Eine gängige Technik, um die Funktion eines Proteins herauszufinden, besteht darin, es zu löschen und zu sehen, was passiert. Aber das kann man nicht mit einem essentiellen Protein machen. Es ist wichtig, die Zelle stirbt.
Sie brauchen also eine Möglichkeit, dieses Protein zu entfernen und einen Blick auf das zu erhaschen, was kurz vor dem Zelltod passiert. Proteinmangel sollte schnell sein, so dass Sie keine sekundären Effekte erhalten. Es sollte spezifisch sein, so dass nur dieses Protein entfernt und nur erschöpft wird, wenn Sie es wollen.
Und es sollte die Zelle auf andere Weise nicht beeinflussen, außer das Protein zu entfernen. Nach der Vorbereitung der Sorte, verwenden Sie eine Nachtkultur, um zu bestimmen, welche Verdünnung erforderlich ist. Verwenden Sie diese Informationen, um eine ausreichende neue Kultur mit einem OD600 zwischen 0,1 und 0,2 einzurichten und sie bei 30 Grad Celsius anzubauen.
In einer Dunstabzugshaube ein Methanol, das 30 bis 50 % des vorgesehenen Probenvolumens entspricht, einem 15-Milliliter-Rohr hinzufügen. Schließen Sie die Rohre fest, beschriften Sie sie und legen Sie sie auf Trockeneis, um sie abzukühlen. Als nächstes 1,5-Milliliter-Rohre für die Langzeitlagerung der Proben beschriften und abkühlen lassen.
Mindestens einen Milliliter Wasser pro Probe auf Eis abkühlen lassen. Sobald die optische Zieldichte für den Beginn der Vorinkubation erreicht ist, übertragen Sie eine Probe in das vorgefertigte Rohr mit kaltem Methanol. Umkehren Sie die Röhre kurz und legen Sie sie wieder auf Trockeneis.
Dies ist die nicht induzierte Kontrollstichprobe. Fügen Sie sofort das Beta-Estradiol so hinzu, dass die Endkonzentration 10-Mikromolar beträgt. Kräftig wirbeln, um es zu mischen.
Bauen Sie die Kultur weiter wie bisher, und inkubieren Sie mit Beta-Estradiol für die optimale Zeit, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Beta-Estradiol-Inkubationszeit ist der wichtigste Schritt und muss für jedes Protein optimiert werden. Zu kurz und die Erschöpfung ist unvollständig und langsam.
Zu lange und der Proteinspiegel wird sinken, noch bevor Sie das Auxin hinzugefügt haben. Pipette bis 0,5 Mikroliter IAA pro Milliliter Kultur später hinzuzufügen. Sammeln Sie eine Probe aus der unerlierten Kultur, wie zuvor beschrieben.
Fügen Sie die IAA sofort zu einer Endkonzentration von 750-Mikromolar hinzu und wirbeln Sie kräftig, um sie zu mischen. Starten Sie einen Timer so schnell wie möglich nach dem Mischen. Sammeln Sie Proben nach dem experimentellen Design.
Legen Sie dann die Proben auf Eis. Stellen Sie sicher, dass keine der Proben eingefroren ist. Wenn überhaupt, wärmen Sie sie vorsichtig in der Hand, während sie ständig invertieren.
Sobald alle Proben gesammelt und nicht eingefroren sind, zentrieren Sie sie bei 3, 500 mal G und vier Grad Celsius für zwei Minuten. Das Methanol und die mittlere Mischung abgießen und die Proben wieder auf Eis legen. Dann das Zellpellet in einem Milliliter Wasser wieder aufhängen und diese Suspension in eine markierte Röhre auf Eis übertragen.
Zentrifugieren Sie kurz mit einer Geschwindigkeit von mehr als 15.000 mal G, um die Zellen abzustoßen. Danach die Rohre wieder auf Eis legen und die Flüssigkeit ansaugen. In dieser Studie wird der Abbau darauf abgestimmt, eine spezifische und effiziente Proteinerschöpfung zu erreichen, ohne den Stoffwechsel der Hefezelle anderweitig zu beeinträchtigen.
Die low-abundance spliceosomal Prp2 und Prp22 Proteine sind beide auf weniger als 20% nach 20 Minuten Vorinkubation mit Beta-Estradiol erschöpft, gefolgt von 15 Minuten mit Auxin. Längere Vorinkubationszeiten führen zu einer schnelleren Erschöpfung, zeigen aber auch eine unerwünschte Proteinerschöpfung vor der Auxin-Zugabe. Im Vergleich dazu ist die reichlichere Dcp1 nur auf etwa 30% mit der gleichen Behandlung erschöpft.
60 Minuten Vorinkubationszeit führen jedoch zu einer Erschöpfung von 13% bei der gleichen Auxin-Behandlung auf Kosten der Erschöpfung, bevor das Auxin hinzugefügt wird. Optimieren Sie die Vorinkubationszeit, und verlieren Sie nicht den Überblick über die Zeit zwischen Ihren Zeitpunkten. Was als nächstes zu tun ist, hängt von Ihrer Frage ab.
Wir haben herausgefunden, dass eine 10-Meilen-Kulturprobe für die Protein-, DNA- oder RNA-Analyse ausreicht. Das Probenahmeverfahren ist auch für ChIP leicht anpassungsfähig. Jetzt gibt es einen schnellen und spezifischen Weg, um Proteine zu erschöpfen.
So kann die Funktion auch von essentiellen Proteinen gefunden werden. Das Protokoll ist ziemlich sicher. Methanol ist die einzige gefährliche Chemikalie.
Achten Sie beim Dosieren darauf. Tun Sie es in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie zwei Paar Handschuhe, da Methanol durch die meisten Nitrilhandschuhe gelangen kann.
