Unser Protokoll kann weit verbreitet für hohe Durchsatz und schnelle Screening der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darm Mikrobiota verwendet werden. Niedrige Kosten und Vermeidung von Interferenzeffekten aus dem Stoffwechsel des Wirts. Dieses Verfahren hat das Potenzial, bei der Diagnose verwendet zu werden.
Lösen Sie zunächst BIF EPS und Stärke einzeln in heißem Wasser auf einem magnetischen Rührer, um sowohl die Konzentration von acht Gramm pro Liter zu machen. Fügen Sie im vorbereiteten Basiskulturmedium VI 100 Milliliter der BIF EPS-Lösung hinzu, um Kultur VI BIF-Lösung zu machen. Fügen Sie 100 Milliliter der Stärkelösung hinzu, um eine Stärkelösung für Kultur VI zu machen.
Autoklavieren Sie die beiden Medien mit Kohlenstoffquelle und das Medium ohne Kohlenstoffquelle als Steuerung, bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen und Haymen und Cystein hinzufügen. Übertragen Sie eine Unterprobe von fünf Millilitern jedes Mediums in Kulturröhren.
Und in einem anaeroben Inkubator aufbewahren. Bewahren Sie die restlichen Medien bei vier Grad Celsius auf. Zur Vorbereitung einer menschlichen Fäkalienprobe ein Gramm frischer Fäkalienprobe in 10 Milliliter 0,1 molare anaerobe PBS bei pH-Sieben in einem Glasbecher übertragen.
Dann verwenden Sie eine Glasstange, um es zu rühren, um eine Gülle zu erreichen. In einer anaeroben Kammer 500 Mikroliter der gefilterten Fäkalienschlämme einzeln in die drei vorbereiteten Fermentationsmedien geben. Dann bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Nach 24 Stunden und 48 Stunden zwei Milliliter fermentierte Proben in der anaeroben Kammer sammeln. Und dann Zentrifuge außerhalb der Kammer bei 6000 mal G, für drei Minuten. Übertragen Sie die Überschärfungsmittel sorgfältig auf neue Zentrifugenröhrchen, die für Polysaccharidabbauanalysen und kurzkettige Fettsäuremessungen verwendet werden.
Bewahren Sie die Zentrifugationspellets bei 80 Grad Celsius auf. 0,2 Mikroliter der fermentierten Überstoffe auf jedes vorbeschichtete Kieselgel 60 TLC Aluminiumplatte laden und wirbeln, um sich zu verbreiten. Dann verwenden Sie einen Haartrockner mit heißer Luft zu trocknen.
Ein Ende der beprobten Platten in 20 Milliliter Ameisensäure:n-Butanol:Wasserlösung für einige Minuten eintauchen, bis sich die Elektrophorese fast bis zum anderen Ende erstreckt. Dann nehmen Sie die Teller mit Zange, und trocknen Sie mit einem Fön. Dann die Teller im Orcinol-Reagenz für zwei Minuten einweichen, um zu färben.
Und wieder trocken. Die Teller bei 120 Grad Celsius in einen Backofen geben, um drei Minuten zu erhitzen. Dann fotografieren Sie die Platte, um den Abbau von EPS zu bewerten, indem Sie TLC-Bänder messen.
Um die Auswirkungen von EPS auf die SCFA-Produktion zu untersuchen, fügen Sie einen Milliliter der fermentierten Überstoffe zu zwei Milliliter Zentrifugenröhren hinzu und fügen Sie 0,2 Milliliter von 25 Gewicht/Volumenprozent Metaphosphorsäure zu jeder Probe hinzu. Wirbel, um die Lösungen gründlich zu mischen. Zentrifugieren Sie die Mischungen bei 13.000 mal G für 20 Minuten.
In der Zwischenzeit, bereiten Lösungen von 120 Millimolar Essig, propionischen, butyric, isobutyric, Valeric, und isovalerSäuren in Denröhrchen. Dann fügen Sie einen Milliliter jeder vorbereiteten Säure in ein Rohr mit 1,2 Millilitern von 25 Gewicht/Volumen Prozent Metaphosphorsäure. Und als Standard-Cocktails in die Probenflasche des Gaschromatographie-Instruments laden.
Nehmen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und übertragen Sie die Überräube in frische Schläuche. Verwenden Sie eine Spritze mit 0,22 Mikron Filter, um die Überräube in neue Röhren für die Gaschromatographie-Analyse zu filtern. In dieser Studie wurde die Produktion von Schleimhaut EPS in Bifidobacterium-Longum-Kulturen auf PYG-Platten nach anaeroben Inkubation für 72 Stunden beobachtet.
Die Zentrifugierung von Kulturkratzen, gefolgt von Ethanolfällung und Trocknung, führte zur Sammlung zelluloseähnlicher EPS. Die TLC-Analyse ergab, dass die Abbaurate von Stärke durch humane Fäkalienmikrobiota schneller war als die von BIF EPS. Die Hauptkoordinatenanalyse zeigt Kultur-VI-BIF- und Kultur-VI-Stärkegruppen, die getrennt voneinander gruppiert sind, was darauf hinweist, dass EPS und Stärkeverfügbarkeit menschliche Fäkalienbakteriengemeinschaften differenziell prägen.
Lineare Diskriminantanalyse der Effektgröße zeigt, dass die Gattungen collinsella, coprococcus, Parabacteroides und Rhodopseudomonas in den Kultur-VI-BIF-Proben deutlich häufiger waren als in den Kultur-VI-Stärkeproben. Darüber hinaus zeigen GC-Messungen SCFAs, die aus Fermentationskulturen gemessen wurden, einschließlich Essig-, Propion-, isobutyric-, butyrisch,isovaler und Baldriansäuren. Nach der Gärung für 24 Stunden und 48 Stunden waren fünf der sechs SCFA-Konzentrationen ähnlich und unterschieden sich statistisch nicht zwischen den Gruppen Kultur VI BIF, Kultur VI Stärke und Kultur VI.
Die Proprionsäurekonzentrationen waren jedoch in der Kultur-VI-BIF-Gruppe signifikant höher als in der Stärkegruppe Kultur VI nach 48 Stunden Gärung. Führen Sie dieses Experiment unter anaeroben Bedingungen durch und übertragen Sie die festen Proben dann so schnell wie möglich in einen anaeroben Inkubator. Einige der TLC-Reagenzien sind gefährlich.
Sie sollten vorsichtig sein, sie zu verwenden.
