Diese Technik dient als grundlegende Methode für Experimente, die entwickelt wurden, um die embryonale oder Larvenentwicklung des Cricket zu assayen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie flexibel ist und verschiedene Arten von experimentellen Ansätzen unterstützt, wie z. B. solche, die RNA-Interferenz oder genomische Manipulation nutzen. Demonstriert wird das Verfahren von Hadley Wilson Horch, dem Hauptermittler des Labors.
Um dieses Verfahren zu beginnen, nass die Spinnschleiferebene des Kegels mit tropfendem Wasser. Legen Sie die gezogene Nadel in den Kegel und drehen Sie sie in einen 20-Grad-Winkel. Senken Sie die Nadel, bis sie nur die Schleifplatte berührt und zwei bis drei Minuten abschrägen.
Bewerten Sie die Abschrägung, indem Sie die abgeschrägte Nadel auf ein Doppelklebeband legen, das an einem Glasmikroskopschlitten verklebt wurde. Platzieren Sie das Dia auf der Bühne eines zusammengesetzten Mikroskops, das mit einer Kamera- und Bildaufnahmesoftware ausgestattet ist. Erfassen Sie ein Bild der Nadel mit einem 20-fachen Objektiv.
Verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um den inneren Lumendurchmesser der Nadel zu messen, der nur proximal zur abgeschrägten Öffnung ist. Entsorgen Sie alle Nadeln mit einer Öffnung kleiner als acht Mikrometer oder größer als 12 Mikrometer. Zuerst machen Sie 40 Milliliter 1%Agarose in Wasser und gießen Sie es in eine 10 Zentimeter Petrischale.
Legen Sie einen Eierbrunnenstempel auf die Oberfläche der Agarose, bevor sie erstarrt. Sobald die Agarose verfestigt ist, entfernen Sie den Stempel, um die Brunnen zu offenbaren. Als nächstes füllen Sie die Agarose-Gutplatte mit HBS, die 1%Penicillin-Streptomycin enthält.
Legen Sie den Deckel auf die Schale, wickeln Sie ihn in Parafilm und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius. Danach füllen Sie eine 35 Millimeter Petrischale mit weißem Spielplatzsand, um eine Eiersammelschale für die Grillen zu machen, in die sie Eier legen können. Bedecken Sie die Eierschale mit einem Papiertuch Quadrat geschnitten auf etwa 18 mal 18 Zentimeter.
Mit Leitungswasser durch das Papiertuch füllen. Dann kippen Sie die Petrischale und drücken Sie vorsichtig die Oberseite, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Stecken Sie die Ecken des Papiertuchquadrats unter die Schale und legen Sie die Eierschale in einen umgekehrten Deckel, der hilft, das Papiertuch an Ort und Stelle zu halten.
Legen Sie die Eierschale in den Cricket-Behälter und lassen Sie die erwachsenen Weibchen die Eier für ein bis zwei Stunden oviposit. In der Zwischenzeit lassen Sie die Agarose Schale auf Raumtemperatur zu erwärmen, in Vorbereitung auf das Halten der Eier für die Injektion. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Eiersammelschale, die jetzt frisch gelegte Eier enthält, aus dem Cricket-Behälter.
Entfernen Sie das Papiertuch und legen Sie ein Sieb mit einer Porengröße zwischen 0,5 und einem Millimeter über einem Becher. Spülen Sie den Inhalt der Eilegeschale unter sanft fließendem Leitungswasser in das Sieb. Die Sandkörner fallen durch das Siebnetz in den Becher unten, während die Cricket-Eier im Siebkorb bleiben.
Füllen Sie einen Behälter mit Umkehrosmosewasser und legen Sie ihn in ein Tablett. Das Sieb über den Behälter umkehren und gegen die Schale anzapfen, um die Eier ins Wasser zu entwirn. Die Eier sinken auf den Boden des Behälters.
Als nächstes schneiden Sie die Spitze einer P1000 Pipettenspitze mit einer Schere ab, um eine Öffnung mit einem Durchmesser von etwa drei Millimetern zu erzielen. Legen Sie diese Spitze auf einen P1000 Pipetter, und verwenden Sie ihn, um die Eier aus dem Behälter auf die Agarose-Ei-Formen-Schale zu übertragen. Mit einer Kunststoff-Pinzette die Eier in den Agarosebrunnen aufstellen.
Jedes Ei sinkt auf den Boden eines einzelnen Brunnens. Bedecken Sie die Petrischale mit einem Deckel, bis sie injiziert werden kann. Um zu beginnen, legen Sie die Schale der Eier unter das Sezieren Mikroskop und wählen Sie eine niedrige Vergrößerung von etwa 10x.
Mit 20 Mikroliter Ladespitzen und einer P10-Pipette 1,5 Mikroliter Injektionslösung aufziehen und die Ladespitze in das breite Ende der Injektionsnadel einlegen. Die Injektionslösung in die Injektionsnadel austreiben. Setzen Sie die Nadel in das Injektionsgehäuse ein und ziehen Sie sie fest, um sicherzustellen, dass die Nadel richtig und fest in das Gehäuse eingeführt ist.
Dann legen Sie das Injektionsgehäuse vorsichtig in den Mikromanipulator ein, wobei Sie darauf achten, nicht zu brechen oder durch die Nadel verletzt zu werden. Wenn Sie sowohl die Eier als auch die Nadel durch das Mikroskop betrachten, bewegen Sie die Nadel in der Nähe des X in der oberen linken Ecke des Tellergitters. Senken Sie die Nadel, bis die Spitze in die HBS plus Penicillin Streptomycin gepufferte Lösung in der Schale.
Zentrieren Sie die Nadel im Sichtfeld und bewegen Sie die Eierschale so, dass die Nadel ein paar Millimeter näher am Rand der Schale als die Eier ist. Danach stellen Sie das Mikroskop auf den Filter für Rhodamine, um die Fluoreszenz in der Nadel zu beobachten und sich auf ihre Spitze zu konzentrieren. Drehen Sie den Ausgleichsknopf langsam im Uhrzeigersinn, bis die Injektionslösung aus der Nadel in die Suspensionslösung austritt.
Drehen Sie dann den Knopf gegen den Uhrzeigersinn leicht zurück, bis der Farbstoff einfach nicht mehr aus der Nadel austritt. Mit der Nadel noch im Sichtfeld zentriert, bewegen Sie die Eischale, so dass die Nadel auf das Ei gerichtet ist, um zuerst injiziert werden. Passen Sie die Vergrößerung auf etwa 50x an, so dass ein einzelnes Ei den größten Teil des Sichtfeldes füllt.
Verwenden Sie sowohl den Mikromanipulator als auch die Hand auf der Eierschale, um die Nadel für die Injektion in Position zu bringen. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel zu fördern und legen Sie die Spitze in das erste eizuspritzende Ei ein, und stellen Sie sicher, dass die Nadel bei 20 bis 30% der Eilänge vom hinteren Ende des Eis senkrecht zur langen Achse des Eis eingesetzt wird. Injizieren Sie die Lösung entweder mit dem Injektionsfußpedal oder dem Injektionsknopf am Mikroinjektor.
Ein kleiner Bolus aus fluoreszierendem Material im Ei deutet auf eine erfolgreiche Injektion hin. Danach die Nadel aus dem Ei nehmen. Wenn das Ei beim Zurückziehen der Nadel unbeabsichtigt aus seinem Brunnen gehoben wird, verwenden Sie kleine Zangen, um das Ei beim Zurückziehen der Nadel wieder in den Brunnen zu schieben.
In dieser Studie werden Cricket-Eier mit einer Technik injiziert, die als grundlegende Methode in vielen Experimenten dient, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, RNA-Interferenz und genomische Manipulation. Die Überlebensrate ist ein wichtiger Parameter für die Bewertung des Erfolgs dieses Experiments. Die meisten toten Eier können leicht durch Das Sehen identifiziert werden, da das Eigelb und das embryonale Gewebe im Ei beginnen, ungleichmäßig zu verklumpen, und schließlich wird der größte Teil des Dotters auf eine Seite des Eis wandern.
Nach vier bis sechs Tagen überlebten mehr als 85 % der nicht injizierten Eier, während Eier, die mit experimentellen Reagenzien injiziert wurden, im Allgemeinen eine niedrigere Überlebensrate aufwiesen. Die Kontrolle aller Aspekte der Injektion selbst, einschließlich der Nadelpunktion, der Einführung von Farbstoff und Puffer oder des Vorhandenseins von Fahrzeug- oder Doppelsträngigen-RNA, ist erforderlich, um die wahren Auswirkungen der experimentellen Manipulation zu verstehen. Die Art und Weise, wie man die phänotypischen Ergebnisse der Injektion beurteilt, hängt davon ab, was injiziert wurde.
Zum Beispiel können phänotypische Veränderungen als Folge spezifischer mRNA-Knockdowns auf der Bruttoanatomieebene offensichtlich sein. Wenn andererseits eine cDNA, die ein EGFP-gekennzeichnetes Histon-2B-Gen unter der Kontrolle eines G.bimaculatus Actin-Promotors kodiert, mittels Huckepacktransposase in das Cricket-Genom eingeführt wird, wird es möglich, jeden Kern im Ei mit Fluoreszenz zu visualisieren, um das EGFP-markierte hist 2B-Protein zu erregen. Die Waage so einzustellen, dass die Nadeln nicht verstopfen, ist ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren.
Möglicherweise müssen Sie nach nachfolgenden Injektionen mehrere Anpassungen vornehmen, da Dasgelb manchmal die Nadelspitze verstopft. Die Cricket ist ein hemimetabolous Insekt, das basal zu gut untersuchten holometabolen Insekten wie Drosophila zweigt. Das Studium der Cricket-Entwicklung wird uns helfen, mehr über Evolution und Entwicklung im gesamten Tierreich zu verstehen.
Diese Technik erfordert etwas Übung. Wir empfehlen, Kontrollinjektionen zu praktizieren, bis die Überlebensrate vier oder fünf Tage nach der Injektion mindestens 80% beträgt.
