We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

Dieses Protokoll folgt den Tierschutzvorschriften des deutschen und Berliner Landesrecht; Zebrafisch-Handling wurde von der lokalen Behörde für Tierschutz (LAGeSo, Berlin-Brandenburg) überwacht. 1. Gewinnung Zebrafischembryonen für Herz-Extraktion <ol><li> Kreuz Herz Reporter Zebrafisch wie der Tg (myl7: EGFP) twu34 transgenen Linie 9 um Embryonen mit herzspezifischen GFP-Expression zu erhalten. </li><li> Pflegen Sie die Embryonen im Ei Wasser bei 28,5 ° C, bis die gewünschte Embryonalstadium 10,11. Stellen Sie sicher, dass die gesammelten Embryo Bevölkerung ist homogen sowohl genetisch und durch Entwicklungsstadium, um Variationen in der Genexpression zu begrenzen. </li><li> Dechorionate die Embryonen manuell. </li></ol> 2. Dissecting Zebrafisch Embryonale Herz HINWEIS: Bewahren Sie alle Lösungen auf Eis. Wenn möglich, Teamarbeit: eine Person seziert die Herzen der embRYOS während eine andere Person sortiert die Herzen unter dem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Dies ermöglicht die Verarbeitung von mehreren hundert Embryonen in ein paar Stunden. <ol><li> Übertragen ungefähr 100 Embryonen in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Anesthetize die Embryonen mit Tricaine (0,16 mg / ml in E3 Medium). Gehen Sie einmal die Embryonen deutlich narkotisiert (sie nicht schwimmen und Sediment auf den Boden der Röhre, aber ihr Herz noch schlägt). </li><li> Entfernen Sie die Tricaine / E3-Lösung und waschen Sie die Embryonen einmal mit 1 ml L-15/10% FBS-Medium und zu warten auf Eis. HINWEIS: Die L-15/10% FBS-Medium ist wichtig, Organe und Zellen während der gesamten Dissektion Verfahren am Leben zu erhalten, bis die Herzen wurden in RNAlater oder Trizol übertragen. </li><li> 1 ml L-15/10% FBS-Medium zu den Embryonen und Pipette auf und ab 5-8 mal mit einer Runde Spitze für Gel, bis das Eigelb vollständig zerstört. Pipettieren die Embryonen tropfenweise auf die Oberfläche der Lösung, so dass der Tropfen platzen unddie Embryonen werden vorsichtig aufgebrochen. HINWEIS: Wie stark und wie oft die Embryonen müssen nach oben und unten pipettiert werden, hängt vom Entwicklungsstadium des Embryos, dh mehr Pipettieren in späten Stadien (zB bei 56 HPF) benötigt. </li><li> Für die erste Charge von sezierten Embryonen, beurteilen die Integrität der Embryonen und der Anteil der eingeschnittenen Herzen unter einem Stereomikroskop, da einige Herzen können zu den Embryonen befestigt bleiben, wenn sie zu leicht pipettiert. Stellen Sie die Art und Weise der Pipettieren für die nächsten Runden der Präparation entsprechend. HINWEIS: Verwenden Sie Low Retention Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße, die Herzen das Festhalten an dem Kunststoff zu minimieren. </li><li> Tragen Sie die Probe auf ein 100 um-Filter auf einem 50 ml Zentrifugenröhrchen platziert; spülen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml L-15/10% FBS-Medium und wenden diese auf den Filter, um den Verlust der Probe zu minimieren (einige Herzen haften evtl. an den Wänden der Röhre). Den Filter waschen zweimal mit 1 ml L-15/10% FBS. In diesem Schritt werden die Herzen passieren den Filter und werden in der 50 ml-Röhrchen gesammelt. </li><li> Tragen Sie die Durchfluss auf einen 30 um-Filter auf ein 15 ml Zentrifugenröhrchen platziert und spülen Sie den Filter einmal mit 1 ml L-15/10% FBS-Medium. In diesem zweiten Filtrationsschritt werden die Herzen in den Filter zurückgehalten und kleinere Bruch abgewaschen. </li><li> Drehen Sie den Filter auf den Kopf und spülen das Herz aus dem Filter in einem 1% igen beschichtete Petrischale, indem drei aufeinanderfolgenden Waschungen mit 1 ml L-15/10% FBS. </li><li> Manuell trennen GFP-positive Herzen der nichtfluoreszierenden embryonalen Schmutz (zB Augenlinsen) mit einer Pinzette unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop und konzentrieren sie in der Mitte der Schale. Sammeln Sie gemäß Schritt 3. HINWEIS: Wenn die Embryonen sind älter als 24 HPF, sollten die Herzen schlagen werden, was darauf hinweist, dass die Gewebe sind noch physiologisch normal. </li></ol> 3. Isolieren von mRNA aus Dissected Herzen <ol><li> Sammeln, die Herzen in der kleinstmöglichen Volumen (zB 10 ul) und Pipette in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 0,75 ml RNAlater (auf Eis). Stellen Sie sicher, dass keine Herzen bleiben in der Pipettenspitze von unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop betrachten es. </li><li> Alternativ, wenn eine chemische Kapuze ist in unmittelbarer Nähe des Fluoreszenzmikroskops zur Verfügung, übertragen Sie die gesammelten Herzen in Trizol (VORSICHT) unter der chemischen Abzugshaube. Dies umgeht den möglichen Verlust der Herzen Kleben in der Pipettenspitze und auch während der Zentrifugation der Herzen (Schritte 3.4, 3.5 und 3.7). Bündeln die Herzen von mehreren Runden der Isolierung in der gleichen Röhre mit Trizol und gehen Sie direkt zu Schritt 3.8; Das Endvolumen sollte 10% des ursprünglichen Trizol Volumen nicht überschreiten. HINWEIS: Lesen Sie die Trizol Sicherheitsdatenblatt (MSDS) vor dem Gebrauch. Griff Trizolreagenz unter einer Haube und Verschleiß empfohlenen Schutzausrüstung. Kontakt mit Haut, Augen und clothi vermeidenng. Alle Zündquellen entfernen. </li><li> Bündeln die Herzen von mehreren Runden der Isolierung in der gleichen Röhre mit RNAlater (auf Eis), wie die Effizienz der RNA-Isolierung verbessert sich mit der Menge des Gewebes gesammelt. Wenn das Gesamtprobenvolumen 10% des ursprünglichen RNAlater Volumen überschreitet, verwenden Sie ein weiteres Rohr mit 0,75 ml RNAlater für die Lagerung (auf Eis). </li><li> Zentrifugiere die Proben bei 15.700 g 20 min bei 4 ° C, um das Herz zu sedimentieren. </li><li> Unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop, sammeln sorgfältig soviel Überstand wie möglich in einem 1% Agarose-beschichtete Petrischale mit 3 ml L-15/10% FBS-Medium, aber nicht der sedimentierten Herzen in der Unterseite des Zentrifugationsröhrchen stören. Da bis zu 15% der Herzen können im Überstand aufgrund der hohen Viskosität von RNAlater bleiben, rufen sie, wie in Schritt 3.7 beschrieben. </li><li> Unter einer chemischen Abzugshaube, 0,5 ml Trizol an das Rohr, das die sedimentiert Herzen und auf Eis halten. </li><li> Unter dem Fluoreszenz microscope, übertragen die Herzen (von Schritt 3.5) von der 1% Agarose-beschichtete Schale mit dem RNAlater / L-15/10% FBS-Lösung in eine andere 1% Agarose-beschichtete Schale mit 3 ml L-15/10% FBS zu verdünnen aus dem RNAlater. Sammeln Sie die Herzen in der Mitte der Petrischale und übergeben sie in einem kleinen Volumen in das Rohr von sedimentiert Herzen in Trizol unter einer chemischen Abzugshaube. </li><li> Vortex die 1,5-ml-Röhrchen, das die Herzen in Trizol, um die Herzen zu stören und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Unter einer chemischen Abzugshaube, fügen Sie 100 ul Chloroform (VORSICHT), gut mischen und übertragen Sie die Trizol / Chloroform-Lösung in einer 1,5 ml vorge gesponnen PLG Rohr (Zentrifuge 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit vor der Verwendung). Inkubieren für 3 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Lesen Sie die Chloroform MSDS vor dem Gebrauch. Griff Chloroform Reagenz unter einem Abzug und tragen empfohlenen Schutzausrüstung. Kontakt mit Haut, Augen und Kleidung vermeiden. Weg von inkompatiblen halten, wie Metalle, Alkalien. </li><li> Centrifuge die Probe bei 15.700 xg für 15 min bei 4 ° C und übertragen die wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Hinzufügen 5-10 ug Glykogen und 250 ul vorgekühlte (-20 ° C) Isopropanol; gut mischen und Inkubation über Nacht bei -20 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 15.700 · g für 30 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 75% Ethanol, Zentrifuge bei 15.700 · g für 15 Minuten bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. </li><li> Lassen Sie das Ethanol verdampft durch Trocknen der Pellets bei Raumtemperatur, bis es weiß wird (zB für 10-15 min). </li><li> Mit 20 &amp; mgr; l RNase-freies ddH 2 O zu dem Pellet und Inkubation für 10-15 Minuten bei 55 ° C, um die RNA zu lösen; dann auf Eis zu halten. </li><li> Beurteilen Sie die RNA-Konzentration und Reinheit durch Absorptionsmessung. Beurteilen Sie die RNA-Integrität, indem Sie die Probe auf einem 1% igen Agarosegel. </li></ol>

<ol>
	<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo.">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li><li>Chen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+cardiovascular+system+and+other+internal+organs+in+zebrafish.">Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish.</a> Development. 123, 293-302 (1996).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends Genet. 10, 73-74 (1994).</li><li>Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+real+time+quantitative+RT-PCR.">A novel method for real time quantitative RT-PCR.</a> Genome Res. 6, 995-1001 (1996).</li><li>Epstein, C. B., Butow, R. 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J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Brownlie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+embryonic+globin+genes+of+the+zebrafish.">Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish.</a> Dev Biol. 255, 48-61 (2003).</li><li>Marvin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+patterns+of+the+zebrafish+small+heat+shock+proteins.">Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins.</a> Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).</li><li>Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll ermöglicht die rasche Anreicherung von Zebrafisch embryonalen Herzgewebe für Genexpressionsanalysen. Die Quantität und Qualität der herzspezifischen RNA-Probe hängt stark von einigen wenigen entscheidenden Schritte: Zunächst wird die Menge der Probe stark verbessert, wenn Verlust der Herzen wird bei jedem Schritt des Protokolls verhindert, da RNA-Reinigung wird nur bei ausreichender arbeiten Ausgangsmaterial. Zweitens ist die Reinheit der Probe, die vollständig auf der Experimentator abhängt, wi...

Zebrafisch (Danio rerio) ist weit verbreitet in der Entwicklungsbiologie zur Organogenese in vivo zu untersuchen, durch die schnelle, transparente und extrauterine embryonalen Entwicklung, verbunden mit geringen Größe und der Verfügbarkeit von transgenen Reporter Linien mit gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Proteinen. Dieses kleine Wirbeltiere ist besonders gut geeignet, um Herzentwicklung zu studieren, weil die Sauerstoffversorgung des frühen Zebrafischembryo nicht von Herzschlag und Blutfluss verlassen; Diese Eigenschaften haben die Charakterisierung einer großen Anzahl von kardiovaskulären Mutanten 1,2 erlaubt und der Zebrafisch ist nun eine anerkannte Modellorganismus an Herzkrankheiten 3 untersuchen. Die Genexpression während der Embryonalentwicklung zu untersuchen, werden Transkripte häufig von ganz-mount in situ Hybridisierung (WISH) 4 analysiert, RT-qPCR 5, Microarrays 6 oder Next Generation Sequencing (RNA-Seq) 7. WährendWISH ermöglicht eine räumlich-zeitliche Analyse der Genexpression im gesamten Embryo werden Transkriptniveaus üblicherweise durch RT-qPCR, Mikroarrays oder RNA-Seq Ansätze beurteilt. Allerdings erfordern diese Verfahren Gewebe Bereicherung für spezifische Gene Expression Profiling. Da der Zebrafisch embryonalen Herzen einen kleinen Teil des gesamten Embryo, Transkriptom-Studien während der Herzentwicklung erfordern ein Protokoll für die Präparation und Anreicherung von Herzen. Darüber hinaus, um physiologisch relevante Daten zu erhalten, ist es wichtig, das Herzgewebe voll funktionsfähig, bis die RNA-Extraktion zu erhalten. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung schnell physiologisch normal und schlagenden Herzen von Hunderten von Zebrafischembryonen, qualitativ hochwertige RNA-Proben effizient zu erhalten für weitere Analysen. Das vorliegende Verfahren basiert auf dem Protokoll, das von Burns und MacRae 2006 8 ausgewiesen ist. Zur Anreicherung von Herzgewebe, beide Methoden verwenden eine transgene myokardialen Reporter Linienund profitieren Sie von den differentiellen Hafteigenschaften der Zebrafisch embryonalen Herzen gegenüber anderen Geweben. Kurz gesagt, durch Pipettieren viele Embryonen nach oben und unten durch einen schmalen Pipettenspitze, Herzen gleichzeitig von embryonalen Körper freigesetzt und anschließend aus embryonalen Ablagerungen in zwei schnelle Filtrationsschritte voneinander getrennt sind; fluoreszenzmarkierte Herzen werden dann manuell von den restlichen Verunreinigungen sortiert und für die weitere Verarbeitung gesammelt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment for raising fish and collecting eggs&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see the Zebrafish Book11 for details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid electrophoresis chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dishes 4cm &#216;, coated with 1% agarose in E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,5ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15ml and 50ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pair of Dumont #5 forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ExactaCruz&#8482; Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200&#956;l&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-201732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 &#956;m filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 &#956;m filter (Pre-Separation Filters-30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes&#160;</td>
			<td>Prime</td>
			<td>2302810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Egg water medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60&#956;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E3 medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose (in E3 medium)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose gel (in TBE buffer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#180;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAlater</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>1559606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td>20 &#181;g/&#181;L in RNase-free water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >75% ethanol (in DEPC-ddH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid loading buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis

Der Zebrafisch embryonalen Herzens wird von nur wenigen hundert Zellen bestehen, nur einen geringen Bruchteil des gesamten Embryos. Deshalb, um die Herz Transkriptom nicht durch die globale embryonale Transkriptom maskiert zu verhindern, ist es notwendig, eine ausreichende Zahl von Herzen für weitere Analysen zu sammeln. Darüber hinaus, wie Zebrafisch-Herz-Entwicklung schreitet schnell voran, Herz Sammlung und RNA-Extraktionsmethoden müssen schnell sein, um die Homogenität der Proben zu gewährleisten. Hier präsentieren wir eine schnelle manuelle Dissektion Protokoll zum Sammeln Funktions / schlagenden Herzen von Zebrafischembryonen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die nachfolgende herzspezifischen RNA-Extraktion zur herzspezifischen Genexpression bestimmen, durch Transkriptom-Analysen, wie die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Das Verfahren basiert auf Differentialhafteigenschaften des Zebrafisch embryonalen Herzens im Vergleich zu anderen Geweben beruhen; Dies ermöglicht eine schnelle physical Trennung von Herzgewebe aus extra durch eine Kombination von Fluidscherkraft Unterbrechungen schrittweise Filtration und manuelle Sammlung von transgenen fluoreszierend markierten Herzen.

Hier beschreiben wir einen repräsentativen Herz Dissektion Experiment unter Verwendung des Zebrafisch-Tg (myl7: GFP) twu34 transgenen Linie 9, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) drückt ausschließlich im Myokard (Abb. 1). Wir sammelten sowohl die zergliederten Herzen und den Embryonen von denen sie abgeleitet wurden, um die Reinheit des Herzens Probe zu beurteilen. Kurz gesagt, die homozygot Tg (myl7: GFP) wurden twu34 Zebrafisch 9 mit dem...

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Herzgenexpressionsprofile bei Zebrafisch Herzentwicklung zu analysieren, wurde Gesamt-RNA aus isolierten Herzen gewonnen werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Sammeln von Funktions / klopfenden Herzen durch schnelle manuelle Dissektion von Zebrafischembryonen zu herzspezifischen mRNA zu erhalten.

Großzebrafisch Embryonale Herz Dissection für Transkriptionsanalyse

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.3K Aufrufe.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine.  Herzgenexpressionsprofile bei Zebrafisch Herzentwicklung zu analysieren, wurde Gesamt-RNA aus isolierten Herzen gewonnen werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Sammeln von Funktions / klopfenden Herzen durch schnelle manuelle Dissektion von Zebrafischembryonen zu herzspezifischen mRNA zu erhalten. 

Serie: Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously applied large scale EM to human skin pancreatic islets, tissue culture and whole zebrafish larvae1-7. Here we describe a universally applicable method for tissue-scale scanning EM for unbiased detection of sub-cellular and molecular features. Nanotomy was applied to investigate the healthy and a neurodegenerative zebrafish brain. Our method is based on standardized EM sample preparation protocols: Fixation with glutaraldehyde and osmium, followed by epoxy-resin embedding, ultrathin sectioning and mounting of ultrathin-sections on one-hole grids, followed by post staining with uranyl and lead. Large-scale 2D EM mosaic images are acquired using a scanning EM connected to an external large area scan generator using scanning transmission EM (STEM). Large scale EM images are typically ~ 5 - 50 G pixels in size, and best viewed using zoomable HTML files, which can be opened in any web browser, similar to online geographical HTML maps. This method can be applied to (human) tissue, cross sections of whole animals as well as tissue culture1-5. Here, zebrafish brains were analyzed in a non-invasive neuronal ablation model. We visualize within a single dataset tissue, cellular and subcellular changes which can be quantified in various cell types including neurons and microglia, the brain&#39;s macrophages. In addition, nanotomy facilitates the correlation of EM with light microscopy (CLEM)8 on the same tissue, as large surface areas previously imaged using fluorescent microscopy, can subsequently be subjected to large area EM, resulting in the nano-anatomy (nanotomy) of tissues. In all, nanotomy allows unbiased detection of features at EM level in a tissue-wide quantifiable manner.

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.

Großflächige Raster-Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Nanotomy) gesunder und verletzter cerebra-

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

Dissection von Larval Zebrabärbling Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

Nanopartikel-vermittelten SiRNA Gen-silencing in Erwachsenen Zebrafisch-Herz

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...