Diese Methode kann die organoidbildende Fähigkeit des de-differenzierenden Zottenepithels bestätigen, das Stammzellmarker in vivo erwirbt. Die Entnahme von Zotten erfolgt durch Scraping und nicht durch die EDTA-Chelatbildungsmethode, die den vollständigen Verlust des darunter liegenden Mesenchyms verhindert, das die Nischensignale liefern kann, wenn dies für die Organoidinitiierung erforderlich ist. Diese Methode ist in Epithelgeweben anwendbar, in denen proliferative und differenzierte Kompartimente physikalisch abgegrenzt sind und die entdifferenzierenden Zellen Stammzellmarker in vivo exprimieren.
Einige Faktoren in diesem Protokoll müssen empirisch bestimmt werden, einschließlich des optimalen Stadiums für die Ernte der Zotten und des optimalen Drucks für das Abkratzen der Zotten, was Zeit und Übung in Anspruch nimmt. Induktion des Smad4-Knockouts und des Beta-Catenin-Gewinns der Funktionsmutation bei mutierten Mäusen mit intraperitonealer Injektion von Tamoxifen und Maisöl an vier aufeinanderfolgenden Tagen. Nach dem Einschläfern der Maus den Bauch mit 70% Ethanol besprühen, um zu verhindern, dass Mausfell in die Peritonealhöhle gelangt.
Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Dissektionsschere, um den Darm freizulegen und den Darm mit Schere und Zette zu isolieren. Sezieren Sie die proximale Hälfte des Zwölffingerdarms und spülen Sie dann den Zwölffingerdarm mit fünf Millilitern eiskaltem PBS in einer 10-Milliliter-Spritze, um den Luminalgehalt zu klären. Öffnen Sie den Zwölffingerdarm längs mit einer abgewinkelten Schere und legen Sie den Zwölffingerdarm flach auf eine 15 Zentimeter große Petrischale auf Eis mit dem Lumen des Zwölffingerdarms dem Bediener zugewandt.
Bevor Sie mit dem Schaben beginnen, legen Sie ein 70 Mikrometer großes Maschensieb in einen der Vertiefungen einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte. Füllen Sie alle Brunnen mit vier Millilitern 1X PBS und legen Sie die Platte auf Eis. Kratzen Sie die Zotten mit zwei mikroskopisch kleinen Glasobjektträgern, von einem, um den Zwölffingerdarm festzuhalten und zum Abkratzen.
Kratzen Sie die luminale Seite des Zwölffingerdarms oberflächlich zweimal, um den Schleim zu entfernen, ohne die Zotten zu entfernen, und kratzen Sie dann den Zwölffingerdarm zwei weitere Male, um die Zotten auf den Dias zu sammeln, ohne die Krypten zu binden. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Transferpipette, die PBS enthält, um die Zotten in ein 70-Mikrometer-Maschensieb in der Sechs-Well-Schüssel zu übertragen. Sammle die Zotten nach jedem Kratzen.
Um lose Krypten zu entfernen, waschen Sie die mit dem 70-Mikrometer-Sieb gesammelten Zotten, indem Sie das Sieb durch eine Reihe von Vertiefungen in der Sechs-Brunnen-Schüssel mit vier Millilitern eiskaltem PBS pro Brunnen übertragen. Übertragen Sie mit einer P1000-Pipette die Zottensuspension in etwa drei Millilitern PBS vom 70-Mikrometer-Sieb in ein neues 15-Milliliter-Rohr auf Eis. Verwenden Sie eine 0,1% BSA-beschichtete stumpfe P200-Pipettenspitze, um ein Volumen von 50 Mikrolitern der Zottenaufhängung auf einen Glasträger zu übertragen.
Zählen Sie die Anzahl der Zotten im 50-Mikroliter-Tröpfchen unter 4-facher Vergrößerung, um die Konzentration von Zotten in der PBS-Suspension zu bestimmen und das Fehlen von angebundenen Krypten zu bestätigen. Um die Zotten zu plattieren, verwenden Sie eine 0,1% BSA-beschichtete P200-Pipettenspitze mit stumpfem Ende, um die Zotten in ein Mikrozentrifugenrohr zu übertragen, um eine Beschichtungsdichte von sechs Zotten pro Vertiefung in 12,5 Mikrolitern BME-R1-Matrix zu erreichen. Drehen Sie die Zotten zwei Minuten lang bei 200 mal G bei vier Grad Celsius herunter.
Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Zentrifugation, um alle PBS-Reste zu entfernen. In einer Laminar-Flow-Haube das Zottenpellet vorsichtig in der erforderlichen Menge an kaltem BME-R1 auf Eis auftauen. Mit einer P20-Pipette werden 12,5 Mikroliter der Zotten in BME-R1-Matrix pro Vertiefung einer 96-Well-U-Bodenplatte auf 37 Grad Celsius vorgewärmt.
Inkubieren Sie die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten, um die BME-R1-Matrix zu erstarren. Zu jeder Vertiefung fügen Sie 125 Mikroliter vorgewärmte ENR-Medien hinzu, die wie im Textmanuskript beschrieben ergänzt werden. Inkubieren Sie die plattierten Zotten in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag.
Verwerfen Sie jeden Brunnen, in dem Organoide vor zwei Tagen erscheinen. Es gibt einen Unterschied im Aussehen der Organoide, die aus den Krypten hervorgehen, im Vergleich zum entdifferenzierten Zottenepithel aus demselben Mausdarm. Die kryptisch abgeleiteten Organoide erscheinen über Nacht als kugelförmige Strukturen mit klar definierten Grenzen.
Untersucht wurde die Kinetik und das morphologische Erscheinungsbild der aus Zotten initiierten Organoide, die zunächst unregelmäßig geformt erscheinen und zwei bis fünf Tage dauern, bis sie unter dem Mikroskop zu sehen sind. Organoid-Initiation von zwei verschiedenen Zotten wird gezeigt. Die Zotten mit organoidbildenden Potentialen erscheinen dicht, möglicherweise aufgrund der Retention des darunter liegenden Mesenchyms.
Organoide Initiation aus den Villen ist am zweiten Tag von einem der Zotten sichtbar. In den anderen Villen erscheint das Organoid am vierten Tag. Es ist wichtig, die richtigen Schritte zu unternehmen, um eine Kryptenkontamination zu vermeiden, wenn die Zotten geerntet und die resultierenden Organoide wachsen.
Phänotypische Unterschiede zwischen den organoiden, die aus den Krypten und Zotten derselben Mutante hervorgingen, wurden nach diesem Verfahren beobachtet, so dass weitere Experimente durchgeführt werden konnten, um nach molekularen Unterschieden zwischen den beiden zu suchen. Dieses Protokoll könnte verwendet werden, um die Unterschiede zwischen Organoiden, die aus endogenen Krypten entstehen, und ektopischen Krypten, die sich aus der Dedifferenzierung ergeben, zu untersuchen, so dass die Auswirkungen der Dedifferenzierung angegangen werden könnten.
