Obwohl die Skalierung eines der universellen und grundlegenden Attribute von Entwicklungssystemen ist, wurden die zugrunde liegenden Mechanismen in vielen Organen und Geweben nicht verstanden. Die in diesem Video vorgestellte Technik zur Größenreduzierung von Zebrafischen wird Ihr Verständnis der Mechanismen verbessern, die dynamischen Skalierungsprozessen zugrunde liegen. Die Vorteile der Arbeit mit Zebrafischen sind, dass es einfach ist, Live-Bildgebung, Genetik und quantitative Analyse durchzuführen.
Unsere Technik ist auch sehr einfach und einfach anzuwenden, ohne spezielle Ausrüstung oder intensives Training. Die Gesundheit von Embryonen ist der Schlüssel zum Erfolg mit dieser Technik. Verwenden Sie junge Fische als Eltern und achten Sie darauf, den Schaden zu minimieren, indem Sie die Krähen entfernen.
Und spielen Auch in der Größe der Wunde auf dem Dotter, und wie viele Zellen entfernt werden. Da die Embryonen, die wir verwenden, sehr jung und zerbrechlich sind, müssen sie beim Übertragen und Hacken sehr sorgfältig behandelt werden. Gleichzeitig muss es schnell sein, damit das Verfahren im richtigen Zeitfenster der Entwicklung durchgeführt werden kann.
Visuelle Demonstration kann ein gutes Gefühl dafür geben, wie man kleinere Embryonen effektiv produziert. Um eine Drahtschlaufe für embryonales Hacken zu erstellen, füttern Sie 20 Zentimeter langen steifen und nicht korrosiven Edelstahldraht durch eine Glaskapillare, wodurch oben eine kleine, einen Millimeter lange Schleife entstellt wird. Legen Sie ein kleines Tröpfchen mit klarem Nagellack auf die Spitze der Klasse Kapillare, zwischen der Kapillare und der Drahtschlaufe, um es an Ort und Stelle zu halten, um sicherzustellen, dass kein Nagellack auf den Schlaufenteil zu bekommen, da es die Embryonen beschädigen kann.
Und dann trocknen lassen. Verwenden Sie Laborband, um die Glaskapillare mit der Schlaufe auf einen hölzernen Essstäbchen zu befestigen, so dass etwa zweieinhalb Zentimeter der Glaskapillare über den Essstäbchen hinaus reicht, damit der Essstäbchenteil des Werkzeugs später nicht ins Wasser abtaucht. In einer 100-Millimeter-Glas-Petrischale mit Einem Kunststoffspachtel etwa 0,5 Milliliter 2%Methylcellulose in der Mitte des Bodens dünn und gleichmäßig auf eine Dicke von etwa 0,5 Millimetern verteilen.
Etwa 30 Milliliter der Lösung von einem Drittel Ringer auf die Seite der Schale gießen und auf den Rest der Schale verteilen und die Methylcellulose bedecken lassen. Platzieren Sie zuvor de-chorionierte Embryonen in der 256-Zelle auf eine K-Zell-Stufe auf 2%Methylcellulose, um sicherzustellen, dass die Embryonen auf ihre Seite ausgerichtet sind. Um Blastula zu hacken, verwenden Sie die Drahtschleife, um in der Nähe des Tierpols zu schneiden, senkrecht zur tierischen Gemüseachse und hacken Sie etwa 30 bis 40% der Blastoderm-Zellen.
Tippen Sie dann vorsichtig auf die Enden zusammen, um den verbleibenden Zellen zu helfen, sich zurückzuhalten. Für Eigelb, verwenden Sie den montierten Draht, um eine kleine Wunde in der Nähe der Gemüsestange zu machen, indem Sie die Eimembran nicken, was dazu führt, dass das Eigelb für ein paar Minuten aussaugen und dann heilen. Wenn das Eigelb aufhört auszunänst, verwenden Sie eine Pipette, um den Embryo außerhalb der Methylcellulose in der gleichen Schale zur Erholung zu bewegen.
Blastula und Dotterhacken für alle Embryonen wiederholen und die Schale dann 30 Minuten ungestört lassen, während sich die Embryonen erholen. Verwenden Sie dann eine Glaspipette, um die Embryonen auf die zuvor vorbereitete 35-Millimeter-Glasschale mit frischer Ringer-Lösung zu übertragen und in einen 28,5 Grad Celsius-Inkubator zu legen, um eine vollständige Genesung zu ermöglichen, bevor Sie mit der Bildgebung fortfahren. Nach zweistufigem Hacken mit Blastula und Dotter zeigten Embryonen während der gesamten Entwicklungsstadien eine scheinbar normale Gesamtmorphologie im Vergleich zu den Kontrollembryonen, mit anderen Als Größenunterschieden.
Auf der anderen Seite zeigten blastula-only gehackte Embryonen eine eigenartige Morphologie, vor allem in früheren Stadien. Während der Epiboly hatten die Embryonen ein verengtes und eingerücktes Aussehen. In der folgenden Phase wurden Mittellinienstrukturen auf vielen axialen Ebenen abgeflacht.
In späteren Stadien zeigten die an das Eigelb angrenzenden Körperstrukturen, wie das Mittel- und das Hinterhirn, noch eine relativ abgeflachte Form, möglicherweise aufgrund erhöhter Spannung durch das relativ größere Eigelb. Die Zeitraffer-Bildgebung der Soverbildung zeigte, dass sowohl bei der Kontrolle als auch bei gehackten Embryonen die Größen der in späteren Stadien gebildeten Mengen im Vergleich zu denen früherer Stadien kleiner waren. Auch in den gesamten Entstehungsstadien hatten gehackte Embryonen kleinere Energien als die in Kontrollembryonen.
Wenn die zweistufige Hacktechnik an Membran-mCherry-injizierten Embryonen durchgeführt wurde, zeigte die Bildgebung ihrer Rückenmarksrücken bei 20 Stunden nach der Befruchtung eine Verringerung der Neuralrohrhöhen aufgrund der Größenreduktion. Zweistufiges Hacken ist sehr wichtig, um kleinere, aber ansonsten normale Embryonen mit hoher Effizienz zu erhalten. Es ist wichtig, daran zu denken, das Eigelb nicht zu hacken, während Zellen aus der Blastula gehackt werden.
Für Eigelb, machen Sie eine winzige Wunde auf sie für den Inhalt zu versickern. Und die Dottermembran wird auf natürliche Weise im richtigen Puffer heilen. Da die gehackten Embryonen schnell zurückgewonnen werden können, können alle Methoden oder Analysen auf normale Embryonen angewendet werden, die nach der Größenreduktionsmethode durchgeführt werden können.
Die Einfachheit und Vielseitigkeit dieser Technik ist sehr mächtig, da jeder diese Technik einführen könnte, um Skalierungsproblem in jedem Gewebe oder Organ in Zebrafischen zu studieren. Wir glauben, dass Forscher mit dieser Technik Skalierungsprobleme in einer Vielzahl von Systemen angehen können, die zuvor unberührt geblieben sind. Wir haben bereits wichtige Entdeckungen in der Skalierung von Sodöhren- und Neuralrohrmustern gemacht.
