mit den restlichen drei Perlenschlämmenfraktionen.
Speichern Sie die Überstande für die nachfolgende globale Proteomanalyse. Und übertragen Sie die Perlen auf 200 Mikroliter Pipettenspitzen, die mit einem GFF-Filterstecker ausgestattet sind. Die Spitzen in 1,5 Milliliter-Röhren geben, die mit einem Zentrifugen-Spitzenadapter ausgestattet sind, und die Perlen dreimal mit 200 Mikrolitereiseis IAP-Puffer waschen, gefolgt von drei Wäschen mit eiskaltem gereinigtem Wasser.
Drehen Sie die Spalten bei 200 mal G für zwei Minuten zwischen den Wäschen herunter, um sicherzustellen, dass die Spalte nicht trocken läuft. Nach der Endwäsche die Peptide mit zwei Zyklen bei 50 Mikrolitern von 0,15%TFA elute. Die Peptide mit einer C18-Stufenspitze entsalzen und mit Vakuumzentrifugation trocknen.
Führen Sie LC-MS/MS-Experimente an einem empfindlichen Massenspektrometer durch, das an ein Nanoflow-LC-System gekoppelt ist. Die Säule wird nach Manuskriptanweisungen aufgebaut und bei 50 Grad Celsius gehalten. Betreiben Sie das Massenspektrometer im datenabhängigen Erfassungsmodus.
Sammeln Sie die MS1-Massenspektren mit hoher Auflösung mit einer automatisierten Gain-gesteuerten Zieleinstellung von 4E5 und einer maximalen Einspritzzeit von 50 Millisekunden. Führen Sie die Massenspektrometrieanalyse im intensivsten ersten Modus mit der Höchstgeschwindigkeitsmethode mit einer Gesamtzykluszeit von drei Sekunden durch. Führen Sie dann eine zweite Runde der DDA MS-Analyse im am wenigsten intensiven ersten Modus durch, die eine optimale Erkennung von Peptiden mit geringer Häufigkeit sicherstellt.
Filtern Sie die Vorläuferionen nach ihren Ladungszuständen und der monoisotopen Spitzenzuweisung. Und schließen Sie zuvor verhörte Vorläufer dynamisch für 60 Sekunden aus. Isolieren Sie Peptid-Vorläufer mit einem Quadrupol-Massenfilter, der auf eine Breite von 1,6 Thomson eingestellt ist.
Dann sammeln SIE MS2-Spektren in der Ionenfalle bei einer automatisierten Gain-Steuerung von 7E3 mit einer maximalen Einspritzzeit von 50 Millisekunden und HCD-Kollisionsenergie von 30%Analysieren Sie die Massenspektrometrie-Rohdateien mit einer geeigneten Suchmaschine, wie der frei verfügbaren MaxQuant Software-Suite basierend auf der Andromeda-Suchmaschine. Öffnen Sie MaxQuant, und wählen Sie die entsprechenden Rohdatendateien aus. Legen Sie die Anzahl der Prozessoren fest, und klicken Sie auf die Registerkarte Gruppenspezifische Parameter.
Wählen Sie die Verdauung und lassen Sie drei verpasste Spaltungen zu. Wählen Sie dann Änderungen aus und fügen Sie diGly zu den Variablenänderungen hinzu. Wählen Sie die Registerkarte Globale Parameter aus, und fügen Sie die richtige Proteinsequenzdatenbank hinzu.
Lassen Sie die anderen Einstellungen als Standard und drücken Sie Start, um die Datenbanksuche durchzuführen. Legen Sie für die quantitative Analyse von SILAC-Experimentdateien die Multiplizität auf zwei fest, und wählen Sie die schweren Aminosäureetiketten aus. Wenn die Suche abgeschlossen ist, importieren Sie die Textdateien in Perseus.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um Ubiquitinationsstellen in Proteinen aus kultivierten Zellen und In-vivo-Material zu identifizieren, indem diGly Peptide mit Nanoflow LC-MS/MS detektiert wurden. Es wurden mehrere Verbesserungen am bestehenden Protokoll vorgenommen, was zu einer höheren Anzahl von nachgewiesenen diGly-Peptiden führte. Vor der Immunpräzipitation wurde eine grobe Fraktionierung in drei Fraktionen durchgeführt.
Eine der Fraktionen enthält Ubiquitins eigenes K48 modifiziertes tryptisches DiGly-Peptid, das sich durch einen breiten Peak im LC-Chromatogramm auszeichnet. Darüber hinaus wurde das Peptidfragmentierungsregime angepasst, um die LC-MS-Läufe mit den höchsten ersten und niedrigsten ersten Fragmentierungsregimen im Datenanalyseverfahren zu kombinieren, die mehr als 4 000 zusätzliche einzigartige DIGly-Peptide erzeugten. Mehr als 23.000 diGly Peptide können routinemäßig aus einer einzigen Probe von HeLa-Zellen identifiziert werden, die mit einem Proteasom-Hemmer behandelt wurden.
Von allen diGly-Peptiden, die über drei biologische Replizien-Screens identifiziert wurden, waren in allen drei mehr als 9 000, während mehr als 17 000 in mindestens zwei von drei Replikationen vorhanden waren. Die Anzahl der Peptid-Identifikationen hängt stark von der Menge des Eingangsmaterials ab. Je nach Ausgangsmaterial ist mit einer ungefähren Anzahl identifizierter diGly-Peptide zu rechnen, aber diese Zahlen sind nur Schätzungen und hängen auch von der Art des verwendeten Massenspektrometers ab.
Bei der Durchführung dieses Protokolls wären die bisherigen Erfahrungen mit Massenspektrometrie-basierten Proteomikmethoden und der Handhabung und Analyse von winzigen Probenmengen sicherlich von Vorteil. Die MaxQuant-Software könnte durch einen anderen Datenbanksuchalgorithmus ersetzt werden. Auch kann eine andere Art von Massenspektrometer verwendet werden.
Die Ergebnisse in Bezug auf Peptid-Identifikationen können leicht abweichen, aber dies ist typisch für jede Massenspektrometrie basiert Proteomik Assay. Ubiquitin ist wichtig für den fortschreitenden Proteinabbau, spielt aber auch eine Rolle in vielen anderen Prozessen in der Zelle. Tiefere Kenntnisse von Ubiquitin als posttranslationale Modifikation sind entscheidend, um seine Funktion besser zu verstehen.
