Es gibt bisher keine klinisch validierte chimäre Antigenrezeptor-T-Zell-Bildgebungsplattform. Der Natrium-Jodid-Symporter stellt einen sensitiven und klinisch relevanten Reporter dar, um Car-T-Zellen per PET-Scan abzubilden. TLP-PET-Bildgebung von NIS-CAR-T-Zellen ermöglicht es Forschern, infundierte Zellen in vivo nicht-invasiv zu verfolgen und hat das Potenzial, die Wirksamkeit und Toxizität der CAR-T-Zell-Therapie vorherzusagen.
Die effiziente Bildgebung von CAR-T-Zellen ermöglicht die Bewertung von T-Zell-Transport und -Expansion und ermöglicht die Entwicklung von Strategien zur Überwindung der Einschränkungen. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode ist einfach und kann auf andere CAR-Konstrukte angewendet werden, die über die in dieser Studie gezeigten hinausgehen. Beginnen Sie mit der Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen oder PBMCs aus der Blutprobe unter Verwendung der Standard-Dichtegradiententechnik.
Dazu fügen Sie vorsichtig 15 Milliliter Dichtegradientenmedium zu einem 50-Milliliter-Dichtegradiententrennrohr hinzu, um Blasenbildung zu vermeiden. Um Zellfallen zu vermeiden, verdünnen Sie die Blutprobe mit PBS, das 2% FBS enthält, bei einem Volumenverhältnis von eins zu eins und übertragen Sie das verdünnte Blut vorsichtig auf das Dichtegradientenmedium, ohne die Grenzfläche zwischen den beiden zu unterbrechen. Dann zentrifugieren Sie das Trennröhrchen bei 1.200 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 50-Milliliter-konischen Röhrchen, waschen Sie die Zellen mit PBS, das 2% FBS enthält, indem Sie das Röhrchen bis zu 50-Milliliter-Marke füllen und das Röhrchen bei Raumtemperatur acht Minuten lang mit 300 x G zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab, bevor Sie die pelletierten Zellen in 50 Milliliter PBS mit 2% FBS resuspendieren. Resuspendieren Sie die pelletierten PBMCs in PBS, die 2% FBS enthalten, auf eine Konzentration von 50 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter.
Wiederholen Sie die Wäsche in einem frischen 50-Milliliter-Röhrchen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen und zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension bei 300 mal G für acht Minuten bei Raumtemperatur. Zur T-Zell-Isolierung werden isolierte PBMCs auf ein 14-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenrohr übertragen.
Verwenden Sie dann ein Magnetperlen-Kit mit negativer Selektion, um eine T-Zell-Isolierung durchzuführen, indem Sie die PBMCs in einem Antikörpercocktail mit negativer Selektion in einem vollautomatischen Zellseparator platzieren. Nach der T-Zell-Isolierung die Zellen zählen und die Zellen in T-Zell-Expansionsmedium oder TCM in einer Konzentration von zwei mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter kultivieren. Als nächstes mischen Sie die Durchstechflasche mit den Anti-CD3 / CD28-Perlen durch Schwenken und pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Perlen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Zum Waschen die Perlen in einem Milliliter TCM aufhängen, bevor Sie eine Minute lang einen Schlauch auf einen Magneten legen und den Überstand absaugen. Nachdem Sie den Schlauch vom Magneten entfernt haben, suspendieren Sie die gewaschenen Perlen in einem Milliliter TCM und wiederholen Sie die Wäsche zweimal. Suspendieren Sie die gewaschenen Perlen in einem Milliliter TCM, um sie in die T-Zellkultur zu übertragen, verdünnen Sie dann die T-Zell-Perlensuspension mit TCM auf eine Konzentration von 1,0 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter, bevor Sie sie auf eine mit Gewebekultur behandelte Sechs-Well-Platte übertragen.
Inkubieren Sie die Bohrlochplatte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Um mit der Transduktion von Lentiviren fortzufahren, tauen Sie die gefrorenen Lentiviren in Beschichtung von chimären Antigenrezeptoren oder Natrium-Jodid-Symporter bei vier Grad Celsius auf. Nach 24 bis 48 Stunden T-Zell-Stimulation mischen Sie die T-Zellen, um die Cluster aufzubrechen, und fügen Sie das frisch aufgetaute Lentivirus den Zellen bei einer Vielzahl von Infektionen von fünf hinzu.
Inkubieren Sie die transduzierten T-Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Zählen Sie an den Tagen drei, vier und fünf der Inkubation die transduzierten T-Zellen und passen Sie die Zellkonzentration auf 1,0 mal 10 bis sechste Zellen pro Milliliter an, indem Sie frisches vorgewärmtes TCM hinzufügen. Für NIS-transduzierte T-Zellen, die das Puromycin-Resistenzgen tragen, behandeln Sie die Zellen an den Tagen drei, vier und fünf mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycindihydrochlorid.
Brechen Sie am sechsten Tag die T-Zell-Cluster auf und entfernen Sie die Anti-CD3 / CD28-Perlen von den transduzierten T-Zellen, indem Sie die Platte für eine Minute auf einen Magneten legen. Anschließend die gesammelten Zellen in einer Konzentration von 1,0 mal 10 bis sechsten Zellen pro Milliliter wieder in die Kultur geben. Waschen Sie ein Aliquot der T-Zellkultur mit 50.000 Zellen mit Flusspuffer und resuspendieren Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern Flusspuffer.
Um die CAR-Expression zu erkennen, färben Sie die T-Zellen mit einem Mikroliter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper. Um die toten Zellen auszuschließen, fügen Sie 0,3 Mikroliter LIVE/DEAD Aqua hinzu. Inkubieren Sie die gefärbten Zellen im Dunkeln bei Raumtemperatur.
Nach 15 Minuten die Zellen mit 150 Mikrolitern Durchflusspuffer bei 650 mal G drei Minuten bei vier Grad Celsius waschen. Um die gefärbten Zellen zu fixieren und zu permeabilisieren, inkubieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Fixationsmedium für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Dann waschen Sie die Zellen zweimal mit 100 Mikrolitern eines Puffers, der ein Zellpermeabilisionsmittel wie Saponin und Zentrifuge enthält.
Nach dem Waschen resuspendieren Sie die permeabilisierten Zellen in 50 Mikrolitern eines permeabilisierenden Puffers. Dann fügen Sie 0,3 Nanogramm antihumanen ETNL-NIS-Antikörper hinzu und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius. Nach einer Stunde Inkubation waschen Sie die Zellen, indem Sie 150 Mikroliter Flusspuffer und Zentrifuge hinzufügen, wie gezeigt.
Dann inkubieren Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern Flusspuffer, der 2,5 Mikroliter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper enthält, für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Waschen der T-Zellen, wie gezeigt, suspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern Flusspuffer, um eine Durchflusszytometrie durchzuführen. Bestimmen Sie dann die Transduktionseffizienz der Zellen.
Zählen und drehen Sie am achten Tag die T-Zellen bei 300 mal G acht Minuten lang bei vier Grad Celsius ab, bevor Sie das Zellpellet mit einem gefrierenden Medium in einer Konzentration von 10 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter wieder auffüllen. Übertragen Sie einen Milliliter der Zellsuspension auf jede gekennzeichnete Kryo-Durchstechflasche, um sie 48 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank zu lagern. Nach 48 Stunden die T-Zellen in flüssigen Stickstoff überführen.
Bereiten Sie die Mäuse, denen NIS-positive BCMA-CAR-T-Zellen injiziert wurden, für die PET/CT-Bildgebung vor, indem Sie die Mäuse wiegen und Metallohrmarken entfernen. Dann werden 9,25 Megabecquerel frisch zubereitetes F18-Tetrafluoroborat intravenös durch Schwanzveneninjektion in die Maus injiziert. Nach 45 Minuten Aufnahmezeit nehmen Sie statische PET-Bilder einer betäubten Maus für 15 Minuten auf, gefolgt von einer CT-Bildaufnahme für fünf Minuten mit 360-Grad-Drehung und 180 Projektionen.
In dieser repräsentativen Analyse erzeugte die gemeinsame Transduktion von zwei Viren in T-Zellen NIS-positive BCMA-CAR-T-Zellen, wobei über 90% der Zellen NIS-positiv waren. Die Analyse der Kinetik des T-Zell-Wachstums von null auf acht Tage ergab, dass der Einbau von BCMA CAR und NIS die T-Zell-Expansion im Vergleich zu den nicht transduzierten Zellen nicht signifikant beeinflusste. In der durchflusszytometrischen Analyse von OPM-2 stellten Zellen, die mit Lentivirus transduziert wurden, die GFP-Expression bei der Behandlung mit Puromycin dar.
Die Mäuse, die BCMA-positive Luciferase-positive OPM-2-Zellen erhielten, wurden einer Biolumineszenzbildgebung unterzogen, um die Transplantation von OPM-2-Zellen zu bestätigen. Die PET-Bildgebung der F18-Tetrafluoroborat-verabreichten Maus zeigte eine NIS-positive BCMA-CAR-T-Zell-Verteilung in den verschiedenen Organen und im Knochenmark. Zusätzlich zeigten die von der Maus entnommenen Knochenmarkzellen die Transplantation von OPM-2-Zellen und die Abgabe der NIS-positiven BCMA-CAR-T-Zellen an das Knochenmark.
Für eine qualitativ hochwertige Bildgebung von infundierten CAR-T-Zellen ist es wichtig, die Schritte des NIS-CAR-T-Zell-Generierungsprotokolls zu befolgen und das Vorhandensein von dualen NIS- und CAR-positiven Fraktionen zu bestätigen.
