Perivaskuläres Fettgewebe umgibt die Blutgefäße und reguliert die kardiovaskuläre Physiologie. Dieses Protokoll wird verwendet, um Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der Funktion menschlicher Fettvorläufer in der vaskulären Mikroumgebung zu beantworten. Adipose-Vorläuferzellen variieren je nach anatomischer Lage.
Wir zeigen, dass eine Population von multipotenten Vorläufern erfolgreich aus perivaskulärem Fettgewebe von Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen abgeleitet werden kann. Der Medizinstudent spencer Scott aus meinem Labor wird das Verfahren demonstrieren. Beziehen Sie ein 500 Milligramm Stück Human Perivascular Adipose Tissue oder PVAT aus dem Operationssaal, wie im Textprotokoll beschrieben.
Übertragen Sie frisches menschliches PVAT von DMEM in eine 50 Milliliter konische Röhre mit 25 Milliliter Antibiotikalösung. Mit Schaukeln für 20 Minuten bei vier Grad Celsius bebrüten. Während die PVAT in antibiotischer Lösung ist, tauen Sie einen Aliquot von Dissoziationspuffer bei 37 Grad Celsius auf.
Fügen Sie 50 Mikroliter 100x Antibiotikum/Antimykotiklösung zu fünf Milliliterdissoziationspuffer hinzu und sterilisieren Sie sie mit einem 0,22-Mikron-Spritzenfilter. Fügen Sie einen Milliliter Gelatinelösung zu einem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzu. Verwenden Sie in einer laminaren Durchflusshaube sterile Zangen und Scheren, um PVAT von der Antibiotikalösung auf eine sterile Petrischale zu übertragen.
Fügen Sie dem Gewebe einen Milliliter vorgewärmten Dissoziationspuffer hinzu. Das gesamte Gewebe mit sterilen Zangen und Sezierscheren fein in eine Gülle zerkleinern. Übertragen Sie die Ein-Milliliter-Gülle auf vier Milliliter Dissoziationspuffer.
Inkubieren Sie die Röhre auf ihrer Seite in einem vorgewärmten 37 Grad Celsius Orbital-Shaker bei 200 U/min für eine Stunde. Nach einer Stunde sollten keine sichtbaren Gewebeteile vorhanden sein und die Lösung erscheint als trübe Zellsuspension. Filtern Sie die Lösung durch ein 70-Mikron-Zellsieb-Set auf einem 50-Milliliter-Konusrohr.
Spülen Sie das Sieb mit zusätzlichen 10 Milliliter Antibiotika-Lösung, um so viele Zellen wie möglich zu erfassen. Drücken Sie das Sieb nicht. Nun pellet die Zellen für 12 Minuten bei 300 mal g in einer schwingenden Eimerzentrifuge.
Nach der Zentrifugation wird das Rohr in eine fettige Deckschicht aus Adipozyten, einer Interphase und einem Pellet getrennt. Das Pellet ist die stromale Gefäßfraktion, die Endothelzellen, Immunzellen, Blutzellen und Vorläuferzellen enthält. Das Pellet in 10 Milliliter HBSS und Zentrifuge fünf Minuten bei 300 mal g wieder aufhängen.
Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wähme in HBSS. Nun die Gelatine von einer 24-Well-Platte ansaugen. Waschen Sie den Brunnen einmal mit HBSS vorsichtig, um ungebundene Gelatine zu entfernen.
Setzen Sie das stromale Gefäßfraktionpellet mit intakten roten Blutkörperchen in einem Milliliter Wachstumsmedium und Samen auf den gelatinebeschichteten Brunnen aus. Dann fügen Sie menschlichen FGF2 zu einer endigen Konzentration von 25 Nanogramm pro Milliliter in Kulturmedium. 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 inkubieren.
Nach dem Wachstum der Zellen für 24 Stunden, entfernen Sie die Wachstumsmedien und waschen Sie die Zellen fünfmal mit HBSS. Dieser Waschschritt entfernt rote Blutkörperchen und abgestorbene Zellen. Dann fügen Sie einen Milliliter frische Skaliermittel mit 25 Nanogramm pro Milliliter FGF2 zu jedem Brunnen ergänzt.
Wechseln Sie die Medien alle 48 Stunden und stellen Sie sicher, dass sie jedes Mal mit 25 Nanogramm pro Milliliter frischem FGF2 ergänzt werden. Durchgangszellen, sobald sie sieben bis zehn Tage nach der Explantation 100% Zusammenfluss erreichen. Um dies zu tun, aspirieren Wachstumsmedien und waschen Sie die Monolayer zweimal mit einem Milliliter HBSS.
Alle HBSS aus den Brunnen ansaugen und ein paar Tropfen Zelldissoziationslösung hinzufügen. Tippen und wirbeln Sie die Platte mehrmals und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2 für fünf bis sieben Minuten, um die Zellen zu heben. Dann fügen Sie etwa einen Milliliter frisches Kulturmedium zu den losgelösten Zellen hinzu.
Verteilen Sie 500 Mikroliter der freistehenden Zellen auf zwei Brunnen einer 24-Well-Platte, die jeweils 500 Mikroliter Wachstumsmedien und 25 Nanogramm FGF2 enthält. Auch Kultur menschliches Knochenmark Mesenchymal Stammzellen oder MSC Kolonien, wie im Textprotokoll beschrieben. Die entsprechenden Anzahl von Knochenmark- und PVAT-abgeleiteten Zellen pro Bohrung einer 12-Well-Platte.
Für adipogene und osteogene Erkrankungen, Platte etwa 200, 000 bis 225, 000 Zellen pro Brunnen. Während für chondrogenische Bedingungen, Platte 150, 000 bis 175, 000 Zellen pro Brunnen. Dann dissoziieren Sie Zellen sowohl von der menschlichen PVAT-Vorläuferzellpopulation als auch von der mSC-Population des menschlichen Knochenmarks, indem Sie eine Zellablösung hinzufügen.
Inkubieren Sie die Zellen in der Ablösungslösung bei 37 Grad Celsius und 5%CO2 für fünf Minuten. Ziehen Sie die Populationen in separate 15 Milliliter konische Fläschchen. Drehen Sie die Durchstechflaschen sieben Minuten lang mit 500 mal g nach unten, um die Zellen zu pellet.
Setzen Sie dann die Zellen in einem Milliliter PBS wieder aus und verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellzahl zu schätzen. Die Zellen wie bisher in 12-Well-Gerichten auftellern. Stellen Sie separate Gerichte für die induzierten und nicht-induzierten adipogenen und osteogene Bedingungen zur Verfügung.
Und fügen Sie 1,5 Milliliter adipogene und osteogene Leitungsmedien zu jedem Brunnen des induzierten Zustands hinzu. Dann fügen Sie 1,5 Milliliter adipogene und osteogene Nicht-Induktionsmedien zu jedem Brunnen des nicht-induzierten Zustands hinzu. Beginnen Sie mit der Inkubation der adipogenen und osteogenen induzierten und nicht induzierten Zellpopulationen bei 37 Grad Celsius und 5% CO2.
Drehen Sie das restliche Volumen menschlicher PVAT-Vorläuferzellen und menschlicher Knochenmark-MSCs sieben Minuten lang bei 500-fachm g herunter. Bestimmen Sie das Volumen, das benötigt wird, um das verbleibende Knochenmark und PVAT-abgeleitete Zellpellets wieder aufzuhängen, um eine Dichte von 100.000 Zellen pro 10 Mikroliter zu erreichen. Dann setzen Sie die Pellets im berechneten Volumen der MSC-Wachstumsmedien für chondrogenische Abstammungsinduktion wieder aus.
Bewegen Sie das Volumen der Zellen vorsichtig mit einer Pipette nach oben und unten, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. Nun pipette ein 10 Mikroliter Tröpfchen der konzentrierten Zelllösung in die Mitte jedes Brunnens, um eine Mikromasse von 100. 000 Zellen zu bilden. Legen Sie einen Milliliter steriles Wasser in den angrenzenden Brunnen, um Verdunstung zu verhindern.
Inkubieren Sie die Mikromassenkulturen für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5%CO2, damit sich die Mikromasse aggregieren kann. Nach zwei Stunden, sorgfältig hinzufügen chondrogene Differenzierung Medien spiked mit 10 Nanogramm pro Milliliter menschlichen TGF-beta-eins zu jedem der induzierten Zustand Brunnen. Fügen Sie nun 1,5 Milliliter der nicht induktionsmittelförmigen Medien vorsichtig in die nicht induzierten Zustandsbrunnen.
Verschrotten oder gießen Sie die Mikromasse in der induzierten chondrogenischen Zustand in eine Kassette, um zu dehydrieren, einbetten, und Färben der Probe, wie im Textprotokoll beschrieben. Adipogene Differenzierungsstudien wurden parallel zu den von menschlichen Knochenmark abgeleiteten MSC- und PVAT-abgeleiteten Vorläuferzellen durchgeführt. Im nicht induzierten Zustand ist keine Lipidakkumulation erkennbar.
Dies steht im Gegensatz zu dem induzierten Zustand, der nach der Färbung neutraler Lipide mit Oil Red O gezeigt wurde. Während der Grad der Differenzierung in den menschlichen aortenförmigen PVAT-abgeleiteten Zellen robuster ist, zeigten beide menschlichen Zellquellen die Fähigkeit, für die adipogene Abstammung zu unterscheiden. Das osteogene Differenzierungsprotokoll wurde für menschliche Knochenmark-abgeleitete MSCs und PVAT-abgeleitete Zellen verwendet. Nicht induzierte Zellen färbten sich nicht mit Alizarin Red.
Nach dem osteogenen Differenzierungsprotokoll entwickelten die menschlichen MSCs verkalkte Knötchen, die mit Alizarin Red gefärbt wurden, während menschliche Aorten-PVAT-Zellen dies nicht taten. Zellen, die sowohl von menschlichen Knochenmark-MSCs als auch von humanem PVAT abgeleitet wurden, zeigten Merkmale, die für die chondrogenische Differenzierung charakteristisch sind, mit reichlich Kollagenansammlung in der Mikromasse. Mikromasse wird aus menschlichen Knochenmark MSCs gebildet und aortenförmige PVAT-abgeleitete Zellen zeigten auch eine reichliche Ansammlung von Glykosaminoglykanen, wie durch Alcian Blue Färbung angegeben.
Morphologisch wurden Strukturen ähnlich wie Lücken mit Zellen nachgewiesen, die in Hohlräumen saßen, die von Kollagenablagerungen umgeben waren. Es ist wichtig, perivaskuläres Fettgewebe vor enzymatischer Disassoziation fein zu zerkleinern und sicherzustellen, dass für jeden Liniendifferenzierungstest eine angemessene Zelldichte plattiert wird. Nach diesem Verfahren sollte quantitative PCR in Kombination mit Western Blot und Flow Zytometrie verwendet werden, um linienspezifische Marker von differenzierten Vorläufern aus perivaskulären Fett- und Knochenmarkquellen zu charakterisieren.
Mit dieser Technik können wir beginnen, die Mechanismen zu verstehen, die die perivaskuläre Fettgewebeerweiterung und Dysfunktion während der Fettleibigkeit regulieren und die Implikationen, die Vorläuferzellen auf die Gefäßfunktion und Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben.
