Dieses Protokoll wird seit über 40 Jahren verwendet und bleibt die einzige zuverlässige Methode für Brustzelltransplantationstests bei Ratten. Diese Methode ist weit verbreitet, um Brustzellen autonom versus Wirt Effekte in der Brustkrebsanfälligkeit Forschung zu verhören. Durch die Transplantation in das interskapulierliche Fettpolster umgeht diese Methode die Beseitigung des endogene Membranepithels, das bei Ratten nicht wirksam ist.
Die Methode ist daher weniger invasiv und die endogenen Brustdrüsen können als interne Kontrolle verwendet werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie eine eingeschläferte weibliche Ratte auf den Rücken und sichern Sie sie mit Stiften. Sprühen Sie die gesamte ventrale Oberfläche mit 70% Ethanol.
Machen Sie einen sagittalen Y-förmigen Schnitt, der den Zugang zu Brustdrüsen der Brust, der Bauch und der Leistenmuskibe ermöglicht. Verwenden Sie eine Schere, um das gesamte Brustdrüsengewebe von der Spenderratte zu sezieren und alle sichtbaren Lymphknoten zu entfernen. Als nächstes verwenden Sie Zangen, um das Brustgewebe zu extrahieren.
Legen Sie es in eine beschriftete 60-Millimeter-Schale mit 500 Mikroliters serumfreiem DMEM F12-Medium und halten Sie es auf Eis. Dann verwenden Sie eine Schere, um das Brustgewebe fein zu zerkleinern. Drehen Sie zunächst den Körper des Spendertiers vorsichtig um, um ihn in eine anfällige Position zu bringen und mit Stiften zu befesten.
Den Kopf und den oberen Rücken mit 70% Ethanol besprühen. Suchen Sie die Basis des Schädels und machen Sie einen Schnitt unter den okzipitalen Kondylen, setzen Sie scharfe Scheren unter die Haut und schneiden Sie die Haut weg vom Schädel einschließlich der Seiten des Kopfes. Als nächstes verwenden Sie Knochenschneider oder starke Schere, um den Schädel entlang der Mittellinie von der okzipitalen zu frontalen Knochen zu schneiden, während Sie sicherstellen, dass die Klinge so oberflächlich wie möglich und nach oben gewinkelt, um die Zerstörung des darunter liegenden Hirngewebes zu verhindern.
Verwenden Sie Rongeurs oder starke Zangen, um den Knochen zu schälen. Setzen Sie das Werkzeug seitlich in das Kleinhirn ein, um den Knochen auf beiden Seiten zu brechen. Trennen Sie die Verbindungen zu den Meninges, indem Sie den Gehörgang vollständig freilegen.
Verwenden Sie gekrümmte feinspitzen Zangen, um das Gehirn aus dem Schädel zu heben und sein Gewicht aufzuzeichnen. Verwenden Sie einen Neuanfang der Versorgung für zusätzliche Spendergehirne. Übertragen Sie es sofort in ein 15-Milliliter-Rohr, das eine gleiche Menge an Medien enthält, die auf Eis gespeichert sind.
Homogenisieren Sie das Gehirn für 10 bis 15 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit. Dann filtern Sie das Homogenat, um große Stücke zu entfernen. Bewahren Sie die Flüssigkeit auf Eis auf, bis sie benötigt wird.
Schneiden Sie zunächst einen Zentimeter vom Ende einer 1.000 Mikroliter-Pipettenspitze ab und legen Sie sie manuell auf den Pipetten. Verwenden Sie eine geschnittene Pipettenspitze, um das gehackte Spendergewebe von jeder 60-Millimeter-Schale in das Kollagenase-Verdauungsrohr zu übertragen. Mischen Sie das gehackte Gewebe vorsichtig, indem Sie es ein- bis zweimal nach oben und unten pfeifen.
Dann sichern Sie die Proben in einer horizontalen Position im Schüttelinkubator. Lassen Sie die Proben für 1,5 bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius verdauen, während Sie mit einer Geschwindigkeit zwischen 200 und 220 RPM schütteln. Wenn das Spender-Brustdrüsengewebe vollständig verdaut ist, zentrifugieren Sie die Suspension bei 1, 200 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Nachdem sichergestellt ist, dass sich ein Pellet gebildet hat, verwenden Sie eine Pipette, um die Fettschicht zu entfernen oder den Überstand vorsichtig abzugießen. Das Pellet in 10 Millilitern frischer DMEM F12-Medien vorsichtig wieder aufhängen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Zellen gründlich zu waschen.
Bereiten Sie für jedes Spendertier eine 50-Milliliter-Röhre mit einem 40-Mikrometer-Sieb vor. Das Sieb mit mindestens einem Milliliter DMEM F12-Medien vorbefeuchten. Verwenden Sie dann eine Pipette, um die Zellsuspension durch den Filter zu leiten, um duktale Fragmente oder Organoide zu sammeln.
Bei Organoiden bleiben nur die Zellen, die im Filter verbleiben. Invertieren Sie das Zellsieb über eine neue 50 Milliliter Tube und spülen Sie mit jedem Volumen von sterilen Medien erforderlich, um alle Zellen zu sammeln. Danach pellet die Zellen noch einmal und resuspendieren in einem kleinen Volumen von Medien zum Zählen.
Bereiten Sie einzelne Chargen von Spendermaterial für alle Transplantationsempfänger vor, indem Sie gleiche Volumina der Zellsuspension mit 50% Gehirnhomogenat für jeden Ort der Transplantation kombinieren. Identifizieren Sie zunächst die Basis des Schädels und den Beginn der Wirbelsäule auf einem Empfängertier. Etwa ein Drittel des Weges nach unten die Wirbelsäule, rasieren Eine drei Zentimeter mal zwei Zentimeter Fläche auf dem oberen brustförmigen Teil des Rückens.
Als nächstes bereiten Sie das sterile Feld vor, das für die Operation verwendet wird, und arrangieren Alle benötigten Vorräte. Spülen Sie die Hamilton-Spritzen mit sterilen DMEM F12-Medien, um den Verlust von Zellen zu verhindern. Legen Sie das gesamte Volumen des Spendermaterials für jede Bedingung in eine separate Spritze.
Nachdem die Spritze voll beladen ist, invertieren Sie sie und drücken Sie den Kolben leicht, um Luftblasen an der Spitze der Nadel zu entfernen. Halten Sie die Spritze während des gesamten Verfahrens auf Eis. Stellen Sie sicher, dass das Tier mit einer festen Zehenprise nicht auf tiefe Reize reagiert.
Verwenden Sie dann eine scharfe chirurgische Klinge, um einen kleinen zwischensakulären Schnitt zu machen. Suchen Sie das mediale Blutgefäß zur Orientierung und verwenden Sie Zangen, um die Haut auf einer Seite des Schnitts zu heben. Halten Sie die Haut vom Fettpolster weg und vermeiden Sie das darunter liegende braune Fett, während die Transplantation durchgeführt wird.
Als nächstes legen Sie die Nadel in die Transplantatstelle ein. Spritzen Sie vorsichtig 40 Mikroliter der Zellmischung in das interscapuläre weiße Fettpolstergewebe. Entfernen Sie die Nadel langsam.
Halten Sie das Gewebe an Ort und Stelle und lassen Sie die transplantierten Zellen für drei bis fünf Sekunden zu begleichen. Wiederholen Sie das gesamte Injektionsverfahren, wie zuvor am zweiten Ort der Transplantation beschrieben. Danach die chirurgische Wunde mit Wundclips oder Nähten schließen und dann die Anästhesie abbrechen.
Nachdem Sie das Tier geopfert haben, bereiten Sie es für die Zerlegung vor. Identifizieren Sie das mediale Blutgefäß, das die Transplantatstellen im interscapularen Fettpolster trennt. Verbrauchen Sie das gesamte Pad als ein einzelnes Stück Gewebe.
Legen Sie das Gewebe auf einem positiv geladenen Mikroskopschlitten für die gesamte Halterung. Legen Sie die Dias in 70% Ethanol für sieben bis zehn Tage, um das Gewebe zu entfetten. Dann bereiten Sie den Alum-Karmin-Färbung vor und verarbeiten Sie die Dias, wenn das Gewebe ausreichend undurchsichtig ist.
Wenn die Verarbeitung abgeschlossen ist und das Gewebe auf dem Dia gelöscht ist, verwenden Sie low-power light mikroskopoder hochauflösende digitale Fotografie, um Bilder der Dias für die Analyse zu erfassen. In dieser Studie werden Brustepithelzellen mit einer Technik transplantiert, die für die Arbeit mit Ratten optimiert ist, bei der die isolierten Epithelorganoide der Samenratten in das interskapulierweiße Fettpolster der Empfängerratten eingepfropft werden. Die Anwesenheit, Abwesenheit oder Fülle von Epithel kann bewertet werden, um den Erfolg des Experiments sowie die Autonomie von Effekten im Zusammenhang mit experimentellen Variablen zu bestimmen.
Ein gegenseitiges Transplantationsexperiment, bei dem jeder Faktor zwei Ebenen wie Wildtyp versus Knockout hat, erstellt vier Transplantationsgruppen für Hypothesentests. Das repräsentative gesamte montierte interskapulare Fettpolster, das hier gezeigt wird, enthält ein positives epitheliale Auswuchs an beiden Transplantationsstandorten. Bei der Analyse der Dias kann der Mangel an Epithel im interskapulären Fettpolster über viele Proben auf ein technisches Problem mit dem Verfahren hinweisen und sollte als negatives Ergebnis behandelt werden.
Spenderepithelial-Auswuchs kann auch mit der endogenen Brustdrüse verglichen werden und kann zusätzliche Schlussfolgerungen erleichtern. Im hier gezeigten Beispiel deuteten die Ergebnisse der gegenseitigen Transplantation mit Wildtyp und CDKN1B-Knockout-Ratten auf autonome Wirkungen der Nicht-Mamma-Zelle auf die Entwicklung der Brustdrüse hin. Denken Sie daran, Spender Epithelzellen und Organoide müssen sorgfältig vorbereitet und am Leben gehalten werden, bis in das Empfängertier injiziert.
Es ist unerlässlich, vorauszuplanen und das Verfahren sorgfältig und ohne Unterbrechungen durchzuführen. Primäre Karzinogenese-Assays können nach der Transplantation durchgeführt werden, um die Autonomie der Brustzellen in der Ätiologie oder Behandlung von Brustkrebs abzuhören. Die Genbearbeitung kann auch in den Gentechnischveränderten der Spenderzellen oder der Empfängerratte integriert werden.
Als einzige Methode zur Durchführung von Brustepithelzelltransplantationen bei Ratten erleichtert dieses Verfahren die Entwicklung der Brustdrüse sowie Karzinogenesestudien. Diese Technik ist besonders wichtig für die Erforschung von Wechselwirkungen zwischen Brustkrebszellen und/oder Brustepithelzellen mit der Wirtsmikroumgebung. Es ermöglicht Studien in der Entwicklung der Brustdrüse sowie der Brustkrebsforschung.
Diejenigen, die diese Technik zum ersten Mal versuchen, sollten Spenderzellpräparate optimieren, um maximale Zellausbeute und Lebensfähigkeit zu gewährleisten, dann kleine Pilotversuche durchführen, um chirurgische Eingriffe zu praktizieren und Zellnummern zu bestimmen, um zu injizieren, und auch die für Experimente erforderlichen postoperativen Inkubationszeiten bestimmen.
