Wir verwenden die virusgenetische Sequenzierung, um zu versuchen, zu verstehen, woher Viren kommen und wie sie sich ausbreiten. Und um diese Daten in Echtzeit nutzen zu können, z. B. während eines Ausbruchs, müssen wir genau verstehen, wie genau die Daten sind, die wir bereitstellen. Die Hauptvorteile dieser Techniken sind, dass es relativ billig ist, es ist schnell, und es ermöglicht Echtzeit-Basis-Codierung, die für die In-Field-Sequenzierung verwendet werden kann.
Diese Methode kann zur zeitnahen Generierung von Sequenzdaten eingesetzt werden, die beispielsweise zur Bestimmung des Ursprungs einer Vielzahl von Krankheitserregern verwendet werden können. Diese Technik kann für Erstbenutzer komplex sein und grundlegende Unix-Kenntnisse sind erforderlich. Speziell für die Installation der verschiedenen Softwarepakete.
Die Visualisierung dieser Methode hilft Benutzern, die Fehlerrate ihrer spezifischen Sequenzierungsprotokolle zu bestimmen. Und um Forschungsfragen zu beantworten. Der Sequenzlauf wird auf einem MinION gestartet, der mit dem MinIT verbunden ist.
Nachdem Sie eine Sequenz auf der Nanopore-Plattform vorgeformt haben, laden Sie die Datenlast in Porechop. Um Eine Kontamination zu vermeiden und die Genauigkeit zu erhöhen, verwenden Sie die Require Unterstrich zwei, unterstreichen Barcodes Flag und geben Sie den Befehl wie angegeben. Verwenden Sie cutadapt nach dem Entmultiplexing, um Primersequenzen und Sequenzen mit einer Länge von weniger als 75 Nukleotiden mit dem angegebenen Befehl zu entfernen.
Verwenden Sie Minimap2, um De-Multiplex-Sequenz-Lesevorgänge mit Minimap2 dem Bedienfeld mit unterschiedlichen Referenzstämmen zuzuordnen. Und verwenden Sie Samtools, um eine Konsenssequenz zu generieren. Für referenzbasierte Ausrichtungen ist es wichtig, eine Explosion vorzuforsen und mit der generierten Konsenssequenz zu suchen, um den nächstgelegenen Referenzstamm zu identifizieren.
Wiederholen Sie dann die referenzbasierte Ausrichtung mit dem nächstgelegenen Referenzstamm als Referenz. Um die erforderliche Leseabdeckung zu ermitteln, um das Fehlerprofil in der Nanopore-Sequenzierung zu kompensieren, wählen Sie die Sequenzzuordnung zu einem Amplicon aus, und verwenden Sie Minimap2, um die Nanopore-Lesevorgänge diesem Amplicon zuzuordnen. Verwenden Sie Samtools, um nur die Lesezuordnung zu Amplicon26 auszuwählen und die bam-Datei mit den angegebenen Befehlen in fastq zu konvertieren.
Wählen Sie zufällig Teilmengen von z. B. 200 Sequenzlesevorgängen tausendmal aus. Alle zufällig ausgewählten Sequenzlesevorgänge werden an Amplicon26 ausgerichtet. Verwenden Sie KMA, um die Sequenzlesevorgänge zu zuordnen und sofort eine Konsenssequenz unter Verwendung der optimierten Einstellungen für die Nanopore-Sequenzierung zu generieren, wie durch die BC-Nanoflagge angegeben.
Um die generierten Konsenssequenzen zu überprüfen, verwenden Sie die angegebenen Befehle. Um die Fehlerrate in den Statistiken dot txt unter der Überschrift Fehlerrate Inkongruenzen Basen zugeordnet anzuzeigen, verwenden Sie den Befehl wie angegeben. Um die Anzahl der Indels anzuzeigen, wird unter der Überschrift Indels pro Zyklus der Befehl wie angegeben angezeigt.
Mit der neueren Durchflusszelle in Kombination mit dem Basisfarb-Flipflop führt eine 40-fache Leseabdeckung zu identischen Ergebnissen im Vergleich zur Illumina-Sequenzierung. Eine Leseabdeckung von 30 Mal ergibt eine Fehlerrate von 0,02%, was einem Fehler in jedem sequenzierten 585. 000 Nukleotiden entspricht. Während eine Leseabdeckung von 20 Mal zu einem Fehler in jedem 63 führt, sequenzierten 529 Nukleotide.
Eine Leseabdeckung von 10 Mal führt zu einem Fehler in jedem 3, 312 Nukleotide sequenziert. Das bedeutet, dass über 3 Nukleotide pro vier Usutu-Virusgenome als falsch bezeichnet werden. Bei einer Leseberichterstattung über 30 Mal werden keine Indels beobachtet.
Eine Leseabdeckung von 20 Mal führt zu den Erkennungen einer Indelposition, während eine Leseabdeckung von 10-mal zu Indels in 29 Positionen führt. Das Wichtigste, was Man sich merken sollte, ist, dass Updates in der Software, obwohl nicht immer offensichtlich, häufig auftreten und die Ergebnisse beeinflussen können. Es gibt mehrere Optionen von Software zu verwenden.
Wir haben die am häufigsten verwendeten Programme demonstriert. Aber verschiedene Software und verschiedene Versionen dieser Software können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Wir haben Ihnen ein Beispiel gezeigt, wie wir die Qualität der von uns generierten Sequenzdaten überprüfen.
Und das ist entscheidend für eine zuverlässige Unterstützung von Ausbrüchen.
