Das Protokoll ermöglicht die nichtinvasive und hochauflösende Darstellung und Analyse der Erwachsenen-Zebrafisch-Herzfunktion. Diese Methode kann für die Validierung von Erwachsenen-Herzkrankheitsmodellen und potenziellen Arzneimittel-Screens verwendet werden. Diese Technik ermöglicht eine schnelle Positionierung der Fische für eine korrekte Bildgebung, die genaue und reproduzierbare Ergebnisse liefert.
Es ist nicht invasiv und unter Wasser durchgeführt, was die schnelle Erholung der Fische ermöglicht. Um die Plattform für die Bildaufnahme einzurichten, verwenden Sie eine kleine Schere oder ein Skalpell, um einen Schnitt auf einem Schwamm bei 12 Uhr zu machen. Legen Sie den Schwamm in einen Glasbehälter.
Mit doppelseitigem Klebeband den Glasbehälter mit dem Schwamm auf der Ultraschallplattform anbringen. Stellen Sie sicher, dass sich der Glasbehälter in der Mitte der Plattform befindet und fest befestigt ist. Neigen Sie die Plattform etwa 30 Grad vorwärts mit dem Knopf auf der linken Seite des Plattformhalters.
Füllen Sie den Glasbehälter mit ca. 200 Milliliter Fischsystemwasser, das 0,2 Milligramm pro Milliliter Tricain-Methansulfonat enthält. Stecken Sie den Messumformer in den Mikromanipulatorhalter am Arbeitsbahnhof und drehen Sie die Kerbe des Messumformers in Richtung des Bedieners. Halten Sie das Array parallel zum Boden mit der Arbeitsseite Längsinal in Bezug auf die Bühne.
Lassen Sie auf beiden Seiten genügend Platz, damit sich das nun angeschlossene Wandlerschienensystem entlang der x- und y-Achse bewegen kann. Melden Sie sich bei der Steuerungssoftware an und wählen Sie Maus kleine Gefäße. Erstellen Sie eine neue Studie sowie eine neue Serie für jedes in der Studie induzierte Tier.
Drücken Sie die neue Studientaste auf der linken unteren Seite des Bildschirms auf der Browserseite. Die Ansicht beginnt im B-Modus. Mit einem Fischnetz die Fische in einen kleinen Tank mit Systemwasser mit 0,2 Milligramm pro Milliliter Tricain geben.
Warten Sie, bis der Fisch vollständig beästhetisiert ist, ohne Bewegung oder ohne Reaktion auf Berührung. Den Fisch vorsichtig und schnell mit dem Schwamm in den zuvor gemachten Schnitt mit der ventralen Seite des Fisches nach oben geben. Senken Sie den Messumformer vorsichtig mit dem Griff auf dem Schienensystem, das ihn längs platziert, und schließen Sie die ventrale Seite des Fisches mit der Kerbe des Messumformers, der dem Bediener zugewandt ist.
Lassen Sie zwei bis drei Millimeter Abstand von den Fischen. Passen Sie die Plattform in Bezug auf den Messumformer mit dem Mikromanipulator in allen drei Achsen an, bis das Fischherz visualisiert ist. Unmittelbar nach der Lokalisierung des Herzens, wählen oder bleiben im B-Modus und reduzieren Sie das Feld durch Zoomen in, um einen genaueren Blick auf das Herz zu erreichen.
Verbessern Sie bei Bedarf die Qualität oder den Kontrast des Bildes, indem Sie den Dynamikbereich auf 45 bis 50 Dezibel einstellen. Wechseln Sie zu den B-Modus-Steuerelementen in der Option "Mehr Steuerelemente", und speichern Sie anschließend die Änderung in modus-Presets. Tippen Sie auf Modus-Presets, um die optimierte Bildaufnahmeeinstellung jedes Mal auszuwählen, bevor Sie mit dem Abbild einer neuen Serie beginnen.
Nehmen Sie so viele Bilder auf, wie in der langen Achsenebene gewünscht. Wechseln Sie als Nächstes zu Farbdoppler für die Blutflusserkennung und -erfassung. Positionieren Sie den Quadranten über dem Atrioventrikulären Ventil über dem Touchscreen und lokalisieren Sie den Zufluss, der sich durch das rote Farbsignal auszeichnet.
Reduzieren Sie den Quadrantenbereich so weit wie möglich, um die Bildrate zu erhöhen. Aktivieren Sie die Pulswellen-Dopplerbewegung zur Probe der ventrikulären Blutzuflussgeschwindigkeit. Positionieren Sie das Probenvolumentor in der Mitte des atrioventrikulären Ventils, um die maximale Strömungsgeschwindigkeit zu erkennen.
Das rote Farbsignal wird gelblicher. Passen Sie den Pulswellenwinkel auf dem Bildschirm mit den Fingern an, damit er sich an der Richtung des Blutzuflusses ausrichtet. Drücken Sie Start oder Update, um mit der Probenahme der Geschwindigkeit des Blutes zu beginnen, das in den Ventrikel fließt.
Bestimmen Sie die Abflussgeschwindigkeit, indem Sie den Farb-Doppler-Quadranten an der Kreuzung zwischen dem Ventrikel und dem Bulbus platzieren und den Fluss lokalisieren. Dies zeichnet sich durch ein blaues Farbsignal aus. Positionieren Sie das Probenvolumentor direkt vor dem Ventrikel-Bulbus-Knoten, und passen Sie die Winkelkorrekturlinie an die Richtung des Blutflusses an.
Passen Sie die Grundlinie an, die sie im Strömungsgeschwindigkeitspanel anhebt, um die Signalspitzen vollständig zu erkennen und zu verfolgen. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, verwenden Sie einen Teelöffel und übertragen Sie die Fische in regelmäßiges System belüftetes Wasser frei von Tricain und lassen Sie die Fische erholen. Um die Erholung zu unterstützen, spritzen Sie wasser wiederholt über die Kiemen mit einer Transferpipette, um die Belüftung des Wassers und sauerstoffübertragens zu fördern.
Es dauert in der Regel 30 Sekunden bis zwei Minuten, um die Kiemenbewegung und das Schwimmen wieder aufzunehmen. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware. Wählen Sie ein Bild aus und klicken Sie auf das Bildverarbeitungssymbol.
Passen Sie Helligkeit und Kontrast des Bildes an, um eine klare Visualisierung von ventrikulären Wänden oder Blutflussmustern zu ermöglichen. Öffnen Sie mit dem B-Modus-Bild die Dropdown-Liste aus der parasternalen Langachsenoption auf den Herzpaketmessungen. Wählen Sie LV-Spuren und verfolgen Sie die ventrikuläre Innenwand bei Systole und Diastole, um den ventrikulären Bereich in Systole und Diastole und diastolischem Volumen und End-Systol-Volumen zu erhalten.
In dieser Studie ermöglichten die B-Modus-Bilder die Rückverfolgung der ventrikulären Innenwand in Systole und Diastole und die Erfassung von Dimensionsdaten wie Kammer- und Wandabmessungen. Es wurden auch funktionelle Daten wie Herzfrequenz, Schlagvolumen und Herzleistung sowie Parameter der ventrikulären systolischen Funktion einschließlich Bruchflächenänderung und Auswurffraktion gewonnen. Messungen auf Höhe des atrioventrikulären Ventils mit Farb-Doppler-Modus-Bildern lieferten auch ventrikuläre Zu- und Abfluss-Blutgeschwindigkeiten.
Basierend auf dem Pulswellen-Doppler-Bild wurde ein Herzfrequenzwert generiert, indem drei aufeinanderfolgende Aortenflussspitzen nachverfolgt wurden. Das Wichtigste ist, die Ultraschallplattform und den Fisch richtig zu positionieren, um eine genaue Bildgebung zu treffen und die Exposition der Fische gegenüber Tricain zu minimieren. Zusätzliche Methoden zur Unterstützung dieses Verfahrens sind Fischelektrokardiogramm für den schnellen Nachweis von Herzfunktionsstörungen wie Arrhythmien oder Histologie-Methoden zur Beurteilung der Herzgewebestruktur oder Zelltod.
Diese Techniken ermöglichen die Beurteilung der Herzfunktion von Zebrafischen und etablieren einen kardialen Phänotyp in Zebrafisch-Herzkrankheitsmodellen. Es ermöglicht auch, neue Medikamente zu testen, Herzverletzungen und Regenerationsfähigkeit zu studieren. Tricaine MS-222 ist ein Reizmittel für Haut, Auge und Atemwege.
Bei der Herstellung der Tricain-Lösung sollte die Schutzausrüstung eine Staubmaske, ein Augenschild und Handschuhe enthalten.
