A.J.C, J.A.T und I.L bestätigen Förderung durch die Europäische Kommission über horizon 2020 Projekt ACEnano (Grant No. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z erkennt Promotionsförderung durch den China Scholarship Council (CSC, Nr. 201507060011) an. R.R. erkennt die finanzielle Unterstützung des Vidi-Zuschussprogramms der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO Vidi 723.0160330) an.

Die Verwendung von Humanbiofluid wurde gemäß den IRB-Protokollrichtlinien der Universität Leiden und der Medizinischen Universität Innsbruck genehmigt. Wenn menschliche oder tierische Biofluide untersucht werden, ist eine ethische Genehmigung der Forschungseinrichtung erforderlich, die im Falle der in diesem Protokoll gezeigten Ergebnisse eingeholt wurde. Darüber hinaus sollte auch eine angemessene Berichterstattung durchgeführt werden, um Transparenz und Wiederverwendbarkeit der Daten inkünftigenArbeiten zu gewährleisten9,29,30.
1. Herstellung von Hintergrundelektrolyten (BGE)
HINWEIS: Alle Lösungsmittel sollten in einem geeigneten Abzug vorbereitet werden und für alle Schritte muss eine angemessene persönliche Schutzausrüstung verwendet werden (Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille). In jedem Schritt sind niedrig bindende Kunststofffläschchen erforderlich, um den Analytverlust und die Kontamination der Probe mit Salzen, die aus Glaswaren ausgelaucht werden, zu minimieren.
<ol><li>Bereiten Sie täglich 10% Essigsäure BGE (v / v), pH 2,2 für die Metabolomik vor.<ol>
<li>In einen 10-ml-Messkolben werden 1 ml Essigsäure hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von entionisiertem (DI) Wasser zur markierten Linie und einer gründlichen Mischung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mM Essigsäure, pH 2,9 täglich für die Proteomik vor.<ol>
<li>In einen 10-ml-Messkolben werden 57 μL Essigsäure hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von DI-Wasser zur markierten Linie und dem gründlichen Mischen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NM-Vorbereitung
<ol><li>NMs anhand der veröffentlichten Richtlinien31 , 32,33kräftig in Wasser verteilen. HINWEIS: Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden 7 NMs wie folgt verwendet: 100 und 1.000 nm carboxyliertes Polystyrol wurden für Protein- bzw. Metabolitenkorona verwendet. 100 nm unmodifizierte Polystyrol-NMs, 13 nm Anatas-TiO2-NMs, die unverändert oder mit Polyacrylat- oder PVP-Polymeren beschichtet waren, und 22 nm unmodifizierte SiO2-NMs wurden sowohl für Protein- als auch für Metabolitenkoronen verwendet. Während die Methode mit diesen NMs entwickelt und demonstriert wurde, sollte beachtet werden, dass dieser Ansatz für eine Vielzahl von NM-Zusammensetzungen, -Größen, -Formen und -Morphologien anwendbar wäre.</li>
	<li>Charakterisierung der Partikelgröße entweder mit dynamischer Lichtstreuung34,35, Einzelpartikel-induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie36, Nanopartikel-Tracking-Analyse37oder Transmissionselektronenmikroskopie und Oberflächenladung als Zetapotential mit einem Zeta-Sizer34.</li>
</ol>3. Biomolekulare Koronabildung
<ol><li>Teilen Sie 2 ml menschliches Plasma (oder Biofluid ihrer Wahl) in 1 ml Aliquoten, eines für den Metaboliten und die Proteinkorona und das zweite für die Plasmametabolomcharakterisierung.</li>
	<li>1 mg/ml NMs im menschlichen Plasma für 1 h bei 37 °C inkubieren, während sie bei 500 U/min in einem Thermomixer sanft gemischt werden. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C, um die NMs zu pelletieren.</li>
	<li>Sammeln Sie den Plasmaüberstand für die Metabolitenkoronaanalyse. Behalten Sie den NM-Protein-Korona-Komplex für die Proteinkorona-Charakterisierung bei.</li>
</ol>4. Protein-Korona-Isolierung
<ol><li>Den NM-Proteinkomplex (das Pellet) in 1 ml 10x PBS Buffer und Wirbel kräftig für 2 min resuspendieren, um ungebundene Proteine zu entfernen. Zentrifugieren Sie die PBS-Lösung bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C, um die NMs zu pelletieren, und entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Das Pellet in 1 ml Ammoniumbicarbonatpuffer (ABC) (100 mM, pH 8,0) und Wirbel kräftig für 2 min resuspendieren, um ungebundene Proteine und unerwünschte Salze zu entfernen. Zentrifuge bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C, um die NMs zu pelletieren; Entfernen und verwerfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
	<li>Reduzieren Sie Proteindisulfidbindungen, indem Sie das NM-Proteinpellet in 20 μL ABC-Puffer (100 mM pH 8) mit 10 mM Dithiotherit auflösen. Inkubieren Sie die Reduktionslösung für 30 min bei 56 °C.</li>
	<li>Um Proteine zu verdauen, fügen Sie 2 μg Trypsin in Sequenzierungsgrad zu 20 μL ABC hinzu, das 0,1% Tensid enthält. Inkubieren Sie die Fermentlösung für 16 h bei 37 °C.</li>
	<li>Alkylieren Sie die Probe durch Zugabe von 20 μL Jodoacetamid bei 55 mM in 100 mM ABC und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 20 min.</li>
	<li>Fügen Sie 20 μL von 0,1 M HCl hinzu, um das Tensid zu spalten, und lassen Sie es 10 minuten bei Raumtemperatur stehen.</li>
	<li>Anreichern und Entsalzen von Peptiden mit einer C18-verpackten Entsalzungspipettenspitze.<ol>
<li>Die Spitze mit 80 μL 0,1% Ameisensäure 50% Acetonitril 5 mal befeuchten, mit 80 μL 0,1% Ameisensäure 5 mal reinigen, Probe 10 mal ziehen und eluieren, Probe durch Spülen von 80 μL 0,1 % Ameisensäure 5 mal entsalzen und die Probe 2 mal mit 80 μL 0,1% Ameisensäure 70% Acetonitril in ein sauberes, niedrig bindendes PCR-Röhrchen eluieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Proben lyophilisieren und bis zur Analyse bei -20 °C lagern.</li>
</ol>5. Metaboliten-Korona-Isolierung
<ol><li>Nehmen Sie das Kontrollplasma und den Überstand aus der NM-Plasmainkubation aus Schritt 3.3 und halten Sie es während der Probenvorbereitung auf Eis.</li>
	<li>Nehmen Sie jeweils 50 μL in separate Durchstechflaschen und verdünnen Sie 1 zu 10 mit DI-Wasser. Nehmen Sie 50 μL jeder verdünnten Probe und wechseln Sie zu neuen Durchstechflaschen für Schritt 5.3.</li>
	<li>200 μL Chloroform, 250 μL Methanol und 350 μL DI-Wasser und kräftige Wirbelmischung für 2 min hinzufügen. Zentrifuge für 10 min bei 20.800 x g bei 4 °C.</li>
	<li>Nehmen Sie 500 μL Überstand und filtern Sie durch einen 3 kDa Zentrifugalfilter für 2 h bei 10.000 x g bei 4 °C. Nehmen Sie 430 μL Ultrafiltrat und trocknen Sie sie in einem Geschwindigkeitssauger. Proben können nun vor der Analyse eingefroren werden.</li>
</ol>6. Vorbereitung des CESI-MS-Systems38
HINWEIS: Überprüfen Sie vor der Installation der Kapillaren, ob der Einlass und das Auslassende der Kapillaren intakt sind und dass keine sichtbaren Brüche in der Kapillare vorhanden sind.
<ol><li>Installation einer neutral beschichteten Kapillare zur Proteinkoronaanalyse39.<ol>
<li>Legen Sie eine neue neutral beschichtete Kapillare (90 cm Länge mit 30 μm Innendurchmesser) gemäß den Herstellerrichtlinien in das CESI-Gerät.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von CESI-Kapillaren für die proteomische Analyse.<ol>
<li>Spülen Sie die Trennkapillar in Vorwärtsrichtung mit 100 mM HCl für 5 min bei 100 psi und überprüfen Sie die Tröpfchenbildung am Auslass der Kapillare. Spülung der Trennkapillare mit BGE bei 100 psi für 10 min und dann DI-Wasser bei 100 psi für 30 min (dies ist nur für neue Kapillaren erforderlich).</li>
		<li>Spülen Sie sowohl die Trennkapillar als auch die leitfähige Kapillare mit BGE bei 90 psi für 5 min und stellen Sie sicher, dass sich Tröpfchen am Auslassende beider Kapillaren bilden.</li>
		<li>Spülen Sie die Trennkapillare mit DI-Wasser bei 90 psi für 10 min, dann 50 psi für 10 min mit 0,1 M HCl, gefolgt von 90 psi für 10 min mit DI-Wasser und schließlich BGE bei 90 psi für 10 min. Koppeln Sie CESI mit dem MS mit einer Nanospray-Quelle und einem Adapter, wie zuvor beschrieben38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installation von blanker Quarzglaskapillare zur Metabolitenkoronacharakterisierung38.<ol>
<li>Legen Sie eine neue blanke Quarzglaskapillare (90 cm Länge mit einem Innendurchmesser von 30 μm) gemäß den Herstellerrichtlinien in das CESI-Gerät ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von CESI-Kapillaren für die Metabolomik-Analyse.<ol>
<li>Spülen Sie die Trennkapillar in Vorwärtsrichtung mit 100% MeOH bei 50 psi für 15 min und überprüfen Sie die Tröpfchenbildung am Auslass der Kapillare. Spülen Sie sowohl die Trennkapillar als auch die leitfähige Kapillare mit BGE bei 90 psi für 5 min und stellen Sie sicher, dass sich Tröpfchen am Auslass beider Kapillaren bilden.</li>
		<li>Spülen Sie die Trennkapillare mit DI-Wasser bei 90 psi für 10 min, dann 50 psi für 10 min mit 0,1 M NaOH, gefolgt von 90 psi für 10 min mit DI-Wasser und schließlich BGE bei 90 psi für 10 min. Koppeln Sie CESI mit dem ESI-MS mithilfe einer Nanospray-Quelle und eines Adapters, wie zuvor beschrieben. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS für die Proteinkoronaanalyse
<ol><li>Proben aus Schritt 4.8 in 20 μL von 50 mM Ammoniumacetat pH 4.0 resuspendieren.</li>
	<li>Führen Sie 5 psi 10 s hydrodynamische Injektion der Probe durch. Getrennt mit einer 30 kV Trennspannung mit folgendem Druckgradienten: 0-10 min bei 1 psi, 10-35 min bei 1,5 psi und 35-45 min bei 5 psi mit 100 mM, pH 2,9 Essigsäure als BGE.</li>
	<li>Sammeln Sie Massenspektren zwischen 250-2000 m/z mit Top-10-Daten, die von der Fragmentierung abhängig sind.</li>
	<li>Zwischen den Proben die Kapillare mit 0,1 M HCl für 3 min bei 100 psi und 10 min 100 psi BGE für die Trennkapillare und für 3 min bei 100 psi für die leitfähige flüssige Kapillare ausspülen.</li>
</ol>8. CESI-MS für die Metaboliten-Korona-Analyse
HINWEIS: Alle Proben müssen zweimal analysiert werden, einmal im positiven Modus für den Nachweis von Kationen und einmal im negativen Modus für den Nachweis von Anionen. Die Kontrollplasmaproben müssen mindestens 5 Mal analysiert werden.
<ol><li>NM-exponierte und nicht exponierte Plasmaproben aus Schritt 5.4 in 430 μL DI-Wasser und kräftigem Wirbel für 2 min resuspendieren. Filtern Sie durch einen 0,1 μm Membranfilter.</li>
	<li>Nehmen Sie 95 μL Filtrat und fügen Sie 5 μL interne Standards bei 200 μM für Kationen (L-Methioninsulfon) und 400 μM für Anionen (2,2,4,4-D4-Zitronensäure) und Wirbel kräftig hinzu. Zentrifuge bei 4.000 x g bei 4 °C für 10 min vor der CESI-MS-Analyse.</li>
	<li>Die Probe hydrodynamisch für 30 s (Kationen) und 40 s (Anionen) bei 2 psi injizieren.</li>
	<li>Trennen Sie Metaboliten in 10% Essigsäure mit einer Trennspannung von 30 kV im Vorwärts- (Kationen) und Rückwärtsmodus (Anionen). Der umgekehrte Trennmodus wird mit einem Vorwärtsdruck von 0,5 psi auf die Trennkapillare unterstützt.</li>
	<li>Stellen Sie das Massenspektrometer ein, um Daten im positiven (Kationen) oder negativen (Anionen) Modus über den Massenbereich von 65-1000 m / z zu sammeln. Zwischen den Proben Die Kapillare mit 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI-Wasser und BGE bei 50 psi für 2 min abspülen.</li>
</ol>

J.A.T ist ein Mitarbeiter von AB Sciex UK Ltd, der als Industriepartner am ACEnano-Projekt teilnimmt, J.A.T und alle anderen Autoren haben keinen Interessenkonflikt in dieser Arbeit.

Dies ist die erste Methode, die vorgeschlagen wird, um die vollständige biomolekulare Korona mit Proteinen und Metaboliten aus derselben Probe mit CESI-MS zu charakterisieren. Die Fähigkeit, sowohl die Proteine als auch die Metaboliten aus derselben Probe zu charakterisieren, wird die Datenmenge, die aus einer einzigen experimentellen Exposition gesammelt wird, signifikant erhöhen und neue Einblicke in den Prozess der Koronabildung und ihre Auswirkungen auf die Toxizität und Wirksamkeit von NMs als Nanoarzneimittel ermöglichen. Darüber hinaus ist CESI-MS eine ideale Plattform, um beide Klassen von Biomolekülen mit nur einer Erforderlichen Kapillarveränderung zu charakterisieren. Neue Methoden, die für nicht-wässriges CE entwickelt wurden, werden es ermöglichen, Lipidomik mit CE-MS40 durchzuführen, so dass es jetzt möglich ist, Proteine, Metaboliten und Lipide mit einer einzigen Plattform zu analysieren. Die derzeitigen konventionellen Ansätze würden zwei dedizierte LC-MS-Plattformen erfordern, eine für die Proteinkorona und eine für den Metaboliten Korona. Somit kann dieser Ansatz doppelt so viele Daten mit einer einzigen Analyseplattform sammeln.
Es gibt einige Vorbehalte gegen diesen Ansatz, insbesondere mit dem Metaboliten Corona, da dieses Protokoll eine indirekte Messung der Korona vorschlägt. Daher kann ein Problem auftreten, wenn die Metabolitenspiegel in hohen Konzentrationen relativ zu den NMs vorhanden sind und der anschließende Abfall der Metabolitenkonzentration in der Matrix gering ist. Anders als bei der Proteinkorona ist es jedoch unwahrscheinlich, dass ein "one size fits all" -Ansatz zur Isolierung der Metabolitenkorona entwickelt wird, da jede NM über eine einzigartige Oberflächenchemie verfügt. In Zukunft ist es jedoch wahrscheinlicher, dass NM-spezifische Ansätze zur Isolierung des Metaboliten Corona entwickelt und validiert werden; Dies gilt nur für diesen spezifischen NM. Trotzdem wird das CESI-MS weiterhin eine sehr geeignete Plattform für die Charakterisierung der polar geladenen Metaboliten sein, unabhängig davon, wie sie isoliert werden. Bemerkenswert ist auch, dass, wenn sich während der Zentrifugationsschritte, die zur Pelletierung der NMs bestimmt sind, kein Pellet bildet, eine höhere Zentrifugalkraft erforderlich sein kann; Dies tritt am ehesten bei weniger dichten NMs auf. Es ist auch wichtig, dass alle Filterschritte innerhalb des Protokolls eingehalten werden, da die Kapillaren durch die enge Bohrung der Kapillaren leicht blockiert werden können, wenn Partikel nicht ausreichend aus der Probe entfernt wurden.
Während das Protein Corona seit einigen Jahren ein intensives Forschungsgebiet ist, ist die Fähigkeit, dies mit dem Metaboliten Corona zu kombinieren, ein neues Interessengebiet fürWissenschaftler,die die Bio-Nano-Grenzflächeuntersuchen 6,14. Bisher konzentrierte sich die Mehrzahl dieser Studien auf die unpolare Lipidfraktion des Metaboliten Korona9,28. Diese aktuelle Methode ermöglicht die Charakterisierung der hochpolaren und geladenen Metaboliten in der Korona, zu denen wichtige Metaboliten gehören, die am Energiestoffwechsel, der Glykolyse und der DNA-Synthese beteiligt sind. Dadurch ist in Kombination mit dem Proteomik-Workflow eine ganzheitlichere Charakterisierung der biomolekularen Korona möglich. Dies ermöglicht eine eingehendere Analyse von Bio-Nano-Wechselwirkungen. Diese Methode ermöglicht verbesserte mechanistische Einblicke in die rezeptorvermittelte Endozytose über Protein- und Metaboliteninteraktionen mit Membranrezeptoren. Weiterhin können inter- und intrakoronale Wechselwirkungen zwischen Proteinen und kleinen Molekülen untersucht werden; So konnte kürzlich gezeigt werden, dass die Proteine in der Korona eine Schlüsselrolle bei der Rekrutierung von Metaboliten spielen15. Es ist erwähnenswert, dass die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 3 und Abbildung 4 eine absolute Quantifizierung von Metaboliten sind, jedoch würde ein ungezielter Ansatz mit multivariater Datenanalyse zum Vergleich aller CE-MS-Merkmale in Kontrollen im Vergleich zu exponiertem Plasma auch die Metabolitenbindung aufklären. Daher gibt es einen erheblichen Spielraum zu untersuchen, wie und welche Metaboliten und Proteine ihre jeweilige Rekrutierung in NM-Coronas beeinflussen. Diese zusätzlichen Studien können dazu beitragen, Coronas zu entwerfen, um die Verabreichung von Nanoarzneimitteln zu optimieren oder weitere Hürden für ihre Entwicklung aufzudecken, wie die Unterdrückung der pharmazeutischen Wirkung aufgrund der biomolekularen Koronablockierung oder maskierenden Targeting-Funktionalitäten.
CESI-MS mit seinen Nano-Durchflussraten von etwa 20 nL / min und dem minimalen Einsatz organischer Lösungsmittel bietet eine Verbesserung der grünen und wirtschaftlichen Referenzen gegenüber Standard-LC-MS und NanoLC-MS in Bezug auf den Lösungsmitteleinsatz, die größten Herausforderungen für Metabolomik- bzw. Proteomik-Studien. CESI-MS bietet hochreproduzierbare Ergebnisse sowohl für die Migrationszeit als auch für den Peak-Bereich, die im Vergleich zu LC-MS-basierten Methoden11,15günstig sind. Darüber hinaus ist die Übertragung im Vergleich zu nanoLC-MS bei CESI-MS kein Problem. Daher ist keine umfangreiche Systembereinigung zwischen den Probenanalysen erforderlich, was den Probendurchsatz erheblich verbessert11.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der vorgeschlagene Workflow der erste ist, der einen Ansatz zur Charakterisierung sowohl der Protein- als auch der Metabolitenkomponenten der vollständigen biomolekularen Korona von NMs beschreibt. Dies erschließt einen neuen Aspekt der Bio-Nano-Interaktionen, den Metaboliten Corona, und ermöglicht so die Sammlung von doppelt so vielen Daten aus derselben Probe und ermöglicht ein vollständigeres Verständnis der Wechselwirkungen an der Bio-Nano-Grenzfläche.

Bio-Nano-Wechselwirkungen an der Schnittstelle zwischen Nanomaterial (NM)-Oberflächen und biologischen Matrizen, aus denen Biomoleküle an die NM adsorbieren, sind ein intensives Forschungsgebiet, das nanosicherheit und nanomedizinischuntermauert 1. Diese Schicht adsorbierender Biomoleküle verleiht NMs eine biologische Identität, so dass Zellen sie als "Selbst" identifizieren und anschließend die zelluläre Aufnahme, Verteilung und biologischen Endpunkte beeinflussen2,3,4. Die überwiegende Mehrheit der Bio-Nano-Studien hat sich auf die Proteine innerhalb der Korona konzentriert und gezeigt, dass Proteine quantitativ und qualitativ zwischen NMs unterschiedlicher Zusammensetzung variieren5. Diese Variation hängt sowohl von den Eigenschaften des NM wie Größe, Funktionalisierung und Material als auch von den Eigenschaften der biologischen Matrix einschließlich Zusammensetzung und Salzgehaltab 5. Ein zunehmendes Interesse an der Bio-Nano-Grenzfläche sind die Metaboliten, die an NMsadsorbieren 6. Mehrere Studien haben gezeigt, dass nm-Eigenschaften wie bei den Proteinen ein Schlüsselfaktor bei der Bestimmung der Zusammensetzung der Metaboliten in der Korona sind und dass sie die biologischen Ergebnisse der NM-Exposition beeinflussen können6,7,8.
In Studien der biomolekularen Korona gibt es vier verschiedene Phasen zu ihrer Charakterisierung, Koronabildung, isolierung der Biomoleküle innerhalb der Korona, deren Nachweis durch qualitative oder quantitative Massenspektrometrie und Identifizierung9. Bis heute wurde eine Reihe von Techniken zur Isolierung der Proteinkorona eingesetzt, einschließlich des Kochens in SDS-PAGE-Laufpuffern, Lösungsmittel- und Salzextraktionen oder der direkten Verdauung von Proteinen in situ auf der Oberfläche von NMs. In Bezug auf die Metaboliten in der Korona ist die Isolierung mit verschiedenen Methoden unter Verwendung von Lösungsmitteln oder sogar die Auflösung der als Lösungen vorgeschlagenen NMs8,10,11komplexer. Im Gegensatz zur Proteinkorona ist es jedoch unwahrscheinlich, dass ein "One Size Fits All"-Ansatz für die Isolierung von Metaboliten aus NMs gilt, da das Metabolom einen großen chemischen Raum einnimmt und die Möglichen NMs vielfältig sind. Ein alternativer Ansatz besteht darin, die biologische Matrix vor und nach der NM-Exposition mit dem Unterschied in den Metabolitenkonzentrationen zu charakterisieren, der auf die Adsorption von Metaboliten an NMs zurückzuführen ist.12
Dieser alternative Ansatz wäre auf alle Biofluide und NMs anwendbar und obwohl er doppelt so viel Analyse erfordert, bietet er folglich ein viel genaueres Maß für die Metabolitenkorona und hat kein Risiko, dass niedrige Metabolitenrückgewinnungen von der NM-Oberfläche mit einer geringen Bindung des spezifischen Metaboliten verwechselt werden.
Der zweite Schritt zur biomolekularen Koronaanalyse ist der Nachweis der Biomoleküle. Traditionell für die Proteine in der Korona war dies die Aufgabe von Nano-LC-MS, dem Arbeitspferd der Proteomik; andere Ansätze wie NMR13, 1D und 2D SDS-PAGE wurden ebenfalls angewendet. In Bezug auf den Metaboliten Corona LC-MS7wurden GC-MS8 und direkte Infusionsmassenspektrometrie verwendet14. In jüngster Zeit hat jedoch ein neuer Ansatz begonnen, an Zugkraft zu gewinnen, nämlich die Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS)11,15, und ist in NM-Laboren als eigenständige Technik zur Charakterisierung verschiedener physikalischer und chemischer Eigenschaften von NMs16vorhanden. CE-MS ist eine orthogonale Trenntechnik zu nanoLC-MS und GC-MS und ist in der Lage, den Nachweis von hochpolaren und geladenen Metaboliten zu ermöglichen17,18. Darüber hinaus eignet sich CE-MS gut für die Analyse von Proteinen und deren posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung und Glykosylierung19,20,21,22. Der letzte Schritt, die Identifizierung und Datenanalyse kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden, je nachdem, ob ein quantitativer / qualitativer oder gezielter / ungezielter Ansatz verwendet wird, dies fällt jedoch nicht in den Zuständigkeitsbereich dieses Protokolls.
CESI-MS, eine Kombination aus CE und einer NanoESI-Schnittstelle, ist ein neuer Fortschritt in der CE-Technologie mit einer mantellosen Schnittstelle. Dies ermöglicht den direkten Anschluss von Ultra-Low-Flow CE (<20 nL/min) an ein hochauflösendes Massenspektrometer ohne Verdünnung, was zu einer deutlich verbesserten Detektionsempfindlichkeitführt 23,24,25. CESI-MS ermöglicht die Analyse volumenbegrennter Proben (< 10 μL) unter Beibehaltung einer hochempfindlichen Analyse26. CESI-MS ist auch im Vergleich zu herkömmlichen NanoLC-MS-Ansätzen mit niedriger Durchflussrate, die in der Proteomik und Metabolomik verwendet werden, in Bezug auf Reproduzierbarkeit27,28, Durchsatz und Übertragung günstig, was es zu einer aufregenden Perspektive für die vollständige biomolekulare Koronacharakterisierung macht.
Um das Potenzial von CESI-MS für die Analyse von Bio-Nano-Interaktionen hervorzuheben, beschreibt diese Arbeit die Probenvorbereitung, die erforderlich ist, um die biomolekulare NM-Korona aus einer einzigen menschlichen Plasmaprobe so zu isolieren, dass die Daten sowohl aus den Protein- als auch aus den Metabolitenaspekten der gesamten biomolekularen NM-Korona maximiert werden. Während wir über die Verwendung von menschlichem Plasma berichten, wäre dieses Protokoll für andere Bioflüssigkeiten wie Blutserum, komplettes Zellkulturmedium, Zelllysat, Zerebrospinalflüssigkeit oder Urin gleichermaßen geeignet. Die Analysen dieser beiden Komponenten (Proteine und Metaboliten) werden dann mit neutral beschichteten CESI-Kapillaren für die Proteinkorona und blanken Quarzglaskapillaren für kationische und anionische Metaboliten beschrieben.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citric</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Internal standard anion</td></tr><tr><td>Ammonium Acetate &gt;98%</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonate &gt;99.5%</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Capillary cartridge coolant</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Cap</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Vials</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Toxic, use in a fume hood</td></tr><tr><td>Glacial Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine sulfone</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Internal standard cation</td></tr><tr><td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Use in a fume hood</td></tr><tr><td>Microvials</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>nanoVials</td><td>Sciex</td><td>5043467</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Surface Cartridge 30 &amp;micro;M ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td></tr><tr><td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &amp;micro;m ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte buffered saline 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Tips, 100 &amp;micro;L bed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (surfactant)</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Grade modified Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide solution</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Dispex coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 PVP coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 uncoated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

Die Adsorption von Biomolekülen aus umgebenden biologischen Matrizen an die Oberfläche von Nanomaterialien (NMs) zur Bildung der Korona ist seit einem Jahrzehnt von Interesse. Das Interesse an der Bio-Nano-Grenzfläche ergibt sich daraus, dass die biomolekulare Korona NMs eine biologische Identität verleiht und so den Körper veranlasst, sie als "Selbst" zu identifizieren. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass die Proteine in der Korona in der Lage sind, mit Membranrezeptoren zu interagieren, um die zelluläre Aufnahme zu beeinflussen, und festgestellt, dass die Korona für den zellulären Transport von NMs und deren eventuelle Toxizität verantwortlich ist. Bisher hat sich die meiste Forschung auf die Proteinkorona konzentriert und die möglichen Auswirkungen der in der Korona enthaltenen Metaboliten oder synergistische Effekte zwischen Komponenten in der gesamten biomolekularen Korona übersehen. Daher zeigt diese Arbeit Methoden, um sowohl die Protein- als auch die Metabolitenkomponenten der biomolekularen Korona unter Verwendung von Bottom-up-Proteomik- und Metabolomik-Ansätzen parallel zu charakterisieren. Dazu gehören eine On-Particle-Digest der Proteinkorona mit einem Tensid zur Erhöhung der Proteinrückgewinnung und eine passive Charakterisierung der Metabolitenkorona durch Analyse von Metabolitenmatrizen vor und nach NM-Expositionen. Diese Arbeit führt die Kapillarelektrophorese – Massenspektrometrie (CESI-MS) als neue Technik zur NM-Koronacharakterisierung ein. Die hier beschriebenen Protokolle zeigen, wie CESI-MS für die zuverlässige Charakterisierung sowohl des Proteins als auch der Metabolitenkorona, die von NMs erworben werden, verwendet werden kann. Der Wechsel zu CESI-MS verringert das erforderliche Probenvolumen erheblich (im Vergleich zu herkömmlichen Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Ansätzen (LC-MS) mit mehreren Injektionen ab nur 5 μL Probe, was es ideal für volumenbegrente Proben macht. Darüber hinaus werden die Umweltfolgen der Analyse in Bezug auf LC-MS aufgrund der niedrigen Durchflussraten (<20 nL / min) in CESI-MS und der Verwendung von wässrigen Elektrolyten, wodurch organische Lösungsmittel überflüssig werden, reduziert.

Die beschriebene Methode ist die erste, die sowohl die Proteine als auch die Metaboliten in der biomolekularen NM-Korona mit derselben menschlichen Plasmaprobe charakterisiert. Diese Methode ist in der Lage, >200 Proteine und >150-Metaboliten nachzuweisen, wodurch ein möglichst umfassender Überblick über die gesamte biomolekulare Korona bestimmt werden kann, was ein besseres Verständnis der zellulären Bindung, Aufnahme und Auswirkungen von NMs ermöglicht.
Die Verwendung von CESI-MS sowohl für die Proteomik (Abbildung 1) als auch für die Metabolomik (Abbildung 2) trennung und detektion zeigt gute Trennfenster an beiden Kapillaren für jeden Ansatz.
Diese Methode ist in der Lage, zwischen den Proteinen in der Korona über eine breite Palette von NMs-Zusammensetzungen zu unterscheiden und so die Anwendbarkeit der Methoden auf NMs über ein breites Spektrum physikalischer und chemischer Eigenschaften zu demonstrieren (Tabelle 1).
Die eindeutigen Fingerabdrücke des Metaboliten Korona können auch mit dem metabolomischen Zweig dieser Methodik unterschieden werden (Abbildung 3). Obwohl dieser Ansatz einen passiven Ansatz zur Charakterisierung der NM-Metabolitenkorona verwendet, ist er immer noch in der Lage, interessante Einblicke in die Rolle von Metaboliten in der biomolekularen Korona wie die differentielle Adsorption von Isomeren zu gewinnen (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Abbildung 1: Beispiel-Elektropherogramm einer SiO2-Proteinkoronatrennung mittels CESI-MS nach einem On-Particle-Digest. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiel für extrahierte Ionenelektropherogramme, die aus endogenen Verbindungen im Plasma durch CE-MS gewonnen wurden. Die nummerierten Verbindungen sind wie folgt: 1. Ornithin; 2. Lysin; 3. Arginin; 4. Histidin; 5. Kreatin; 6. Glycin; 7. Alanin; 8. Valin; 9. Isoleucin; 10. Leucin; 11. Serin; 12. Threonin; 13. Asparagin; 14. Methionin; 15. Glutamin; 16. Glutaminsäure; 17. Phenyl-D5-Alanin; 18. Phenylalanin; 19. Tyrosin; 20. Prolin; 21. Methioninsulfon (interner Standard). Veröffentlicht unter einer Open-Access-Lizenz von Creative Commons CC BY und reproduziert von Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Analyse der Proteinkorona über ein Array von 6 NMs. Heatmap der Proteinklassen, die auf Kieselsäure(SiO2),Titan (TiO2), PVP-gekapptes Titan (TiO2-PVP), dispex-gekapptes Titan (TiO2-Dispex), Polystyrol und carboxyliertes Polystyrol-NMs identifiziert wurden. Prozentsätze beziehen sich auf die Häufigkeit der Proteine im Verhältnis zum Gesamtproteingehalt basierend auf der Top-3-Peptidhäufigkeit für jedes Protein. Angesichts der Beobachteten Unterschiede in den relativen Häufigkeiten von Proteinen in den verschiedenen NM-Koronen ist es klar, dass dieses vorgeschlagene Protokoll ausreichend empfindlich ist, um zwischen der Proteinkorona verschiedener NMs zu unterscheiden. Abbildung reproduziert aus einer CESI-MS-Analyse der Proteinkorona, veröffentlicht unter einem Open Access Creative Commons CC BY Lizenz11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Abbildung 3: Gezielte Analyse der kationischen Metaboliten in der NM-Korona. Adsorption von Kationen anSiO2 undTiO2 NMs. Rot bezieht sich auf die Anfangskonzentration von Metaboliten, während Blau sich auf die Konzentration von Metaboliten nach einer 1 h Inkubation mit den NMs bei 37 °C bezieht. Die Verringerung der Metabolitenkonzentration in der Lösung ist das Ergebnis der Metabolitenadsorption an der NM-Oberfläche. Für die Polystyrol-NMs wurde keine signifikante Adsorption von Metaboliten beobachtet. Box-Diagramme stellen die Minimal- und Maximalwerte, Median- und Interquartilbereiche dar. Abbildung reproduziert aus einer CESI-MS-gezielten Analyse des Metaboliten Corona, die unter einer Open-Access-Creative Commons CC BY-Lizenz15veröffentlicht wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Abbildung 4: Gezielte Analyse der anionischen Metaboliten in der NM-Korona mit Fokus auf Isomerenadsorption. Die Adsorption von Anionen an eine Reihe von Titan-NMs zeigt deutliche Unterschiede zwischen verschiedenen Isomeren wie den Zuckerphosphaten. Rot bezieht sich auf die Anfangskonzentration von Metaboliten, während Blau auf die Konzentration von Metaboliten nach einer 1 h Inkubation mit dem NM bei 37 °C verweist. Die Verringerung der Metabolitenkonzentration in Lösung ist das Ergebnis der Metabolitenadsorption an der NM-Oberfläche. FürsiO2 und die Polystyrol-NMs wurde keine signifikante Adsorption von Metaboliten beobachtet. Box-Diagramme stellen die Minimal- und Maximalwerte, Median- und Interquartilsbereiche dar. Abbildung reproduziert aus einer CESI-MS-gezielten Analyse des Metaboliten Corona, die unter einer Open-Access-Lizenz von Creative Common CC BY15veröffentlicht wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analyt</td>
			<td>Mittlere RSD-Spitzenfläche</td>
			<td>Mittlere RSD-Migrationszeit</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 Peptide intraday (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 Kationen intraday (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 Kationen intertags (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Reproduzierbarkeit von technischen CESI-MS-Replikaten für Peptide und kationische Metaboliten. RSD: relative Standardabweichung als Maß für die Reproduzierbarkeit. Die Reproduzierbarkeit von CESI-MS in Bezug auf Spitzengebiete und Migrationszeiten ist sehr gut, wobei alle Analyten einen mittleren RSD-<15% und Migrationszeiten <2,2% aufweisen. Diese Ergebnisse zeigen das hohe Maß an Vertrauen, das den mit dieser Technik gesammelten Daten zugeschrieben werden kann, und bestätigen, dass die festgestellten Variationen eher auf echte Unterschiede in der Probenzusammensetzung (Anreicherung auf NMs) als auf analytische Variationen zurückzuführen sind. Tabelle 2 wird aus den zuvor dargestellten Ergebnissen11,15generiert.

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Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Charakterisierung der vollständigen biomolekularen Korona, Proteine und Metaboliten, die von Nanomaterialien aus Biofluiden unter Verwendung eines Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie-Ansatzes gewonnen werden.

Kapillarelektrophorese Massenspektrometrie Ansätze zur Charakterisierung der protein- und metaboliten Korona, die von Nanomaterialien erfasst werden

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.4K Aufrufe.  University of Birmingham. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Charakterisierung der vollständigen biomolekularen Korona, Proteine und Metaboliten, die von Nanomaterialien aus Biofluiden unter Verwendung eines Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie-Ansatzes gewonnen werden.

Serie: Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Forschung

Biochemie

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Gewinnung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Adherenten Zellen für die metabolomische Analyse durch die kapitänische Spektrometrie Elektrophoresis-Mass

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Krebsforschung

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

Charakterisierung von Proteinen durch Größen-Ausschluss-Chromatographie gekoppelt an Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillare Zone Elektrophorese Tandem-Massenspektrometrie

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Chemie

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Kapillarelektrophorese-basierter Wasserstoff/Deuterium-Austausch zur Konformationscharakterisierung von Proteinen mit Top-down-Massenspektrometrie

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Biologie

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-Wellen-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie: Basic Experimentelle Verfahren zur Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Die Entdeckung und Charakterisierung von Protein-Wechselwirkungen Protein-Funktion Mit HaloTag Technologie

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Kapillarelektrophorese Massenspektrometrie Ansätze zur Charakterisierung der protein- und metaboliten Korona, die von Nanomaterialien erfasst werden

Zusammenfassung

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