Name: large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis
Uploaded: 2015-01-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
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We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

Dieses Protokoll folgt den Tierschutzvorschriften des deutschen und Berliner Landesrecht; Zebrafisch-Handling wurde von der lokalen Behörde für Tierschutz (LAGeSo, Berlin-Brandenburg) überwacht. 1. Gewinnung Zebrafischembryonen für Herz-Extraktion <ol><li> Kreuz Herz Reporter Zebrafisch wie der Tg (myl7: EGFP) twu34 transgenen Linie 9 um Embryonen mit herzspezifischen GFP-Expression zu erhalten. </li><li> Pflegen Sie die Embryonen im Ei Wasser bei 28,5 ° C, bis die gewünschte Embryonalstadium 10,11. Stellen Sie sicher, dass die gesammelten Embryo Bevölkerung ist homogen sowohl genetisch und durch Entwicklungsstadium, um Variationen in der Genexpression zu begrenzen. </li><li> Dechorionate die Embryonen manuell. </li></ol> 2. Dissecting Zebrafisch Embryonale Herz HINWEIS: Bewahren Sie alle Lösungen auf Eis. Wenn möglich, Teamarbeit: eine Person seziert die Herzen der embRYOS während eine andere Person sortiert die Herzen unter dem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Dies ermöglicht die Verarbeitung von mehreren hundert Embryonen in ein paar Stunden. <ol><li> Übertragen ungefähr 100 Embryonen in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Anesthetize die Embryonen mit Tricaine (0,16 mg / ml in E3 Medium). Gehen Sie einmal die Embryonen deutlich narkotisiert (sie nicht schwimmen und Sediment auf den Boden der Röhre, aber ihr Herz noch schlägt). </li><li> Entfernen Sie die Tricaine / E3-Lösung und waschen Sie die Embryonen einmal mit 1 ml L-15/10% FBS-Medium und zu warten auf Eis. HINWEIS: Die L-15/10% FBS-Medium ist wichtig, Organe und Zellen während der gesamten Dissektion Verfahren am Leben zu erhalten, bis die Herzen wurden in RNAlater oder Trizol übertragen. </li><li> 1 ml L-15/10% FBS-Medium zu den Embryonen und Pipette auf und ab 5-8 mal mit einer Runde Spitze für Gel, bis das Eigelb vollständig zerstört. Pipettieren die Embryonen tropfenweise auf die Oberfläche der Lösung, so dass der Tropfen platzen unddie Embryonen werden vorsichtig aufgebrochen. HINWEIS: Wie stark und wie oft die Embryonen müssen nach oben und unten pipettiert werden, hängt vom Entwicklungsstadium des Embryos, dh mehr Pipettieren in späten Stadien (zB bei 56 HPF) benötigt. </li><li> Für die erste Charge von sezierten Embryonen, beurteilen die Integrität der Embryonen und der Anteil der eingeschnittenen Herzen unter einem Stereomikroskop, da einige Herzen können zu den Embryonen befestigt bleiben, wenn sie zu leicht pipettiert. Stellen Sie die Art und Weise der Pipettieren für die nächsten Runden der Präparation entsprechend. HINWEIS: Verwenden Sie Low Retention Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße, die Herzen das Festhalten an dem Kunststoff zu minimieren. </li><li> Tragen Sie die Probe auf ein 100 um-Filter auf einem 50 ml Zentrifugenröhrchen platziert; spülen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml L-15/10% FBS-Medium und wenden diese auf den Filter, um den Verlust der Probe zu minimieren (einige Herzen haften evtl. an den Wänden der Röhre). Den Filter waschen zweimal mit 1 ml L-15/10% FBS. In diesem Schritt werden die Herzen passieren den Filter und werden in der 50 ml-Röhrchen gesammelt. </li><li> Tragen Sie die Durchfluss auf einen 30 um-Filter auf ein 15 ml Zentrifugenröhrchen platziert und spülen Sie den Filter einmal mit 1 ml L-15/10% FBS-Medium. In diesem zweiten Filtrationsschritt werden die Herzen in den Filter zurückgehalten und kleinere Bruch abgewaschen. </li><li> Drehen Sie den Filter auf den Kopf und spülen das Herz aus dem Filter in einem 1% igen beschichtete Petrischale, indem drei aufeinanderfolgenden Waschungen mit 1 ml L-15/10% FBS. </li><li> Manuell trennen GFP-positive Herzen der nichtfluoreszierenden embryonalen Schmutz (zB Augenlinsen) mit einer Pinzette unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop und konzentrieren sie in der Mitte der Schale. Sammeln Sie gemäß Schritt 3. HINWEIS: Wenn die Embryonen sind älter als 24 HPF, sollten die Herzen schlagen werden, was darauf hinweist, dass die Gewebe sind noch physiologisch normal. </li></ol> 3. Isolieren von mRNA aus Dissected Herzen <ol><li> Sammeln, die Herzen in der kleinstmöglichen Volumen (zB 10 ul) und Pipette in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 0,75 ml RNAlater (auf Eis). Stellen Sie sicher, dass keine Herzen bleiben in der Pipettenspitze von unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop betrachten es. </li><li> Alternativ, wenn eine chemische Kapuze ist in unmittelbarer Nähe des Fluoreszenzmikroskops zur Verfügung, übertragen Sie die gesammelten Herzen in Trizol (VORSICHT) unter der chemischen Abzugshaube. Dies umgeht den möglichen Verlust der Herzen Kleben in der Pipettenspitze und auch während der Zentrifugation der Herzen (Schritte 3.4, 3.5 und 3.7). Bündeln die Herzen von mehreren Runden der Isolierung in der gleichen Röhre mit Trizol und gehen Sie direkt zu Schritt 3.8; Das Endvolumen sollte 10% des ursprünglichen Trizol Volumen nicht überschreiten. HINWEIS: Lesen Sie die Trizol Sicherheitsdatenblatt (MSDS) vor dem Gebrauch. Griff Trizolreagenz unter einer Haube und Verschleiß empfohlenen Schutzausrüstung. Kontakt mit Haut, Augen und clothi vermeidenng. Alle Zündquellen entfernen. </li><li> Bündeln die Herzen von mehreren Runden der Isolierung in der gleichen Röhre mit RNAlater (auf Eis), wie die Effizienz der RNA-Isolierung verbessert sich mit der Menge des Gewebes gesammelt. Wenn das Gesamtprobenvolumen 10% des ursprünglichen RNAlater Volumen überschreitet, verwenden Sie ein weiteres Rohr mit 0,75 ml RNAlater für die Lagerung (auf Eis). </li><li> Zentrifugiere die Proben bei 15.700 g 20 min bei 4 ° C, um das Herz zu sedimentieren. </li><li> Unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop, sammeln sorgfältig soviel Überstand wie möglich in einem 1% Agarose-beschichtete Petrischale mit 3 ml L-15/10% FBS-Medium, aber nicht der sedimentierten Herzen in der Unterseite des Zentrifugationsröhrchen stören. Da bis zu 15% der Herzen können im Überstand aufgrund der hohen Viskosität von RNAlater bleiben, rufen sie, wie in Schritt 3.7 beschrieben. </li><li> Unter einer chemischen Abzugshaube, 0,5 ml Trizol an das Rohr, das die sedimentiert Herzen und auf Eis halten. </li><li> Unter dem Fluoreszenz microscope, übertragen die Herzen (von Schritt 3.5) von der 1% Agarose-beschichtete Schale mit dem RNAlater / L-15/10% FBS-Lösung in eine andere 1% Agarose-beschichtete Schale mit 3 ml L-15/10% FBS zu verdünnen aus dem RNAlater. Sammeln Sie die Herzen in der Mitte der Petrischale und übergeben sie in einem kleinen Volumen in das Rohr von sedimentiert Herzen in Trizol unter einer chemischen Abzugshaube. </li><li> Vortex die 1,5-ml-Röhrchen, das die Herzen in Trizol, um die Herzen zu stören und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Unter einer chemischen Abzugshaube, fügen Sie 100 ul Chloroform (VORSICHT), gut mischen und übertragen Sie die Trizol / Chloroform-Lösung in einer 1,5 ml vorge gesponnen PLG Rohr (Zentrifuge 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit vor der Verwendung). Inkubieren für 3 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Lesen Sie die Chloroform MSDS vor dem Gebrauch. Griff Chloroform Reagenz unter einem Abzug und tragen empfohlenen Schutzausrüstung. Kontakt mit Haut, Augen und Kleidung vermeiden. Weg von inkompatiblen halten, wie Metalle, Alkalien. </li><li> Centrifuge die Probe bei 15.700 xg für 15 min bei 4 ° C und übertragen die wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Hinzufügen 5-10 ug Glykogen und 250 ul vorgekühlte (-20 ° C) Isopropanol; gut mischen und Inkubation über Nacht bei -20 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 15.700 · g für 30 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 75% Ethanol, Zentrifuge bei 15.700 · g für 15 Minuten bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. </li><li> Lassen Sie das Ethanol verdampft durch Trocknen der Pellets bei Raumtemperatur, bis es weiß wird (zB für 10-15 min). </li><li> Mit 20 &amp; mgr; l RNase-freies ddH 2 O zu dem Pellet und Inkubation für 10-15 Minuten bei 55 ° C, um die RNA zu lösen; dann auf Eis zu halten. </li><li> Beurteilen Sie die RNA-Konzentration und Reinheit durch Absorptionsmessung. Beurteilen Sie die RNA-Integrität, indem Sie die Probe auf einem 1% igen Agarosegel. </li></ol>

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	<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo.">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li><li>Chen, J. 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S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll ermöglicht die rasche Anreicherung von Zebrafisch embryonalen Herzgewebe für Genexpressionsanalysen. Die Quantität und Qualität der herzspezifischen RNA-Probe hängt stark von einigen wenigen entscheidenden Schritte: Zunächst wird die Menge der Probe stark verbessert, wenn Verlust der Herzen wird bei jedem Schritt des Protokolls verhindert, da RNA-Reinigung wird nur bei ausreichender arbeiten Ausgangsmaterial. Zweitens ist die Reinheit der Probe, die vollständig auf der Experimentator abhängt, wi...

Zebrafisch (Danio rerio) ist weit verbreitet in der Entwicklungsbiologie zur Organogenese in vivo zu untersuchen, durch die schnelle, transparente und extrauterine embryonalen Entwicklung, verbunden mit geringen Größe und der Verfügbarkeit von transgenen Reporter Linien mit gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Proteinen. Dieses kleine Wirbeltiere ist besonders gut geeignet, um Herzentwicklung zu studieren, weil die Sauerstoffversorgung des frühen Zebrafischembryo nicht von Herzschlag und Blutfluss verlassen; Diese Eigenschaften haben die Charakterisierung einer großen Anzahl von kardiovaskulären Mutanten 1,2 erlaubt und der Zebrafisch ist nun eine anerkannte Modellorganismus an Herzkrankheiten 3 untersuchen. Die Genexpression während der Embryonalentwicklung zu untersuchen, werden Transkripte häufig von ganz-mount in situ Hybridisierung (WISH) 4 analysiert, RT-qPCR 5, Microarrays 6 oder Next Generation Sequencing (RNA-Seq) 7. WährendWISH ermöglicht eine räumlich-zeitliche Analyse der Genexpression im gesamten Embryo werden Transkriptniveaus üblicherweise durch RT-qPCR, Mikroarrays oder RNA-Seq Ansätze beurteilt. Allerdings erfordern diese Verfahren Gewebe Bereicherung für spezifische Gene Expression Profiling. Da der Zebrafisch embryonalen Herzen einen kleinen Teil des gesamten Embryo, Transkriptom-Studien während der Herzentwicklung erfordern ein Protokoll für die Präparation und Anreicherung von Herzen. Darüber hinaus, um physiologisch relevante Daten zu erhalten, ist es wichtig, das Herzgewebe voll funktionsfähig, bis die RNA-Extraktion zu erhalten. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung schnell physiologisch normal und schlagenden Herzen von Hunderten von Zebrafischembryonen, qualitativ hochwertige RNA-Proben effizient zu erhalten für weitere Analysen. Das vorliegende Verfahren basiert auf dem Protokoll, das von Burns und MacRae 2006 8 ausgewiesen ist. Zur Anreicherung von Herzgewebe, beide Methoden verwenden eine transgene myokardialen Reporter Linienund profitieren Sie von den differentiellen Hafteigenschaften der Zebrafisch embryonalen Herzen gegenüber anderen Geweben. Kurz gesagt, durch Pipettieren viele Embryonen nach oben und unten durch einen schmalen Pipettenspitze, Herzen gleichzeitig von embryonalen Körper freigesetzt und anschließend aus embryonalen Ablagerungen in zwei schnelle Filtrationsschritte voneinander getrennt sind; fluoreszenzmarkierte Herzen werden dann manuell von den restlichen Verunreinigungen sortiert und für die weitere Verarbeitung gesammelt.

<table><tbody><tr><td>Equipment for raising fish and collecting eggs&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>see the Zebrafish Book&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt; for details</td></tr><tr><td>Fluorescence stereomicroscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Spectrophotometer</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Thermo Scientific Nanodrop 2000</td></tr><tr><td>Nucleic acid electrophoresis chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes 4 cm &amp;Oslash;, coated with 1% agarose in E3 medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml centrifugation tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml and 50 ml centrifugation tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pair of Dumont #5 forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExactaCruz&amp;trade; Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200&amp;mu;l&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-201732</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;mu;m filter (Pre-Separation Filters-30 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes&amp;nbsp;</td><td>Prime</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Egg water medium</td><td></td><td></td><td>60 &amp;mu;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue</td></tr><tr><td>E3 medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7</td></tr><tr><td>1% agarose (in E3 medium)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% agarose gel (in TBE buffer)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;acute;s L-15 medium&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>1559606</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td>20 &amp;micro;g/&amp;micro;l in RNase-free water</td></tr><tr><td>chloroform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% ethanol (in DEPC-ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleic acid loading buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis

Der Zebrafisch embryonalen Herzens wird von nur wenigen hundert Zellen bestehen, nur einen geringen Bruchteil des gesamten Embryos. Deshalb, um die Herz Transkriptom nicht durch die globale embryonale Transkriptom maskiert zu verhindern, ist es notwendig, eine ausreichende Zahl von Herzen für weitere Analysen zu sammeln. Darüber hinaus, wie Zebrafisch-Herz-Entwicklung schreitet schnell voran, Herz Sammlung und RNA-Extraktionsmethoden müssen schnell sein, um die Homogenität der Proben zu gewährleisten. Hier präsentieren wir eine schnelle manuelle Dissektion Protokoll zum Sammeln Funktions / schlagenden Herzen von Zebrafischembryonen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die nachfolgende herzspezifischen RNA-Extraktion zur herzspezifischen Genexpression bestimmen, durch Transkriptom-Analysen, wie die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Das Verfahren basiert auf Differentialhafteigenschaften des Zebrafisch embryonalen Herzens im Vergleich zu anderen Geweben beruhen; Dies ermöglicht eine schnelle physical Trennung von Herzgewebe aus extra durch eine Kombination von Fluidscherkraft Unterbrechungen schrittweise Filtration und manuelle Sammlung von transgenen fluoreszierend markierten Herzen.

Hier beschreiben wir einen repräsentativen Herz Dissektion Experiment unter Verwendung des Zebrafisch-Tg (myl7: GFP) twu34 transgenen Linie 9, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) drückt ausschließlich im Myokard (Abb. 1). Wir sammelten sowohl die zergliederten Herzen und den Embryonen von denen sie abgeleitet wurden, um die Reinheit des Herzens Probe zu beurteilen. Kurz gesagt, die homozygot Tg (myl7: GFP) wurden twu34 Zebrafisch 9 mit dem...

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Herzgenexpressionsprofile bei Zebrafisch Herzentwicklung zu analysieren, wurde Gesamt-RNA aus isolierten Herzen gewonnen werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Sammeln von Funktions / klopfenden Herzen durch schnelle manuelle Dissektion von Zebrafischembryonen zu herzspezifischen mRNA zu erhalten.

Großzebrafisch Embryonale Herz Dissection für Transkriptionsanalyse

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

large-scale-zebrafish-embryonic-heart-dissection-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.4K Aufrufe.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine.  Herzgenexpressionsprofile bei Zebrafisch Herzentwicklung zu analysieren, wurde Gesamt-RNA aus isolierten Herzen gewonnen werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Sammeln von Funktions / klopfenden Herzen durch schnelle manuelle Dissektion von Zebrafischembryonen zu herzspezifischen mRNA zu erhalten. 

Serie: Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

Dissection von Larval Zebrabärbling Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to reliably detect segmental mechanics and are not readily feasible in zebrafish. Here we present a semiautomated, open-source method for the quantitative assessment of four-dimensional (4D) segmental cardiac function: displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND). Transgenic embryonic zebrafish were imaged in vivo using a light-sheet fluorescence microscopy system with 4D cardiac motion synchronization. Acquired 3D digital hearts were reconstructed at end-systole and end-diastole, and the ventricle was manually segmented into binary datasets. Then, the heart was reoriented and isotropically resampled along the true short axis, and the ventricle was evenly divided into eight portions (I&#8211;VIII) along the short axis. Due to the different resampling planes and matrices at end-systole and end-diastole, a transformation matrix was applied for image registration to restore the original spatial relationship between the resampled systolic and diastolic image matrices. After image registration, the displacement vector of each segment from end-systole to end-diastole was calculated based on the displacement of mass centroids in three dimensions (3D). DIAMOND shows that basal myocardial segments adjacent to the atrioventricular canal undergo the highest mechanical deformation and are the most susceptible to doxorubicin-induced cardiac injury. Overall, DIAMOND provides novel insights into segmental cardiac mechanics in zebrafish embryos beyond traditional ejection fraction (EF) under both physiological and pathological conditions.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation DIAMOND Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

The goal of this protocol is to detail a novel method for the assessment of segmental cardiac function in embryonic zebrafish under both physiological and pathological conditions.

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to ...

Design and Microinjection of Morpholino Antisense Oligonucleotides and mRNA into Zebrafish Embryos to Elucidate Specific Gene Function in Heart Development

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression. Morpholinos (MOs) have the advantage in biological stability over DNA oligos because they are not susceptible to enzymatic degradation. For optimal effectiveness, MOs are injected into 1-4 cell stage embryos. The temporal efficacy of knockdown is variable, but MOs are believed to lose their effects due to dilution eventually. Morpholino dilution and injection amount should be closely controlled to minimize the occurrence of off-target effects while maintaining on-target efficacy. Additional complementary tools, such as CRISPR/Cas9 should be performed against the target gene of interest to generate mutant lines and to confirm the morphant phenotype with these lines. This article will demonstrate how to design, prepare, and microinject a translation-blocking morpholino against hand2 into the yolk of 1-4 cell stage zebrafish embryos to knockdown hand2 function and rescue these "morphants" by co-injection of mRNA encoding the corresponding cDNA. Subsequently, the efficacy of the morpholino microinjections is assessed by first verifying the presence of morpholino in the yolk (co-injected with phenol red) and then by phenotypic analysis. Moreover, cardiac functional analysis to test for knockdown efficacy will be discussed. Finally, assessing the effect of morpholino-induced blockage of gene translation via western blotting will be explained.

The present protocol describes designing, preparing, and microinjecting a translational-blocking morpholino against a representative cardiac gene; Heart And Neural Crest Derivatives Expressed2 (hand2) into the yolk of newly fertilized zebrafish embryos to knock down gene function. It also shows a transient rescue of these "morphants" by co-injection of mRNA encoding this gene product.

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression.  ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Biotechnik

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Biologie

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.

Lichtblattmikroskopie der schnellen Herzdynamik in Zebrafischembryonen

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid ...

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological phenomena. Zebrafish have been used as an effective genetic model to study numerous questions related to heritable disease, development, and toxicology at the whole-organ and -organism level. Due to the well-annotated and mapped zebrafish genome, numerous tools for gene editing have been developed. However, the efficacy of generating and ease of detecting precise knock-in edits using CRISPR is a limiting factor. Described here is a CRISPR-Cas9-based knock-in approach with the simple detection of precise edits in a gene responsible for cardiac repolarization and associated with the electrical disorder, Long QT Syndrome (LQTS). This two-single-guide RNA (sgRNA) approach excises and replaces the target sequence and links a genetically encoded reporter gene. The utility of this approach is demonstrated by describing non-invasive phenotypic measurements of cardiac electrical function in wild-type and gene-edited zebrafish larvae. This approach enables the efficient study of disease-associated variants in a whole organism. Furthermore, this strategy offers possibilities for the insertion of exogenous sequences of choice, such as reporter genes, orthologs, or gene editors.

This protocol describes an approach to facilitate precise knock-in edits in zebrafish embryos using CRISPR-Cas9 technology. A phenotyping pipeline is presented to demonstrate the applicability of these techniques to model a Long QT Syndrome-associated gene variant.

CRISPR-Cas9-vermittelte präzise Knock-In-Bearbeitungen in Zebrafischherzen

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...