Name: pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
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Repräsentative Daten wurden durch das National Cancer Institute (K22CA218549 bis S.T.S) finanziert. Zusätzlich zu ihrer Unterstützung bei der Entwicklung der umfassenden Analysemethode, über die hier berichtet wird, danken wir dem Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Direktorin - Krista La Perle, DVM, PhD) für Histologie und Immunhistochemie und dem Pathology Imaging Core für die Entwicklung und Analyse von Algorithmen.

Die Tierverwendung folgte den Vorschriften der University Laboratory Animal Resources (ULAR) im Rahmen des vom OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Protokolls 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).
1. Schwanzveneninjektion von Brustkrebszellen
<ol><li>Vorbereitung von Zellen und Spritze zur Injektion<ol>
<li>Platten Sie eine geeignete Anzahl von Zellen basierend auf der Anzahl der Mäuse und der zu verwendenden Zellkonzentration. HINWEIS: Die Anzahl der injizierten Zellen und die Zeit bis zur Entwicklung von Metastasen hängen von der verwendeten Zelllinie ab und müssen optimiert werden. In dieser Demonstration werden 1 x 106 MDA-MB-231-Zellen intravenös in NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) -Mäuse injiziert, und makroskopische Lungenläsionen werden spätestens 24 Tage nach der Injektion beobachtet. Für die murine Brusttumorzelllinie MVT111 werden 3 x 106 Zellen in immunkompetente FVB/N-Mäuse injiziert, wobei zahlreiche Lungenmetastasen bis 14 Tage beobachtet wurden22,23.</li>
		<li>Medien absaugen und Zellplatten mit 1x PBS spülen. Trypsinisieren Sie Zellen in minimalem Volumen, fügen Sie ein geeignetes Medienvolumen hinzu und zählen Sie Zellen mit einem Hämatozytometer oder einer anderen bevorzugten Methode. Trypanblau (0,4%) oder andere lebende / tote Zellfarbstoffe können verwendet werden, um lebensfähige Zellzahlen zu bestimmen.</li>
		<li>Pelletzellen durch Spinnen bei 180 x g für 5 min.</li>
		<li>Resuspendieren Sie eine angemessene Anzahl von Zellen in sterile 1x PBS, so dass ein Volumen von 100 μL pro Maus injiziert wird. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.</li>
		<li>Vor der Injektion die Zellen gründlich mit einer 200 μL oder 1 ml Pipette resuspendieren, um eine Verklumpung zu vermeiden. 100 μL in einer 28 G Insulinspritze aufziehen (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Beseitigen Sie Luftblasen, indem Sie die Spritze vertikal halten, auf die Spritze klopfen und den Kolben langsam einstellen. Die Injektion von Luftblasen in die Vene verursacht wahrscheinlich eine Luft- / Gasembolie, die tödlich sein kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Seitliche Schwanzveneninjektion HINWEIS: Für experimentelle Brustkrebs-Metastasen-Assays werden Injektionen an > 6 Wochen alten weiblichen Mäusen durchgeführt.<ol>
<li>Halten Sie die Maus am Schwanz und schieben Sie das Tier in ein geschlitztes Röhrchen/Rückhaltesystem einer geeigneten Größe (siehe Materialtabelle für die verwendete Rückhalteeinrichtung).</li>
		<li>Setzen Sie den Steckerteil der Rückhaltevorrichtung ein und positionieren Sie die Maus auf der Seite, so dass ihre seitliche Schwanzvene gut sichtbar ist. Die Maus hat eine ventrale Arterie in Linie mit den Genitalien, eine dorsale Vene und zwei laterale Kaudalvenen.</li>
		<li>Reinigen Sie die Oberfläche des Schwanzes der Maus mit einem aseptischen Tuch. Fassen Sie den Schwanz zwischen Zeigefinger und Daumen mit nicht dominanter Hand und üben Sie leichte Spannung aus.</li>
		<li>Beginnend am distalen Teil des Schwanzes, führen Sie die Nadel parallel zur Vene mit dem Fasenende ein.</li>
		<li>Wenn erlaubt, rekapitulieren Sie die Nadel vorsichtig und biegen Sie sie in einen Winkel von 20-30 °. Ein Einhand-Annäherungs- oder Nadelrückgewinnungsgerät wird dringend empfohlen. HINWEIS: Es ist nicht notwendig zu aspirieren, da dies zum Kollaps der Vene führen kann. Ein kleiner Blutschnaps kann jedoch beim ersten Platzieren gesehen werden. Die Nadel wird bei richtiger Platzierung sanft in die Vene vordringen.</li>
		<li>Geben Sie langsam das gesamte Volumen in die Vene ab. Es sollte keinen Widerstand geben, wenn der Kolben gedrückt wird.</li>
		<li>Wenn ein Widerstand zu spüren ist, entfernen Sie sofort die Spritzennadel. Falls erforderlich, führen Sie die Nadel erneut ein (idealerweise nicht mehr als 3 Versuche), die sich in Richtung des proximalen Endes des Schwanzes oder der gegenüberliegenden lateralen Vene bewegt.</li>
		<li>Ein kleines Blutvolumen wird wahrscheinlich nach der Injektion verdrängt. Mit steriler Gaze sanften Druck ausüben und mit aseptischem Tuch abwischen.</li>
		<li>Entsorgen Sie die Spritze umgehend in einem geeigneten Behälter für scharfe Gegenstände.</li>
		<li>Bringen Sie die Maus in einen sauberen, belüfteten Käfig zurück und überwachen Sie sie auf Anzeichen von Stress.</li>
		<li>Überwachen Sie Mäuse 2-3x / wöchentlich auf Anzeichen von Metastasenbildung (Atemnot, gebeugte Haltung, Gewichtsverlust) und allgemeiner Belastung. Die Zeit bis zur Entwicklung der Metastasierung hängt von der Zelllinie und dem Mausstamm ab.</li>
		<li>Wenn Sie ein In-vivo-Live-Tier-Bildgebungsgerät verwenden, bilden Sie Mäuse unmittelbar nach der Schwanzveneninjektion ab, um die erfolgreiche Injektion von Zellen zu bestätigen und Zeitdaten "Null" zu erhalten (spezifische Details zur In-vivo-Biolumineszenzbildgebung sind hierin nicht enthalten, werden aber von Yang et al.24 beschrieben).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Lungengewebefixierung und Analyse der metastasierenden Lungentumorbelastung
<ol><li>Lungengewebeaufblähung zur Aufrechterhaltung des Strukturformats der Lunge für die Histopathologie<ol>
<li>Nachdem genehmigte Euthanasieverfahren (z.B. Kohlendioxid bei 30 - 70% Verschiebung des Kammervolumens/min) befolgt wurden, befestigen Sie den Mauskadaver mit Stiften an einer Seziertafel. Sprühen oder tragen Sie 70% Ethanol auf, um das Fell der Maus während der Dissektion aus dem Weg zu halten. HINWEIS: Kohlendioxiderstickung kann Lungenblutungen als erwartete Hintergrundläsion verursachen, insbesondere bei langsameren Flussraten.</li>
		<li>Öffnen Sie den Thorax mit einem Mittellinienschnitt, strecken Sie den Schnitt kranial / kaudal durch das Peritoneum und schneiden Sie das Zwerchfell weg, indem Sie den Xyphoidfortsatz greifen.</li>
		<li>Verwenden Sie eine separate Schere, um die Klingen nicht abzustumpfen, schneiden Sie die Rippen entlang jeder Seite des Brustbeins ab und entfernen Sie vorsichtig den Brustkorb, damit sich die Lunge ausdehnen kann.</li>
		<li>Isolieren Sie die Luftröhre, indem Sie submandibuläre Speicheldrüsen und infrahyoidale Muskulatur entfernen. Das Platzieren von Stiften auf beiden Seiten der Luftröhre kann unerwünschte Bewegungen während des Einführens der Nadel verhindern.</li>
		<li>Füllen Sie eine 26 G Spritze mit 2-3 ml 10% neutralem gepuffertem Formalin und geben Sie sie in die Luftröhre.</li>
		<li>Injizieren Sie langsam Formalin und achten Sie darauf, dass sich die Lunge ausdehnt (erfordert normalerweise ~ 1,5 ml Formalin).</li>
		<li>Sobald Formalin aus der Lunge austritt (übermäßiges Aufblasen vermeiden), drücken Sie die Luftröhre mit einer Pinzette ab, entfernen Sie die Spritzennadel und lösen Sie den gesamten Atemweg. Legen Sie Lunge, Herz usw. direkt in Formalin, da ein zusätzliches Trimmen des Gewebes nach der Fixierung erfolgen kann.</li>
		<li>Komplette Verarbeitung, Einbettung, Schnitt des Gewebes und Hämatoxylin- und Eosin (H & E) -Färbung mit Standardmethoden.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse der metastasierenden Lungentumorbelastung<ol>
<li>Scannen Sie H&E-gefärbte Lungenschnitte auf einem hochauflösenden Diascanner mit 40-facher Vergrößerung (Abbildung 3).</li>
		<li>Importieren Sie Bilder in bildanalytische Software (z.B. Visiopharm Image Analysis) zur Quantifizierung von Lungenmetastasen. HINWEIS: Wir empfehlen neuen Benutzern, entweder eine Vor-Ort- oder Online-Schulung zur Verwendung der Bildanalysesoftware zu erhalten. Zahlreiche Webinare sind auch über die kommerzielle Webseite verfügbar.</li>
		<li>Wählen Sie die Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis App aus der App-Bibliothek der Software aus. HINWEIS: Der Zweck dieser App ist es, Lungenmetastasen auf H & E-gefärbten Objektträgern zu kennzeichnen und zu quantifizieren. Im Rahmen der 10118 H&E Lung Metastasis App segmentiert der erste Bildverarbeitungsschritt das Lungengewebe mit der Tissue Detection App. Der zweite Bildverarbeitungsschritt nutzt die Metastasis Detect App, die die Metastasen im Lungengewebe identifiziert. Metastasen werden über die Form identifiziert, zusammen mit Regionen, die entweder zu unförmig, zu rot oder zu spärlich sind, um als Metastasen identifiziert zu werden.</li>
		<li>Passen Sie die Parameter, die Form und Kargheit definieren, an repräsentative Bilder an. Segmentierte Bereiche von Tumormetastasen und normalem Lungengewebe können mit unterschiedlichen Farbmarkierungen für jeden Gewebetyp dargestellt werden. HINWEIS: Für den Fall, dass die App Metastasen nicht genau vom normalen Lungengewebe trennen kann, muss möglicherweise eine benutzerdefinierte App mit dem Visiopharm Decision Forest-Programm geschrieben werden, wie es für die Experimente getan wurde (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3). Details zum Schreiben eines benutzerdefinierten Algorithmus folgen unten. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 2.2.9 fort.</li>
		<li>Öffnen Sie das Decision Forest-Programm, das funktioniert, indem sie mehrere Klassen [z. B. Lungengewebe (nicht neoplastisch), Metastasen, rote Blutkörperchen, Epithel und / oder Leerraum] auf einem gewünschten Bild trainieren. In Abbildung 2 sind Tumormetastasen blau, normales Gewebe grün und bronchiolares Epithel gelb. Auch rote Blutkörperchen sind in rot und Lufträume in rosa.</li>
		<li>Befolgen Sie die aufgeforderte Reihe von Ja- oder Nein-Fragen, um jede Klasse für ein Bild entsprechend zu trainieren. Die Genauigkeit des Algorithmus bestimmt die Anzahl der Ja/Nein-Fragen. Für die Analyse wurde der benutzerdefinierte Algorithmus/die App mit einer Genauigkeit von 50 (Bereich 0-100) geschrieben.</li>
		<li>Passen Sie Features für jede Klasse an, indem Sie Filter zum Schärfen, Verwischen, Sortieren nach Form usw. anwenden, um die Genauigkeit des Algorithmus / der App zu verbessern. Visiopharm zeigt jede Klasse durch eine oder mehrere Linsen an, die als Features bezeichnet werden. Features ändern, wie die Klasse das Bild sieht, um bestimmte Farben oder Intensitäten hervorzuheben. HINWEIS: Für den benutzerdefinierten Algorithmus werden Metastasen mit einer Größe von 8500 μm2 und mehr als Metastasen markiert und gemessen. Dies erklärt Größenvarianzen und Metastasen, die zu klein sind, um sie zu erkennen. Kleine unförmige Bereiche und kleine metastatische Bereiche unter 8500 μm2 wurden in die normale Gewebequantifizierung einbezogen.</li>
		<li>Speichern Sie die geänderten Einstellungen entweder in der App oder im benutzerdefinierten Algorithmus und wenden Sie dann den Algorithmus / die App auf einen ganzen Satz oder eine Reihe von H & E-gefärbten Geweben an.</li>
		<li>Exportieren Sie schließlich alle Ausgabevariablen, einschließlich der in Tabelle 1 aufgeführten Variablen. Die Fläche in Mikrometern zum Quadrat (μm2) kann für jeden Gewebetyp quantifiziert werden, und die Prozentsätze werden aus der gesamten Nettogewebefläche der Probe (d. H. Gesamtgewebe minus Luftraum) abgeleitet.</li>
		<li>Wenn Sie einen benutzerdefinierten Algorithmus erstellen, überprüfen Sie die Gewebemarkierungen in Absprache mit einem vom American College of Veterinary Pathologists zertifizierten Veterinärpathologen, um genaue Messungen sicherzustellen und zwischen Gewebetypen zu unterscheiden.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method.">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).</li><li>Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+for+treating+brain+metastases+from+breast+cancer.">Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer.</a> Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist.">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li><li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Microscopy,+Image+Analysis,+and+Virtual+Slide+Repository.">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Da die Forscher weiterhin die intravenöse Injektion von Tumorzellen als experimentelles Modell für die Metastasierung verwenden, fehlen Standardpraktiken zur Analyse der resultierenden metastasierenden Tumorbelastung. In einigen Fällen können signifikante Unterschiede in der metastasierenden Tumorbelastung bei Manipulation bestimmter Zelllinien und/oder Verwendung chemischer Verbindungen makroskopisch beobachtet werden. In anderen Fällen können jedoch subtile Unterschiede in der metastatischen Aussaat und im Wachst...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.

Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Obwohl es sich um einen hochkomplexen und ineffizienten Prozess1 handelt, trägt die Metastasierung wesentlich zur Morbidität und Mortalität von Krebspatienten bei2. Tatsächlich werden die meisten krebsbedingten Todesfälle auf die metastasierende Ausbreitung der Krankheit zurückgeführt3,4. Damit Tumorzellen erfolgreich metastasieren können, müssen sie sich von der primären Stelle lösen, durch angrenzendes Stroma eindringen, in den Blutkreislauf oder die Lymphgefäße intravasieren, zum Kapillarbett einer sekundären Stelle wandern, in das Sekundärgewebe extravasieren und sich vermehren oder wachsen, um metastasierende Läsionen zu bilden5. Die Verwendung von Mausmodellen war entscheidend für das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für metastatische Aussaat und Wachstum verantwortlich sind6,7. Dabei konzentrieren wir uns auf die Metastasierung von Brustkrebs, für die häufig sowohl gentechnisch veränderte Mausmodelle als auch Transplantationsmethoden eingesetzt werden – jede mit ihren eigenen Vorteilen und Einschränkungen.
Gentechnisch veränderte Brusttumormodelle nutzen brustdrüsenspezifische Promotoren, einschließlich MMTV-LTR (Mouse Mammary Tumor Virus Long Terminal Repeat) und WAP (Whey Acidic Protein), um die Expression von Transgenen im Brustepithel zu steuern8. Onkogene einschließlich Polyom mittleres T-Antigen (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 und Affenvirus 40 (SV40) wurden auf diese Weise exprimiert9,10, 11, 12, 13, und während diese genetischen Modelle für die Untersuchung der Primärtumorinitiation und -progression nützlich sind, metastasieren nur wenige leicht in entfernte Organe. Darüber hinaus sind diese genetischen Mausmodelle oft zeit- und kostenintensiver als spontane oder experimentelle Metastasierungsmodelle. Angesichts der Beschränkung der meisten gentechnisch veränderten Brusttumormodelle auf die Untersuchung von Metastasen sind Transplantationstechniken zu attraktiven Methoden geworden, um diesen komplexen Prozess zu untersuchen. Dazu gehören orthotope, Schwanzvenen-, intrakardiale und intrakranielle Injektion geeigneter Zelllinien.
Obwohl mehrere Brustkrebszelllinien nach orthotopischer Injektion in das Brustfettpolster leicht metastasieren14,15, kann die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der metastasierenden Tumorbelastung eine Herausforderung darstellen, und die Dauer solcher Studien kann in der Größenordnung von mehreren Monaten liegen. Insbesondere zur Beurteilung der Lungenmetastasierung ist die intravenöse Injektion in die Schwanzvene oft eine reproduzierbarere und zeiteffektivere Methode, wobei die metastatische Ausbreitung typischerweise innerhalb weniger Wochen auftritt. Da das intravenöse Injektionsmodell jedoch die ersten Schritte der metastatischen Kaskade umgeht, ist bei der Interpretation der Ergebnisse dieser Studien Vorsicht geboten. In dieser Demonstration zeigen wir die Schwanzveneninjektion von Brusttumorzellen zusammen mit einer genauen und umfassenden Analysemethode.
Obwohl die Forschungsgemeinschaft erhebliche Fortschritte beim Verständnis des komplexen Prozesses der Brustkrebsmetastasierung gemacht hat, wird geschätzt, dass derzeit über 150.000 Frauen an metastasierendem Brustkrebs leiden16. Von den Patienten mit Brustkrebs im Stadium IV haben >36% der Patientinnen Lungenmetastasen17; Das ortsspezifische Muster und die Inzidenz von Metastasen können jedoch je nach molekularem Subtyp variieren18,19,20,21. Patientinnen mit Brustkrebs-assoziierten Lungenmetastasen haben ein medianes Überleben von nur 21 Monaten, was die Notwendigkeit unterstreicht, wirksame Behandlungen und neuartige Biomarker für diese Krankheit zu identifizieren17. Die Verwendung experimenteller Metastasierungsmodelle, einschließlich der intravenösen Injektion von Tumorzellen, wird unser Wissen über diese wichtige klinische Herausforderung weiter voranbringen. In Kombination mit der digitalen Bildgebungspathologie und der in diesem Protokoll beschriebenen Methode der metastasierenden Lungentumorlastanalyse sind Schwanzveneninjektionen ein wertvolles Werkzeug für die Brustkrebsmetastasenforschung.

<table><tbody><tr><td>alcohol prep pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td>&lt;strong&gt;for cleaning tail prior to injection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>dissection scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td>&lt;strong&gt;for mouse dissection and lung tissue inflation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td>cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td><td>used for resuspending tumor cells for injection</td></tr><tr><td>ethanol (70 % solution)</td><td>OSU</td><td></td><td>used to minimize mouse&#039;s fur during dissection; use caution - flammable</td></tr><tr><td>Evan&#039;s blue dye</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td>cell culture media additive; used at 10% in DMEM</td></tr><tr><td>forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-270</td><td>for dissection and lung tissue inflation</td></tr><tr><td>FVB/NJ mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td>syngeneic mouse strain for MVT1 cells</td></tr><tr><td>hemacytometer (Bright-Line)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z359629</td><td>for use in cell culture to obtain cell counts</td></tr><tr><td>insulin syringe (28 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td>for tail-vein injections (BD 329424)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>human breast cancer cell line</td></tr><tr><td>MVT1 cells</td><td></td><td></td><td>mouse mammary tumor cells</td></tr><tr><td>needles (26 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-15</td><td>used to inflate the mouse&#039;s lungs</td></tr><tr><td>neutral buffered formalin (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245685</td><td>used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent</td></tr><tr><td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin 100x</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>cell culture media additive</td></tr><tr><td>sterile gauze</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9379092</td><td>for applying pressue to mouse&#039;s tail if bleeding occurs</td></tr><tr><td>syringe (5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>used to inflate mouse lung tissue</td></tr><tr><td>tail-vein restrainer</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td><td>used to restrain mouse for tail-vein injections</td></tr><tr><td>Trypan blue (0.4 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>used in cell culture to assess viability</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25 %</td><td>ThermoFisher</td><td>25200-114</td><td>used in cell culture to detach tumor cells from plate</td></tr></tbody></table>

pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells

Metastasen, die Hauptursache für Morbidität und Mortalität bei den meisten Krebspatienten, können bei Mäusen präklinisch zu modellieren sein. Es stehen nur wenige spontane Metastasenmodelle zur Verfügung. Somit ist das experimentelle Metastasenmodell mit Tail-Vein-Injektion geeigneter Zelllinien eine tragende Säule der Metastasenforschung. Wenn Krebszellen in die laterale Schwanzvene injiziert werden, ist die Lunge ihr bevorzugter Ort der Kolonisation. Eine mögliche Einschränkung dieser Technik ist die genaue Quantifizierung der metastasierenden Lungentumorbelastung. Während einige Forscher Makrometastasen einer vordefinierten Größe zählen und / oder Mikrometastasen nach dem Schneiden des Gewebes einschließen, bestimmen andere den Bereich der metastatischen Läsionen relativ zum normalen Gewebebereich. Beide Quantifizierungsmethoden können äußerst schwierig sein, wenn die metastatische Belastung hoch ist. Hierin demonstrieren wir ein intravenöses Injektionsmodell der Lungenmetastasierung, gefolgt von einer fortschrittlichen Methode zur Quantifizierung der metastasierenden Tumorbelastung unter Verwendung von Bildanalysesoftware. Dieser Prozess ermöglicht die Untersuchung mehrerer Endpunktparameter, einschließlich der durchschnittlichen Metastasengröße, der Gesamtzahl der Metastasen und des gesamten Metastasenbereichs, um eine umfassende Analyse zu ermöglichen. Darüber hinaus wurde diese Methode von einem Veterinärpathologen überprüft, der vom American College of Veterinary Pathologists (SEK) zertifiziert wurde, um die Genauigkeit zu gewährleisten.

Wenn nicht markierte Zellen für die Injektion von Schwanzvenen verwendet werden, kann es schwierig sein, die Lungenkolonisation bis (1) zum Zeitpunkt der Nekropsie zu bestätigen, wenn Makrometastasen beobachtet werden können, oder (2) nach einer histologischen Analyse, wenn mikroskopische Metastasen vorliegen. Bei ausgedehnter metastasierender Lungentumorbelastung haben Mäuse Atembeschwerden. Wie bei jeder Tumorstudie sollten Mäuse während der gesamten Studiendauer sorgfältig überwacht werden. Die Verwendung von ...

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Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Die intravenöse Injektion von Krebszellen wird häufig in der Metastasenforschung eingesetzt, aber die metastasierende Tumorbelastung kann schwer zu analysieren sein. Hierin demonstrieren wir ein Schwanzvenen-Injektionsmodell der Metastasierung und beinhalten einen neuartigen Ansatz zur Analyse der resultierenden metastasierenden Lungentumorbelastung.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.8K Aufrufe.  The Ohio State University Medical Center. Die intravenöse Injektion von Krebszellen wird häufig in der Metastasenforschung eingesetzt, aber die metastasierende Tumorbelastung kann schwer zu analysieren sein. Hierin demonstrieren wir ein Schwanzvenen-Injektionsmodell der Metastasierung und beinhalten einen neuartigen Ansatz zur Analyse der resultierenden metastasierenden Lungentumorbelastung.

Serie: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Lung Tumor Zelle Rekrutierung Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Forschung

Krebsforschung

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Experimentelle Metastase Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Medizin

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Orthotopen Injektion von Brustkrebs-Zellen in den Mäusen Mamma Fettlappen

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Die Injektion von syngenen murinen Melanomzellen ihre metastatische Potential in der Lunge zu bestimmen

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Zusammenfassung

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