Dieses Protokoll beschreibt die Sammlung massiver Daten aus protein-DNA-bindenden Mikroarrays für Primase, ein Enzym, das vorübergehend an bestimmte DNA-Sequenzen bindet und damit die Bildung von RNA-Primern katalysiert. In diesem Video wird beschrieben, wie die Mikroarray-Technologie dazu beitragen kann, Primase-Sequenzerkennungsstellen neu zu definieren und wie ein Ansatz mit hohem Durchsatz die klassische Biochemie ergänzen kann. Diese Technik kombiniert zwei Ansätze: Primase DNA-bindendes Mikroarray und Primase-Aktivitäts-Assay.
Das Mikroarray liefert massive Daten über die Primasebindung an DNA-Sequenzen, wobei der biochemische Assay Informationen über die RNA-Primerbildung durch DNA-Primase liefert. Die getestete enzymatische Aktivität hängt von der Einsicht aus dem Mikroarray-Experiment und seinem geringeren Durchsatz in seiner Natur ab. Der Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit der Bindung, der DNA-Sequenzauswahl und der Aktivität des Enzyms wird untersucht.
Die Identifizierung der Sequenzdeterminanz mit Mikroarray ermöglicht es uns, genaue Schlussfolgerungen auf der Grundlage massiver Daten des Mikroarrays zu ziehen. Dieser Ansatz wurde bisher verwendet, um DNA-Bindungssequenzen von Transkriptionsfaktoren zu beschreiben. Transkriptionsfaktoren sind statische Proteine, die eng an die DNA binden.
Das Verfahren wird Stefan Ilic demonstrieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, befeuchten Sie den Mikroarray-Dia, indem Sie ihn in ein Coplin-Glas mit 0,01%Triton-X 100 legen. Und drehen auf einem Laborrotator, fügen Sie 125 Rpm für fünf Minuten.
Die Sperrlösung in eine Kunststoffbox zersiekern. Entfernen Sie dann das Mikroarray-Dia aus dem Coplin-Glas. Verwenden Sie ein feines Wischen, um die Nicht-DNA-Seite und die Ränder des Dias zu fahren.
Legen Sie das Mikroarray langsam in die Kunststoffbox. Bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit langsamem Schütteln inkubieren. Danach die Rutsche einmal mit 0,01%Tween-20 in PBS waschen.
Auf einem Laborrotator bei 125 Rpm für fünf Minuten. Entfernen Sie den Tween-20 und spülen Sie das Dia einmal mit 0,01%Triton-X 100 in PBS auf einem Laborrotator bei 125 Rpm für zwei Minuten. Dann übertragen Sie die Folie schnell in ein Coplin-Glas, das PBS enthält.
Montieren Sie zunächst die PMB-Kammer, wie im Textprotokoll beschrieben. Platzieren Sie die Folie in den angegebenen Bereich. Verwenden Sie eine Pinzette, um sie nach unten und links zu drücken.
Legen Sie die Silikondichtung auf und stellen Sie sicher, dass sie gut mit dem unteren Teil der PBM-Kammer ausgerichtet ist. Schließen Sie dann die Kammer und ziehen Sie die Schrauben diagonal fest. Die Proteinbindungsmischung in jeden Brunnen der Dichtung geben.
Dann bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubieren. Zunächst pipette 0.05%Tween-20 in PBS in die PBM-Kammer, um die Rutsche kurz zu waschen. Entfernen Sie die Lösung mit einem Vakuumsauger aus den Brunnen der Kammer, da Sie darauf achten, die DNA-Spots nicht zu berühren.
Wiederholen Sie dies, waschen Sie die Folie kurz mit PBS. Und verwenden Sie das Vakuum, um die Lösung aus den Brunnen der Kammer zu entfernen, während Sie darauf achten, die DNA-Spots nicht zu berühren. Als nächstes fügen Sie Alexa 488 konjugierten Anti-His Antikörper zu jedem Brunnen der PBM-Kammer.
Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Danach waschen Sie die Rutsche in der PBM-Kammer kurz, indem Sie ein paar Tropfen von 0,05%Tween-20 in PBS in jeden Brunnen hinzufügen. Und verwenden Sie den Vakuum-Aspirator, um die Lösung aus den Brunnen der Kammer zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die DNA-Spots nicht zu berühren.
Zerlegen Sie die PBM-Kammer und entfernen Sie die Folie. Spülen Sie die Dias zweimal in 0,05%Tween-20 in PBS, wobei jede Spülung drei Minuten dauert. Spülen Sie dann die Dias zweimal in PBS, wobei jede Spülzeit jeweils drei Minuten dauert.
Und einmal in doppelt destilliertem Wasser für drei Minuten. Trocknen Sie die Dias mit Druckluft. Und lagern Sie sie in einer dunklen Diabox, bis sie zum Scannen bereit ist.
Wenn Sie bereit sind, scannen Sie den Chip mit einem Mikroarray-Scanner mit einer Anregung von 495 Nanometern und einer Emission von 19 Nanometern. Und sammeln Sie die mittlere Fluoreszenzintensität. In dieser Studie wird pi durchsatz-Primase-Profiling verwendet, um die Primase-Bindungsstellen abzubilden, einschließlich derjenigen, die mit klassischen Werkzeugen schwer, wenn nicht gar nicht zu beobachten sind.
Wichtig ist, dass pi-Durchsatz-Primase-Profiling die Überprüfung des traditionellen Verständnisses von Primase-Bindungsstellen ermöglicht. Besonders pi-Durchsatz-Primase-Profiling zeigt neben bekannten 5'GTC3'Erkennungssequenzen auch Bindungsspezifitäten auf, was zu Veränderungen in den funktionellen Aktivitäten der T7-DNA-Primase führt. Nämlich werden zwei Gruppen von Sequenzen identifiziert.
Starke Bindungs-DNA-Sequenzen, die TG in den Flanken enthielten, und schwache Bindungs-DNA-Sequenzen, die AG in den Flanken enthielten. Es wurde keine Primasebindung an DNA-Vorlagen festgestellt, die 5'GTC3'in ihren Sequenzen fehlten. Die Primase-DNA-Erkennungsstellen, die spezifische Merkmale wie TG-reiche Flanken enthalten, erhöhen die Primase-DNA-Bindung bis zum 10-fachen.
Überraschenderweise erhöhen sie auch die Länge der neu gebildeten RNA. Wichtig ist, dass das Primse-Profiling mit hohem Durchsatz es uns ermöglicht, die Variabilität in der Grundlänge in Bezug auf die Sequenz der DNA-Vorlage zu beobachten und zu quantifizieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten die Waschschritte subtil sein.
Und Puffer sollten Komponenten enthalten, die den Primase auf der DNA protokolliert haben. Auch ein Schwellenwert für vergebliche Bindungsereignisse wird biochemisch bestimmt. Daher ist die Analyse des Mikroarrays unzureichend.
Methoden wie eine Oberflächenplasmaresonanz und Gelverschiebungstests können die Bindungsaffinität von Primase bestimmen, um die DNA-Sequenzen auszuwählen. Mein Labor implementiert Vorhersagemodelle für maschinelles Lernen, um Primatese-Sequenzdeterminanten zu erkennen, die produktive Primer liefern, die durch DNA-Polymerase erweitert werden können. Im Ära der Big Data, einer Implementierung statistischer Methoden zur Analyse von Big Data, wird die Technik definitiv dazu beitragen, bestimmte DNA-Sequenzen besser zu charakterisieren und die Sequenzerkennung mit der Aktivität von Primase zu verknüpfen.
Jeder, der mit Strahlung arbeitet, sollte ein gründliches Verständnis der Vorschriften und Gefahren im Zusammenhang mit der Verwendung ionisierender Strahlung haben. Sollte sich einer Schulung unterziehen und mit Sicherheitsausrüstung arbeiten.
