Dieses Protokoll wurde entwickelt, um eine sehr wichtige und ungelöste Frage zu behandeln, wie mikrobielle Substanzen vorhanden und Umweltallergene die Entwicklung von allergischen Entzündungen regulieren können. Insbesondere können die hier vorgestellten Methoden helfen zu beantworten, ob doppelsträngige RNA-Arten in Hausstaubmilben in vivo immunogen sind und eosinophile Lungenentzündungen modulieren können. Die Hauptvorteile dieser Techniken sind, dass sie einfach, effizient, hoch reproduzierbar sind und mit häufig verwendeten Werkzeugen und Geräten durchgeführt werden können.
Diese Methoden können auch verwendet werden, um Lungenerkrankungen zu bewerten, die durch respiratorische Virusinfektionen verursacht werden. Li She, ein Student in meinem Labor, wird helfen, das Verfahren zu demonstrieren. Beginnen Sie mit der Isolierung der gesamten RNA von Allergenen, Insekten und Nicht-Insektenallergenen.
Eine ordentliche Menge an Proben in ein Zwei-Milliliter-Rohr mit 1,4 Millimetern Keramikperlen geben und die Rohre in einem flüssigen Stickstoffbehälter ca. 10 Minuten einfrieren. Fügen Sie jedem Rohr einen Milliliter Guanidinium-Thiocyanat-basiertes RNA-Isolationsreagenz hinzu. Dann brechen Sie das Insekt und Nicht-Insekten-Kleintiere mit einem hochenergetischen Zellstörer mit maximaler Geschwindigkeit für 45 Sekunden.
Kühlen Sie die Probe auf Eis, und wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal. Übertragen Sie die Lösung in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr. Fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform zu jedem Röhrchen hinzu und wirbeln Sie die Probe aus.
Zentrifugieren Sie die Rohre 14.000 mal g für 14 Minuten bei vier Grad Celsius. Dann die obere wässrige Phase in ein neues Rohr mit 500 Mikroliter Isopropanol übertragen. Mischen Sie die Probe.
Dann zentrifugieren Sie es bei 14.000 mal g für 14 Minuten bei vier Grad Celsius. Besaugen Sie vorsichtig den Überstand. Dann waschen Sie das RNA-Pellet mit 500 Mikrolitern 75%Ethanol und zentrifugieren Sie es bei 7, 500 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie vorsichtig alle Flüssigkeit. Das Pellet lufttrocknen und die RNA mit 20 bis 50 Mikroliter RNase-freiem Wasser auflösen. Um die doppelsträngigen RNA-Strukturen in der gesamten RNA zu detektieren, erkennen Sie zwei Mikroliter der 200-Nanogramm pro Mikroliter-RNA-Probe auf die positiv geladene Nylonmembran.
Vernetzen Sie die Proben mit der Membran bei 1, 200 Mikrojoule um 100 in einem UV-Vernetzen. Wiederholen Sie das Spotting und die Vernetzung zwei weitere Male, was zu insgesamt 1,2 Mikrogramm RNA pro Fleck führt. Unspezifische Bindung mit 5% Milch in TBS-T für eine Stunde blockieren, während bei Raumtemperatur geschüttelt wird.
Entfernen Sie dann die Blockierlösung, und fügen Sie den Anti-Doppelsträngigen RNA J2-Antikörper bei einer Verdünnung von 1 zu 1 000 in 1%Milch in TBS-T hinzu. Inkubieren Sie die Membran über Nacht mit Schütteln bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag die Membran dreimal mit TBS-T für fünf Minuten pro Wäsche waschen.
Fügen Sie den sekundären Antikörper hinzu und inkubieren Sie die Membran für eine Stunde bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie dann die Wässer mit TBS-T. Fügen Sie das Substrat hinzu, und brüten Sie die Membran für fünf bis 15 Minuten, bis ein gewünschtes Signal sichtbar ist.
Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Membran mit doppelt destilliertem Wasser abspülen. Um die Lungenproben zu sammeln, legen Sie die Lunge auf Gewebepapiere und verbrauchen ein kleines Stück von jedem Lungenlappen. Legen Sie jedes Stück in eine Zwei-Milliliter-Röhre mit Perlen.
Um bronchoalveolare Spülung zu sammeln, desinfizieren Sie eine eingeschläferte Maus mit 70% Ethanol und schneiden Sie die Haut mit einer Schere vom oberen Bereich des Bauches bis zum Hals. Ziehen Sie die Speicheldrüsen und den sternohyoiden Muskel vorsichtig mit Zangen auseinander, um die Luftröhre freizulegen. Legen Sie dann eine Nylonschnur darunter.
Machen Sie einen Schnitt in der Luftröhre etwa zwei Milliliter unter dem Kehlkopf gerade genug, um eine Kanüle einfügen, und knoten Sie die Schnur um die Luftröhre und Kanüle. Befestigen Sie eine Spritze am Ende der Kanüle und laden Sie sie mit frischem PBS-EDTA. Dann injizieren und aspirieren Sie einen Milliliter der Lösung in die Lunge.
Lösen Sie die Spritze aus der Kanüle und werfen Sie die Lösung in ein 15-Milliliter-Rohr. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um mit frischem PBS-EDTA zu eisen, und poolen Sie die Spülung. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 mal g für sieben Minuten bei vier Grad Celsius.
Dann nehmen Sie das Volumen auf und übertragen Sie den Überstand auf zwei 1,5-Milliliter-Rohre, ohne das Pellet zu stören. Nach dem Aufsetzen des Pellets 150 Mikroliter in eine 96-Well-Platte geben und die Platte sieben Minuten lang bei 500 mal g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Dann schnell die Platte auf Tissue-Papier umkehren, um den Überstand zu entfernen.
Färben Sie die Zellen mit Antikörpern im FACS-Puffer in Gegenwart von 2.4G2 blockierenden Antikörpern und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln. Nach der Färbung zentrieren Sie die Platte, um die Zellen bei 500 mal g für sieben Minuten bei vier Grad Celsius zu pellet. Entfernen Sie die Färbelösung, indem Sie die Platte auf Tissuepapier invertieren.
Fügen Sie 100 Mikroliter FACS-Puffer hinzu, um die Zellen zu waschen, und wiederholen Sie dann die Zentrifugation. Setzen Sie die Proben in 150 Mikroliter FACS-Puffer wieder auf und übertragen Sie sie dann in FACS-Rohre, die zusätzliche 350 Mikroliter Puffer enthalten. Fügen Sie 25 Mikroliter Zählperlen zu jeder Probe hinzu, und fahren Sie mit der Analyse der Durchflusszytometrie fort.
Das Vorhandensein von langen doppelsträngigen RNA-Strukturen in Hausstaubmilben, Insekten und Nicht-Insekten-Kleintieren wurde mit einem doppelsträngigen, RNA-spezifischen Mausmonoklon-Antikörper untersucht. RNase III wurde verwendet, um die doppelsträngige RNA in 12 bis 15 Basenpaarfragmente zu verdauen, die von J2 nicht nachweisbar waren. Die Fähigkeit der Hausstaubmilbe-Gesamt-RNA, eine angeborene Immunantwort in der Lungen der Maus zu stimulieren, wurde durch RT-qPCR demonstriert. Die RNase-III-Behandlung schaffte die immunstimulierende Aktivität der Hausstaubmilbe-Gesamt-RNA ab, was darauf hindeutet, dass die doppelsträngigen RNA-Strukturen für die angeborene Immunaktivität in der Lunge unerlässlich sind.
Die hemmende Wirkung der Hausstaubmilben-Gesamt-RNA auf die Entwicklung einer schweren Typ-2-Lungenentzündung wurde mit FACS-Analyse ausgewertet. Die eosinophile Lungenentzündung wurde durch Staubmilbenextrakte induziert, die mit oder ohne RNase III behandelt wurden. Der Abbau von langen doppelsträngigen RNA-Arten führte zu schweren Lungenentzündungen des Typs 2, die sich in den erhöhten Eosinophilen zahlen, wenn es um bronchoalveolare Lavage und Lunge geht.
Insbesondere ist die Anzahl der Eosinophile in der mit Derstaubmilben behandelten Gesamt-RNA-behandelten Gruppe mit der Gruppe vergleichbar, die mit dem ursprünglichen Staubmilbenextrakt behandelt wurde, der endogen die lange doppelsträngige RNA-Art enthielt. Seien Sie beim Versuch dieses Protokolls sehr vorsichtig beim Injizieren und Erinnern der BAL-Flüssigkeit, da schäden an der Lunge in diesem Stadium die Endergebnisse verändern können. Zusätzlich zu diesem Verfahren können andere Methoden wie ELISA durchgeführt werden, um nichtzelluläre lösliche Inhalte in der BAL-Flüssigkeit zu analysieren.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, andere mikrobielle Substanzen zu erforschen, die in Umweltallergenen vorkommen, wie z. B. nicht doppelsträngige RNA-Faktoren, die die Entwicklung allergischer Lungenentzündungen regulieren können.
