We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.

Die japanischen Medaka in dieser Studie verwendet wurden, auf humane Weise in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts der Toyo University, unter Berücksichtigung für die Linderung von Not und Beschwerden behandelt. 1. Silbernanokolloide (SNCs) <ol><li> Bestellen Sie gereinigte SNCs (20 mg / L -1, 99,99% Reinheit, Partikel mittlerer Durchmesser etwa 28,4 ± 8,5 nm in destilliertem Wasser suspendiert). </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit und Konzentration des Silbers durch induktiv gekoppelte Plasma - Massenspektrometrie (ICP-MS) analysiert gemäß Betriebsanleitung 8. Das Vorbehandlungsverfahren für ICP-MS-Analysen wird in Abschnitt 7 beschrieben. </li></ol> 2. Herstellung von SNC - Lösungen (Mischungen aus Silber Kolloid- und Ag +) mit unterschiedlichen Salinität <ol><li> Vorbereitung 60 × ERM , bestehend aus 60 g NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g CaCl 2 · 2H 2 O und 9,78 g MgSO 4 · 7H 2 O in 1 l ultrapure Wasser; den pH - Wert auf 7,0 mit 1,25% NaHCO 3 in Reinstwasser einzustellen. </li><li> Rühren Sie die ERM-Lösung bei 25 ° C über Nacht. </li><li> Mix SNCs mit verdünntem ERM. Bereiten Sie 40 ml jeder SNC-ERM Mischlösung. Die Endkonzentration beträgt 10 mg / L -1 SNCs in verschiedenen Konzentrationen von ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x oder 30x). </li><li> Der pH - Wert des SNC-ERM gemischte Lösung auf 7,0 mit 0,625% NaHCO 3 in Reinstwasser. pH - Einstellung ist sehr wichtig , die SNC - Lösung bei der Vorbereitung, da Ag + Freisetzung von sauren Bedingungen erleichtert wird 9. </li><li> Verwenden Sie AgNO 3 als Referenzverbindung für SNCs. <ol><li> Mix AgNO 3 mit verdünnter ERM. Vorbereitung 40 ml AgNO 3 -ERM gemischte Lösung bei einer AgNO &amp; sub3 ; -Konzentration von 15,7 mg / L -1 (10 mg / L -1 Silber) in verschiedenen Konzentrationen von ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x oder 30x) . Hinweis: Um die Silberkolloid Toxizität zu untersuchen, AgNO 3Lösung, die eine Quelle von löslichem Silber ist, wird als eine Referenzverbindung für SNCs verwendet, die eine Mischung aus Silberkolloide und lösliches Silber sind. </li></ol></li></ol> 3. Medaka Kultur und Ei Ernte <ol><li> Beziehen Sie die Medaka (O. latipes) (orange-rot - Stamm) (60 Männer und 60 Frauen). </li><li> Kultur Medaka als Gruppen (20 Männer und 20 Frauen als eine Gruppe) in ERM 1x in 3 L Tanks durch einen Medaka Flow-Through-Kultivierungssystem. <ol><li> Kultur unter den folgenden Bedingungen: pH-Bereich des Kulturmediums: 6,2 bis 6,5 Licht: Dunkel-Zyklus: 16: 8 Stunden Temperatur des Kulturmediums: 24 ± 0,5 ° C osmotischen Druck des Kulturmediums 257 mOsm </li></ol></li><li> Feed - Medaka auf Artemia salina Nauplien um 10:00 Uhr (einmal täglich) und Futtermittel einen künstlichen trockenen Fisch Diät um 09:00 Uhr, 11:00, 13:00, 15:00, und 17.00 Uhr (fünf Mal pro Tag). <ol><li> Erhalten A. salina Nauplien. </li> &lt;li&gt; Bereiten 5 L einer 3,0% igen Salzlösung in einem Kunststoffbecher. </li><li> In 30 g Artemia Eier in die Salzlösung in das Becherglas. </li><li> Inkubiere die Eier bei 25 ° C für 48 Stunden mit sprudelnden (4 l / min -1) eine Belüftungspumpe. </li><li> Nach 48 Stunden, die sprudelnden stoppen. </li><li> Lassen Sie die Lösung stehen für 5 bis 10 min die schraffierten A. zu trennen salina Nauplien (unterer Teil der Lösung) von den nicht geschlüpften Eier und Eierschalen (oberer Teil der Lösung). </li><li> Die obere Schicht der Lösung durch Dekantierung. </li><li> Filtern Sie den unteren Teil der Lösung durch ein Sieb mit Öffnungen von 283 &amp; mgr; m, und sammeln Sie die Nauplien, die mit Öffnungen von 198 &amp; mgr; m auf einem Netz passieren. </li><li> Führen Sie die Nauplien zu den Medaka innerhalb von 6 Stunden. </li></ol></li><li> Nachdem die weiblichen Medaka gelaicht haben, entfernen Sie die externe Ei Cluster sanft aus den Körpern der Frauen oder die Eier aus dem Boden des durch die Verwendung eines sm Fischbehälter sammelnalle netto (netto Größe 5 cm x 5 cm, Lochgröße 0,2 mm x 0,2 mm). </li><li> Spülen Sie das Ei-Cluster mit Leitungswasser für 5 Sekunden fließt. </li><li> Fügen Sie alle die gespülten Ei-Cluster zu 30x ERM-Lösung. </li><li> Entfernen Sie die Cluster aus der Lösung nach 1 min und legen Sie die Ei-Cluster zwischen trockenen Papierhandtüchern und Rolle vorsichtig. </li><li> Setzen Sie die Eier wieder in den 30x ERM. </li><li> Wählen Sie befruchtete Eier unter einem Binokular. </li><li> Platz ausgewählt 810 Eier in 1x ERM in Sechs-Well-Kunststoffplatten mit einer Pinzette. </li><li> Inkubiere die Eier bei 25 ± 0,1 ° C in einem Inkubator , bis Entwicklungsstadium 21 (Entwicklungsstadien der Medaka - Embryonen aus der Arbeit von Iwamatsu 10 definiert wurden.) </li><li> Suchen Sie sich bebrütete Eier in Entwicklungsstufe 21 unter einem Binokular. </li><li> Spülen Sie ausgewählte Eier mit 1x ERM. </li><li> Betreff der gespülten Eier Belichtungsexperimente (Abschnitt 4). </li></ol> 4. Prüfung der Toxizität von SNCs oder AgNO 3 </sub&gt; Bei verschiedenen ERM Salzhaltigkeiten <ol><li> Spülen Sie Medaka Eier (Stufe 21) dreimal mit Testlösung [SNCs (10 mg / L -1) oder AgNO 3 (15,7 mg / L -1 als 10 mg / L -1 Silber) bei jeder Konzentration von ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, 30x oder) bei pH 7]. Als Kontrollen verwenden Eier in 1 × bis 30 × ERM bei pH 7. </li><li> Liste 15 gespült Eier bis 5 ml jeder Testlösung in Sechs-Well-Kunststoffplatten. (Führen Sie die Belichtungsexperimente dreimal für SNC oder AgNO 3 Toxizität Testen jeder Testlösung verwendet wird .) </li><li> Wickeln Sie die Platten in Aluminiumfolie. </li><li> Inkubieren Sie die gewickelt Platten bei 25 ° C im Dunkeln bis zum Schlüpfen oder für 14 Tage. </li><li> Beachten Sie die exponierten Eier alle 24 Stunden für biologische Veränderungen und tote Eier (Abbildungen 1 und 2). </li><li> Tauschen Sie den Prüflösungen alle 24 Stunden. </li><li> Führen Sie Beobachtungen wie folgt. <ol><li> Am 6. Tag der Exposition, zählen die Herzfrequenz (je 15 sec) of Medaka - Embryonen unter einem Präpariermikroskop mit einer Stoppuhr (Abbildung 3a) verwendet wird . </li><li> Am 6. Tag der Exposition, messen die Augengröße (Durchmesser) von Medaka - Embryonen unter einem Binokular mit einem Mikrometer (Abbildung 3b) verwendet wird . </li><li> Auf dem Schlüpfen Tag, messen die volle Körperlängen von Larven unter einem Binokular mit einem Mikrometer (Abbildung 3c) verwendet wird . </li><li> Zählen Sie die Gesamtzahl der exponierten Eier , die über den 14 Tagen (Abbildung 3d) schlüpfen. </li></ol></li></ol> 5. Isolierung von löslichen Silber von SNC-Lösung und Silber-Analyse <ol><li> Isolieren lösliches Silber von jeder SNC-Lösung (eine Mischung aus Silberkolloide und löslichen Silber) durch Filtrieren durch einen 3 kDa-Membranfilter bei 14000 x g und 4 ° C für 10 min. Verwenden Sie ein 3 kDa Membranfilter löslichen Silber aus den SNCs zu isolieren, da der gemeldete mittleren Durchmesser von aggregierten SNCs in ERM 1x 67,8 nm 11 and der von Ag + ist 0,162 nm 12; die 3 kDa Membran schließt Teilchen mit Durchmessern von 2 nm oder mehr 13. </li><li> Messung der Silberkonzentration in 50 &amp; mgr; l filtrierten Lösung (= die löslichen Silberkonzentration) durch ICP-MS - Analyse (Abbildung 3e) nach der ICP-MS - Betriebshandbuch 8. Das Vorbehandlungsverfahren für die ICP-MS-Analysen wird in Abschnitt 7 beschrieben. </li></ol> 6. Messung der Silber Bioakkumulation in Medaka Embryonen <ol><li> Expose Medaka Eier (Stufe 21) zu SNCs oder AgNO 3 , wie in Abschnitt 4 beschrieben. </li><li> Am Tag 6 der Belichtungs Entfernen Chorion aus dem Ei (dh dechorion) durch in der Medaka Buch 14 beschrieben Medaka Schlüpfen Enzym gemäß dem Protokoll. </li><li> Messung der Silberkonzentration der dechorioned Eier durch ICP-MS - Analyse nach der ICP-MS - Betriebshandbuch 8 (3f). die VorbehandlungsVerfahren für die ICP-MS-Analysen wird in Abschnitt 7 beschrieben. </li></ol> 7. Messung der Silberkonzentration mittels ICP-MS-Analyse <ol><li> In Proben [50 ul Silberlösung (für die Validierung der Silberkonzentration; Teil 1); drei dechorionated Embryonen (Abschnitt 5); oder 50 &amp; mgr; l der gefilterten Lösung (Abschnitt 5)] in ein 50 ml Teflonbecher. </li><li> Werden 2,0 ml ultrareinem Salpetersäure zu dem 50 ml-Becherglas. </li><li> Das Gemisch wird auf einer Heizplatte bei 110 ° C, bis kurz bevor es austrocknet (ca. 3 h). </li><li> Aufzulösen vollständig die organische Substanz, fügen 2,0 ml ultrareinem Salpetersäure und 0,5 ml Wasserstoffperoxid in das Becherglas. </li><li> Das Gemisch wird wieder auf der heißen Platte bis kurz bevor es austrocknet (ca. 3 h). </li><li> Löse den Rückstand in 4 ml 1,0% ultrareine Salpetersäure-Lösung. </li><li> Transfer 4 ml der Lösung in ein Zentrifugenröhrchen. </li><li> Wiederholen 7,6-7,7 zweimal (insgesamt dreimal). Das Endvolumen beträgt 12,0ml. </li><li> Messen Sie die Silberkonzentration der Probe (gelöst in 1,0% Reinst - Salpetersäure) unter Verwendung von ICP-MS - Analyse nach der Betriebsanleitung 8. <ol><li> Verwenden Sie einen internen und einen externen Standardlösung (siehe Materialliste) , um die Silberkonzentration zu quantifizieren. Die internen und externen Standardlösung wird durch American Association for Laboratory Accreditation (A2LA) akkreditiert. Die Nachweisgrenzen von Silber waren 0,0018 ng / ml -1 (Lösung) und 0,016 ng mg-Gewicht -1 (Embryo Körper). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Coastal Condition Report. , (2001).</li><li>Sakaizumi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inorganic+salts+on+mercury-compound+toxicity+to+the+embryos+of+the+Medaka,+Oryzias+latipes.">Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes.</a> J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).</li><li>Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+(Oryzias+latipes)+Embryo+toxicity+of+treated+leachate+from+waste-landfill+sites.">Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites.</a> J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).</li><li>Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Nanoparticles+in+the+See-through+Medaka+(Oryzias+latipes).">Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes).</a> EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , (2006).</li><li>Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environmental+salinity+on+the+development+of+chloride+cells+of+freshwater+and+brackish-water+medaka,+Oryzias+latipes.">Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes.</a> Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , (2007).</li><li>Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanocolloids+disrupt+medaka+embryogenesis+through+vital+gene+expressions.">Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions.</a> ES &amp; T. 46 (11), 6278-6287 (2012).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).</li><li>Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salinity+increases+the+toxicity+of+silver+nanocolloids+to+Japanese+medaka+embryos.">Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos.</a> Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).</li><li>Shannon, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+effective+ionic+radii+and+systematic+studies+of+interatomic+distances+in+halides+and+chalcogenides.">Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides.</a> Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).</li><li>Wakamatsu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Medaka ist ein Süßwasserfisch, die sehr tolerant gegenüber Meerwasser ist; es ist nicht bekannt , dass die ursprüngliche natürliche Lebensraum dieser Fisch Salzwasser vor der japanischen Küste 6 war. Daher haben Medakafisches Chloridzellen 7 gut entwickelt. Diese einzigartige Eigenschaft bietet Wissenschaftlern eine neue Möglichkeit, die Toxizität von Chemikalien in der Umwelt als eine Funktion der Salinität (Süßwasser Meerwasser) zu testen, indem nur eine einzige Art von Fisch verwendet...

1 Seit der Gründung der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) Prüfrichtlinien zur Prüfung von Chemikalien im Jahr 1979 wurden 38 Testrichtlinien wurden in Abschnitt 2 der Leitlinien, Auswirkungen auf biotische Systeme veröffentlicht. Alle von den Wasserorganismen wurden aus Süßwasserhabitaten getestet, nämlich Süßwasserpflanzen; Algen; wirbellose Tiere wie Daphnien und Chironomiden; und Fische wie Medaka, Zebrafisch und Regenbogenforelle. Im Vergleich zu Salzwasser-Umgebungen, Süßwasser-Umgebungen mehr direkt durch menschliche wirtschaftlichen und industriellen Tätigkeiten betroffen. Daher Süßwasser-Umgebungen wurden für den Test priorisiert, weil sie ein höheres Risiko von Verschmutzung sind. In den Küstengebieten, einschließlich der Mündungen, variieren Salinität zwischen Brackwasser und Meerwasser Bedingungen, und diese Bereiche werden oft durch industrielle Tätigkeit 2 belastet. Die Küstengebiete und ihre zugehörigen Feuchtgebiete werden durch h gekennzeichnetigh ökologische Artenvielfalt und Produktivität. Küstenökosysteme müssen daher durch chemische Verschmutzung geschützt werden. Allerdings gibt wurde in Brackwasser und Meerwasser Lebensräume ökotoxikologische Forschung beschränkt. Sakaizumi 3 untersucht die toxischen Wechselwirkungen zwischen Methylquecksilber und Salzgehalt in der japanischen Medaka Eier und festgestellt , dass der osmotische Druck der Testlösung eine Erhöhung der Toxizität des Methylquecksilber verbessert. . Sumitani et al 4 verwendet Medaka Eier die Toxizität von Deponiesickerwasser zu untersuchen; sie fanden heraus, dass der osmotische Äquivalenz von Sickerwasser auf die Eier der Schlüssel zu induzieren Anomalien während der Embryonalentwicklung war. Darüber hinaus Kashiwada 5 berichtet , dass Kunststoff - Nanopartikel (39,4 nm Durchmesser) leicht durch das Medaka - Ei Chorion unter Brack Bedingungen durch (15x Embryo Aufzuchtmedium (ERM)). Ein typischer kleiner Fisch - Modell, die japanischen Medaka (Oryzias latipes </em&gt;) hat in grundlegende Biologie und Ökotoxikologie 6 verwendet. Japanische Medaka kann unter den Bedingungen im Bereich von Süßwasser Meerwasser leben wegen ihrer hoch entwickelten Chloridzellen 7. Sie sind daher geeignet für die Prüfung in Bedingungen mit einem weiten Bereich von Salzkonzentrationen nützlich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="785">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Silver nanocolloids</td>
			<td style="width:188px;">Utopia Silver Supplements</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">NaCl</td>
			<td>Nacalai Tesque, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">31319-45</td>
			<td>For making ERM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">KCl</td>
			<td>Nacalai Tesque, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">28513-85</td>
			<td>For making ERM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Nacalai Tesque, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">06730-15</td>
			<td>For making ERM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Nacalai Tesque, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">21002-85</td>
			<td>For making ERM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">31212-25</td>
			<td>For making ERM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AgNO3</td>
			<td>Nacalai Tesque, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">31018-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter</td>
			<td>HORIBA, Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">F-51S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Balance</td>
			<td>Mettler-Toledo International Inc.</td>
			<td style="width:119px;">MS204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">medaka (Oryzias latipes) orange-red strain&#160;</td>
			<td colspan="2">National Institute for Environmental Studies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">medaka flow-through culturing system</td>
			<td>Meito Suien Co.</td>
			<td>MEITOsystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Artemia salina nauplii eggs</td>
			<td>Japan pet design Co. Ltd</td>
			<td>4975677033759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aeration pomp</td>
			<td>Japan pet design Co. Ltd</td>
			<td>non-noise w300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Otohime larval &#946;-1</td>
			<td style="width:188px;">Marubeni Nissin Feed Co. Ltd</td>
			<td style="width:119px;">Otohime larval &#946;-1</td>
			<td>Artificial dry fish diet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:188px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:119px;">M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">micrometer</td>
			<td>Fujikogaku, Ltd.</td>
			<td>10450023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">incubator</td>
			<td>Nksystem</td>
			<td>TG-180-5LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">shaker</td>
			<td style="width:188px;">ELMI Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">Aizkraukles 21-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plastic plates</td>
			<td>Greiner CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">M8562-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aluminum foil</td>
			<td>AS ONE Co.</td>
			<td style="width:119px;">6-713-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stopwatch</td>
			<td>DRETEC Co. Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">SW-111YE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-kDa membrane filter</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td colspan="2">0.5-mL centrifugal-type filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50-mL Teflon beaker</td>
			<td>AS ONE Co.</td>
			<td style="width:119px;">33431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Custom claritas standard</td>
			<td style="width:188px;">SPEXertificate</td>
			<td style="width:119px;">ZSTC-538</td>
			<td>For internal standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Custom claritas standard</td>
			<td style="width:188px;">SPEXertificate</td>
			<td style="width:119px;">ZSTC-622</td>
			<td>For external standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">ultrapure nitric acid</td>
			<td style="width:188px;">Kanto Chemical Co.</td>
			<td style="width:119px;">28163-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">hydrogen peroxide&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Kanto Chemical Co.</td>
			<td style="width:119px;">18084-1B</td>
			<td>for atomic absorption spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">ICP-MS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific X Series 2&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hot plate</td>
			<td>Tiger Co.</td>
			<td>CRC-A300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

salinity-dependent toxicity assay of silver nanocolloids using medaka eggs

Salinität ist ein wichtiges Merkmal der Gewässer. Für Wasserorganismen definiert sie die Lebensräume von Süßwasser, Brackwasser und Meerwasser. Tests der Toxizität von Chemikalien und Bewertungen ihrer ökologischen Risiken für Wasserorganismen sind in Süßwasser, aber die Toxizität von Chemikalien für Wasserorganismen ist abhängig von pH-Wert, Temperatur und Salzgehalt häufig durchgeführt. Es gibt keine Methode, jedoch zum Testen der Salinität Abhängigkeit von Toxizität für Wasserorganismen. Hier haben wir Medaka (Oryzias latipes) , weil sie an Süßwasser, Brackwasser angepasst werden kann, und Meerwasser. Verschiedene Konzentrationen von Embryo-Aufzuchtmedium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x und 30x) wurden eingesetzt, um die Toxizität von Silber nano-kolloidaler Teilchen (SNCs) zu testen, Eier (1x ERM und 30x WKM Medaka haben osmotischen Druck äquivalent In den Süß- und Meerwasser, beziehungsweise). In Sechs-Well - Kunststoffplatten 15 Medaka - Eier in dreifacher Ausfertigung wurden mit 10 mg / L zu SNCs ausgesetzt und# 8722; 1 in verschiedenen Konzentrationen von ERM bei pH 7 und 25 ° C im Dunkeln. Wir haben ein Binokular und einem Mikrometer auf dem Schlüpfen Tag (Abschnitt 4) Herzfrequenz pro 15 Sekunden und Augen Durchmesser am Tag 6 und voller Körperlänge der Larven zu messen. Die Embryonen wurden bis zum Schlüpfen oder Tag 14 beobachtet; zählten wir dann die Schlupfrate für 14 Tage jeden Tag (Abschnitt 4). Um Silber Akkumulation in Embryonen zu sehen, verwendeten wir induktiv Plasma-Massenspektrometrie gekoppelt mit zunehmender Salinität die Silberkonzentration von Testlösungen (Abschnitt 5) und dechorionated Embryonen (Abschnitt 6) .Die Toxizität der SNCs zu Medaka Embryonen offensichtlich erhöht zu messen. Dieses neue Verfahren ermöglicht es, die Toxizität von Chemikalien in verschiedenen Salzgehalten zu testen.

Die Wirkung der Salinität auf SNC Toxizität war sehr offensichtlich: die Induktion von Deformitäten oder Tod abhängig war Salinität (Abbildungen 1 und 2). Wir maßen phänotypische Biomarker (Herzfrequenz, Augengröße, voller Körperlänge und Schlupfrate) in SNC (10 mg / L -1) -exposed Embryonen. Diese phänotypischen Biomarker Salinität abhängige SNC Toxizität ergab. Die ...

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Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Salinität abhängigen Toxizität Assay von Silbernanokolloide Verwendung von Medaka-Eier

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.9K Aufrufe.  Toyo University. Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Serie: Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Menschliche pluripotente Stammzelle Basierend Entwicklungstoxizität Assays für chemische Sicherheit Screening und Systembiologie Datengenerierung

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Methode der Untersuchung Palatal Fusion mit statischen Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epikardiale Outgrowth Kulturtest und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Beurteilung von Epikardiale abgeleiteten Zellmigration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Medikamentöse Behandlung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including embryogenesis and development, wound healing, tumor growth and metastasis, and ocular and cardiovascular diseases. Effective in vitro models that recapitulate the biology of angiogenesis are needed to appropriately study this process and identify mechanisms of regulation that can be ultimately targeted for novel therapeutic strategies. The bead angiogenesis assay has been previously demonstrated to recapitulate the multiple stages of endothelial sprouting in vitro. However, a limitation of this assay is a lack of endothelial &#8211; mural cell interactions, which are key to the molecular and phenotypic regulation of endothelial cell function in vivo. The protocol given here presents a methodology for the incorporation of mural cells into the bead angiogenesis assay and demonstrates a tight association of endothelial cells and pericytes during sprouting in vitro. The protocol also details a methodology for effective silencing of target genes using siRNA in endothelial cells for mechanistic studies. Altogether, this protocol provides an in vitro assay that more appropriately models the diverse cell types involved in sprouting angiogenesis, and provides a more physiologically-relevant platform for therapeutic assessment and novel discovery of mechanisms of angiogenesis regulation.

This protocol presents a novel in vitro bead assay that more appropriately models the process of in vivo sprouting angiogenesis by incorporating pericytes. This modification enables the bead assay to more faithfully recapitulate the heterotypic cellular interactions between endothelial cells and mural cells that are critical for angiogenesis.

Einbeziehung der Perizyten in einem Endothelzellen Korn sprießen Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the formation of new blood vessels and involve several signal transduction pathways. Here we show that the tube formation assay is a simple in vitro method to evaluate the impact of natural products on angiogenesis and to investigate the molecular mechanisms involved. In particular, in the presence of the water extract of Ruta graveolens (RGWE), endothelial cells are no longer able to form a cell-cell network and that the RGWE effects on human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) tube formation is abolished by the constitutive activation of MEK.

Here, we evaluate the effects of the water extract of Ruta graveolens on vessel network formation by using a tube formation assay on a gelled basement matrix.

HUVEC Tube-Formation Assay zur Bewertung der Auswirkungen natürlicher Produkte auf die Angiogenese

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

Injektion von Gryllus bimaculatus Eiern

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Dreidimensionales Angiogenese-Assay-System mit Co-Culture-Spheroiden, die von endotheliaalen Koloniebildenden Zellen und mesenchymalen Stammzellen gebildet werden

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes such as development are affected. The Caenorhabditis elegans germline is a great model system for studying PPIs that are related to the regulation of stem cells, meiosis, and development. There are a variety of well-developed techniques that allow proteins of interest to be tagged for recognition by standard antibodies, making this system advantageous for proximity ligation assay (PLA) reactions. As a result, the PLA is able to show where PPIs occur in a spatial and temporal manner in germlines more effectively than alternative approaches. Described here is a protocol for the application and quantification of this technology to probe PPIs in the C. elegans germline.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates use of the proximity ligation assay to probe for protein-protein interactions in situ in the C. elegans germline.

In Situ Detektion von Ribonucleoprotein Complex Assembly in der C. elegans Germline mit Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...