Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

Unser Protokoll bietet eine einfache Methode für die 3D-Zellkultur und ist für die nachgelagerte Analyse sehr gut geeignet. Dies erleichtert die Bewertung heterogener Patientenproben und deren spezifische Wirkstoffreaktionen. Der Vorteil dieser Technik ist, dass Sphäroide aus kleinen Zellnummern gebildet werden können, was sowohl die Konservierung knapper Primärproben als auch ein Screening mit hohem Durchsatz für patientenspezifische Arzneimittelreaktionen ermöglicht.

Das Hängende Tropfenmodell schafft eine physiologische Umgebung mit 3D-Medikamentendiffusion und reagiert entsprechend dem Tumorstadium. Dies ermöglicht die Entwicklung gezielter Therapien und patientenspezifischer Behandlungen. Diese Methode ist ideal für die Untersuchung von Eierstockkrebs, Heterogenität und der Entwicklung von Chemoresistenz.

Jedoch, Es kann auch verwendet werden, um andere Krebsarten und medikamentenresistente Zellpopulationen zu studieren. Bei der Beschichtung von Sphäroiden ist es wichtig, präzise Volumen zu pipette. Dadurch wird die Konsistenz zwischen Sphäroiden sichergestellt.

Die Sphäroide und ihre jeweiligen Tröpfchen sind von Natur aus zerbrechlich und ohne richtige Handhabung leicht verloren, daher zeigen wir, wie man eine hängende Fallplatte entsprechend plattiert, pflegt und analysiert. Demonstriert wird dieses Verfahren von Michael Bregenzer, einem Doktoranden unseres Labors. Beginnen Sie damit, jeden Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte mit vier bis fünf Milliliterautokton-entionisiertem Wasser zu füllen und die hängende Fallplatte zwischen Deckel und Boden der Platte zu verstauen.

Fügen Sie 800 bis 1000 Mikroliter Wasser um den Rand der hängenden Fallplatte hinzu, um eine feuchte Umgebung zu schaffen und die Verdunstung zu minimieren. Als Nächstes sammeln Sie 2D gewachsene Zellen, indem Sie sie mit Trypsin lösen und dann sechs oder acht Milliliter Medium hinzufügen, das FBS enthält. Die Zellen mit der 10 Milliliter serologischen Pipette ansaugen und in einem 15 Milliliter konischen Rohr ablagern.

Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. Bereiten Sie die Zellsuspension nach Manuskriptrichtungen vor und mischen Sie sie vorsichtig mit der Pipette, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. Legen Sie die Spitze der Pipette in einem Winkel von 45 Grad und Pipette 20 Mikroliter Suspension in jedem hängenden Tropfen gut.

Legen Sie den Deckel der Sechs-Well-Platte wieder auf und verwenden Sie einen dehnbaren thermoplastischen Streifen, um die Kanten zu versiegeln. In einem Standard-Kohlendioxid-Befeuchtungsbrutschrank inkubieren und die hängenden Tropfen alle zwei bis drei Tage füttern, indem man jedem sphäroidhaltigen Brunnen zwei bis drei Mikroliter Zellkulturmedium hinzufügt. Um die Proliferation und Lebensfähigkeit der Zellen zu quantifizieren, fügen Sie zwei Mikroliter gefilterter Resazurin-basierter Lösung in die Brunnen ein, die für die Proliferationsanalyse bestimmt sind, und inkubieren Sie gemäß Manuskriptrichtung.

Öffnen Sie nach der Inkubationszeit das hängende Tropfen-Sandwich in einem Biosicherheitsschrank und bringen Sie die 384-Wellplatte mit dem Deckel noch an Ort und Stelle zum Plattenleser. Legen Sie es in den Plattenleser und lesen Sie die Platte. Speichern Sie das Experiment im Popupfenster, und exportieren Sie die Daten in eine Kalkulationstabelle.

Geben Sie die Platte wieder auf die Sechs-Brunnen-Basis zurück und legen Sie sie in den Inkubator. Sobald alle Zeitpunkte für den Tag gelesen wurden, versiegeln Sie die Platte vor dem Inkubieren erneut. Um Sphäroide für die Durchflusszytometrieanalyse vorzubereiten, verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um sie aus jedem Brunnen zu sammeln und sie in ein 15 Milliliter konisches Rohr zur Disaggregation zu legen.

Aliquot Zellsuspension in fünf Mikrozentrifugenröhren, so dass jede Röhre mindestens 50.000 Zellen enthält. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 400 mal G für fünf Minuten in einer Mikrozentrifuge, dann aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie Pellets in 100 Mikroliter Aldefluorpuffer wieder auf. Beschriften Sie die Rohre nach Manuskriptanweisungen.

Fügen Sie 0,5 Mikroliter APC-Isotyp-Antikörper in das APC ISO-Rohr und einen Mikroliter CD133-Antikörper in die ALDH CD133-Röhre ein. Dann fügen Sie fünf Mikroliter DEAB-Reagenz und 0,5 Mikroliter ALDH in das DEAB-Rohr und einen Mikroliter ALDH in die ALDH CD133-Röhre. Wirbel alle Rohre für ein paar Sekunden und inkubieren sie bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten.

Nach der Inkubation alle Röhren wieder wirbeln und fünf Minuten lang bei 400 mal G zentrieren. Beschriften Sie FACS-Rohre nach Manuskriptanweisungen und füllen Sie einen isolierten Schaumbehälter mit Eis. Aspirieren Sie den Überstand aus den Mikrozentrifugenrohren.

Dann setzen Sie die ungefärbte Kontrolle in 400 Mikroliter FACS-Puffer und den Rest der Zellen in 400 Mikroliter FACS DAPI Puffer wieder aus. Legen Sie die Rohre auf das Eis, bis sie auf einem Durchflusszytometer analysiert werden können. Verwenden Sie FlowJo, um die Daten aus dem Durchflusszytometer zu analysieren.

Doppelklicken Sie auf die unbefleckte Datei und legen Sie die Y-Achse auf Seitenstreuhöhe oder SSCH oder Die X-Achse auf Streuhöhe oder FSCH nach vorne. Klicken Sie auf die T-Schaltfläche neben jeder Achse, um die Skalierung anzupassen und die Trennung zwischen verschiedenen Zellpopulationen zu maximieren. Klicken Sie als Nächstes auf die Schaltfläche Polygon-Gating, zeichnen Sie Polygon-Gate um die Zellenpopulation und beschriften Sie die Grundgesamtheitszellen.

Doppelklicken Sie auf die Grundgesamtheit der Zelle im Arbeitsbereich, und ändern Sie dann die FSC-Achse in Die FSC-Breite und die SSC-Achse in die FSC-Höhe. Wählen Sie das Rechtecktor aus, um nur ein Rechteck um die linke dichte Grundgesamtheit von Zellen zu zeichnen, die sich über die gesamte Y-Achse erstreckt. Beschriften Sie dieses Gate Single Cells.

Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf diese Zellen in das verschachtelte Einzelne Zellen-Gate, und fügen Sie sie unter jedem Beispiel im Arbeitsbereich ein. Doppelklicken Sie auf das Unter das DAPI-Beispiel verschachtelte Tor für einzelne Zellen, um die Einzelzellenpopulation aus diesem Beispielrohr anzuzeigen. Ändern Sie den FSC-Achsenkanal in den DAPI-Bereichskanal, und ändern Sie den SSC-Achsenkanal in Histogramm.

Klicken Sie auf die T-Schaltfläche neben der DAPI-Achse und klicken Sie auf Achse anpassen, um die Skalierung anzupassen und die Trennung zwischen DAPI-positiven und DAPI-negativen Peaks zu maximieren. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Anwenden, und wählen Sie die Schaltfläche Range Gate aus. Verteilen Sie es über die negative DAPI-Spitze und beschriften Sie dieses Gate Live Cells.

Kopieren Sie das Live Cells-Gate und fügen Sie es unter das Einzelzellen-Gate unter den APC ISO DEAB- und ALDH-CD133-Röhren ein, um den gleichen Teil der lebenden Zellen in jeder Röhre auszuwählen. Doppelklicken Sie dann auf die Live Cells-Population, die unter der APC ISO-Beispieldatei verschachtelt ist, und wechseln Sie die X-Achse in den ALDH-Bereich und die Y-Achse in den APC-Bereich. Wenden Sie Quadrant Gate an und passen Sie den Schnittpunkt des Tores an, so dass etwa 0,5 % der Bevölkerung in der oberen linken Ecke des Plotfensters liegen.

Benennen Sie dann die Quadranten wie gewünscht, kopieren Sie dann die Quadrantentore und fügen Sie sie auf die unter der DEAB-Datei verschachtelte Grundgesamtheit der lebenden Zellen ein, und passen Sie die vertikale Linie so an, dass etwa 0,15 % der Zellpopulation innerhalb des ALDH-positiven Quadranten liegen. Kopieren sie schließlich die Quadrantentore in die ALDH CD133-Dateien Live Cells Population und Bewertung KrebsStammzellproportionen basierend auf ALDH und CD133 Proportionen. Dieses Protokoll kann für die Analyse von Krebsstammzellen mit hohem Durchsatz verwendet werden.

So wenig wie 10 Zellen pro Brunnen können zuverlässige Sphäroide bilden und wenn sich die Zellen vermehren, dehnen sich die Sphäroide in der Größe aus. Die Proliferationsfähigkeit kann leicht mit einem auf Resazurin basierenden Blütenstand-Assay quantifiziert werden. Die Wirkung von Medikamenten auf die Sphäroidmorphologie kann mit Phasenkontrastbildgebung visualisiert und durch den Vergleich der Resazurinblütenin in unbehandelten und behandelten Zellen quantifiziert werden.

Der Zelltod kann durch Zugabe von Calcein-AM und Ethidium Homodimer I zu Sphäroiden validiert werden, gefolgt von einer Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop. Schließlich können Sphäroide geerntet und in eine einzelne Zellsuspension zur Analyse mit Durchflusszytometrie dispergiert werden, was es ermöglicht, die Wirksamkeit verschiedener medikamentöser Behandlungen an bestimmten Zellpopulationen zu erkennen. Um Tröpfchenverlust, mittlere Verdunstung und Variation der Sphäroidgröße zu vermeiden, ist es wichtig, Ihre Platten sorgfältig zu handhaben, Pipette mit Präzision und vollständig versiegeln Sie Ihre hängenden Fallplatten.

Zur Bewertung von Veränderungen der Genexpression und der löslichen Signalisierung durch medikamentöse Behandlung können einzellige RNA-Sequenzierungen und enzymgebundene Immunsorbent-Assays verwendet werden, um die Entwicklung von Therapeutika zu erleichtern. Diese Technik ermöglicht es Forschungen in der Onkologie, Präzisionsmedizin und Arzneimittelentwicklung, die Intra- und Interpatientenheterogenität sowie die Chemoresistenz durch das Arzneimittelscreening kleiner Biopsien mit hohem Durchsatz zu erforschen. Achten Sie bei der Durchführung dieses Protokolls darauf, alle standardmäßigen persönlichen Schutzausrüstungen zu tragen.

Inklusive Handschuhen, Schutzbrillen, Labormänteln, Hosen und schuhen.