Wir präsentieren eine Methode zur Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumorantigen-spezifischen CD8 alpha beta single-positiven T-Zellen mit OP9-Delta-1 Kokultursystem. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die In-vitro-T-Zellgenerierung und wird die Entwicklung von in vitro abgeleiteten T-Zellen für den Einsatz in der regenerativen Medizin und zellbasierten Therapien erleichtern. Es kann auch für die Erzeugung von anderen Lymphozyten angepasst werden, wie NK-Zellen.
Bei der Durchführung dieser Technik ist es wichtig, die Menge der FBS- und Durchgangs-OP9-Delta-1-Zellen konsistent vorzubewerten, wenn der zell-zellige zytoplasmatische Kontakt beginnt, Zelldifferenzierung und Seneszenz zu verhindern. Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Meghan Good, einer chirurgischen Onkologie-Stipendiatin aus meinem Team. Beginnen Sie mit der Überprüfung menschlicher iPSC-Kolonien in einem Stereomikroskop und entfernen Sie alle Bereiche der Differenzierung von der Kultur mit der Kunststoffkante einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze.
Wenn die Kolonien einen Durchmesser von 0,8 bis 1,2 Millimetern erreichen, durchfahren Sie die menschlichen iPSCs. Aspirieren Sie die verbrauchten Medien, und fügen Sie 10 Milliliter humaner iPSC-Medien hinzu, die mit 10-Mikromolaren-ROCK-Hemmern ergänzt werden. Rollen Sie ein Einweg-Zell-Passaging-Werkzeug über die gesamte Schale in eine Richtung, um einen gleichmäßigen Druck zu halten und sicherzustellen, dass die gesamte Walzenklinge die Kulturschale berührt.
Drehen Sie die Kulturschale um 90 Grad, und wiederholen Sie das Rollen. Bestätigen Sie visuell das richtige Schneiden der Kolonien mit einem Mikroskop. Sie sollten kariert erscheinen.
Lösen Sie dann die geschnittenen Kolonien durch sanfte mechanische Spülung mit einer 200-Mikroliter-Pipette. Schätzen Sie visuell die Anzahl der Kolonieklumpen und übertragen Sie zwischen 350 und 600 Klumpen auf eine neue 10-Zentimeter-Schale von Mausembryonal-Fibroblasten mit 10 Millilitern frischer menschlicher iPSC-Medien, ergänzt mit ROCK-Hemmer. Inkubieren Sie das Gericht über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Tag, aspirieren Sie die verbrauchten Medien, und fügen Sie 10 Milliliter frische menschliche iPSC-Medien. Ändern Sie die Medien alle ein oder zwei Tage, abhängig von der Zellwachstumsrate. Kultur die OP9-Delta-1 Zellen in OP9 Medien bei 37 Grad Celsius.
Wenn sie die Koninfluenza erreichen, die Medien ansaugen und die Zellen einmal mit fünf Millilitern 1x Magnesium, Kalzium und phenolrot-freiem PBS waschen. Aspirieren Sie die PBS, fügen Sie zwei Milliliter 05%trypsin-EDTA, und inkubieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann vier Milliliter OP9-Medien hinzu, und distanzieren Sie die Zellschicht mechanisch durch Pipettieren.
Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Konikonrohr und zentrifugieren Sie bei 300 mal g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 12 Milliliter OP9-Medien wieder aus. Fügen Sie acht Milliliter OP9-Medien zu jedem der sechs neuen Zellkulturgerichte hinzu und platten Sie zwei Milliliter op9-delta-1 Zellsuspension auf jede Schale.
Schaukeln Sie die Schale Seite an Seite und von vorne nach hinten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, und wiederholen Sie den Durchgang, wenn die Zellen die Koninfluenza erreichen. Bereiten Sie gelatinierte OP9-Delta-1 Gerichte eine Woche vor der Co-Kultur mit menschlichen iPSCs zu.
Fügen Sie vier Milliliter 0,1% Gelatine zu drei neuen Zellkultur-Gerichten hinzu und bebrüten sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation die Gelatine ansaugen und acht Milliliter OP9-Medien zu jedem Gericht hinzufügen. Durchgang eine konfluente Schale op9-Delta-1 Zellen zu drei Gelatine-beschichteten Gerichten.
Nach vier Tagen 10 Milliliter OP9-Medien zu jedem Zellgericht hinzufügen, für insgesamt 20 Milliliter Medien pro Schale. Beginnen Sie die menschliche iPSC-Kokultur auf OP9-Delta-1 konfluenten Gerichten sieben bis acht Tage nach dem Passieren der Zellen. Saugen Sie die Medien aus einer konfluenten Schale menschlicher iPSCs und fügen Sie 10 Milliliter OP9-Medien hinzu.
Zellkolonien mit einem Einweg-Zellpassaging-Tool schneiden und ablösen und 350 bis 600 Klumpen geschnittener Kolonien auf eine vorgelatinierte OP9-Delta-1-Schale mit 10 Millilitern frischen OP9-Medien übertragen. Rock die KulturSchale Seite an Seite und von vorne nach hinten, um eine gleichmäßige Verteilung der Kolonien zu gewährleisten. Am nächsten Tag, aspirieren Sie die verbrauchten Medien, und ersetzen Sie es durch 20 Milliliter frische OP9-Medien.
Die menschlichen iPSC-Klumpen, die einen Tag lang auf OP9-Delta-1 mitkultiviert wurden, sollten als kleine, runde Monolayer-Kolonien erscheinen. Am fünften Tag 10 Milliliter verbrauchte Medien ansaugen und 10 Milliliter frische OP9-Medien hinzufügen. Die Kolonien werden beginnen, sich in primitives Mesoderm zu differenzieren, das durch ein vielschichtiges dunkles Zentrum gekennzeichnet ist.
Wiederholen Sie diesen Vorgang am neunten Tag, an dem sich die mehrschichtigen Mittelstrukturen zu kuppelartigen Formen entwickeln. Ernten Sie die hämatopoetischen Vorläuferzellen an Tag 13, an dem die Strukturen aus einem dunklen zentralen Organoid bestehen, das von einem Netzwerk von kuppelartigen Bereichen umgeben ist. Die Medien ansaugen und die Zellen einmal mit fünf Millilitern 1x phenolrot-freier Hanks'balanced Salzlösung mit Kalzium und Magnesium oder HBSS waschen.
Nach dem Waschen 250 Mikroliter 5.000 Einheiten pro Milliliter Kollagenase IV zu 10 Milliliter HBSS hinzufügen. Fügen Sie die Mischung zu den Zellen, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten. Die HBSS-Kollagenase-Mischung ansaugen und die Zellen einmal mit fünf Millilitern PBS waschen.
Nach dem Waschen mit PBS fünf Milliliter 0,25%Trypsin-EDTA hinzufügen und die Zellen 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius bebrüten. Fügen Sie dann vier Milliliter OP9-Medien hinzu, und distanzieren Sie die Zellschicht durch Pipettieren, um eine Einzelzellensuspension zu erstellen. Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Sieb auf ein 50-Milliliter-Konikonrohr und zentrieren Sie das Rohr bei 300 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 10 Milliliter OP9-Medien wieder aus. Die Zellsuspension auf eine neue gelatinierte 10-Zentimeter-Zellkulturschale aufsieben und 45 Minuten bei 37 Grad Celsius bebrüten. Sammeln Sie dann alle nicht haftenden Zellen durch sanftepipettierende.
Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein Sieb und eine Zentrifuge in ein 50-Milliliter-Konikonrohr. Dann, aspirieren Sie den Überstand, und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter Differenzierung semedia. Die Zellsuspension auf eine neue OP9-Delta-1 Konfluentschale aufteilen.
Passieren Sie die Zellen am 16. Tag gemäß den Manuskriptanweisungen und passieren Sie die nicht haftenden Zellen alle fünf bis sieben Tage danach. Bereichern Sie nach 35 Tagen Differenzierung die CD4-positive Zellpopulation durch CD4-Magnetperlenisolierung gemäß dem Herstellerprotokoll. Dann setzen Sie die Zellen in OP9-Medien wieder aus und platten einen Milliliter Zellsuspension in jeden Brunnen einer Gewebekultur, flach-boden, 24-Well-Platte von konfluentem OP9-Delta-1.
Stimulieren Sie Zellen, indem Sie 100 internationale Einheiten des menschlichen IL-2, fünf Nanogramm menschlicher IL-7, 500 Nanogramm antihumaner CD3-Antikörper und zwei Mikrogramm antihumaner CD28-Antikörper zu jedem Brunnen hinzufügen. Nach vier bis sieben Tagen können Zellen zur weiteren Analyse gesammelt werden. Nach der Kultur auf nicht gelatinierten OP9-Delta-1 in Gegenwart von menschlichen Stammzellfaktor, humanem FLT3-Ligand und menschlichem Interleukin-7 unterschieden sich hämatopoetische Vorläufer in CD3, CD7, CD4 und CD8 doppelpositive T-Linienzellen, von denen die Mehrheit T-Zellrezeptoren spezifisch für das MART1-Epitop exprimierte.
Als die CD4- CD8-Doppel-positiven T-Zellen mit humanen CD3- und CD28-Antikörpern in Gegenwart von humanem Interleukin-7 und 2 stimuliert wurden, nahm die Anzahl der CD3-positiven CD8-Alpha-Beta-Einzel-positiven Zellen zu und blieb spezifisch für das MART1-Epitop, was die Erhaltung ihrer vererbten Antigenspezifität bestätigte. Ein ELISpot-Test ergab, dass menschliche iPSC-abgeleitete CD8-Alpha-Beta-Beta-T-Zellen höhere Mengen an Interferon-Gamma im Vergleich zu Bulk- und CD8-Alpha-Alpha-Einzel-positiven T-Zellen absondern, wenn sie in Gegenwart von MART1-Peptid kultiviert werden. Für T-Zellen und Antigen-präsentierende Zellen wurde allein keine Interferon-Gamma-Expression nachgewiesen, was zeigt, dass menschliche T-iPSC-abgeleitete T-Zellen antigenspezifisch und funktionell sind.
Ein wichtiger Schritt bei dieser Methode ist die CD4-Magnetperlenanreicherung zur Eliminierung von CD4-negativen, CD8-negativen Doppelnegativen Zellen, die bei Stimulation zu einer direkten Tötung von doppelpositiven Zellen führen können. Diese Technik ist für die Verwendung mit mehreren Quellen menschlicher Zellen anwendbar, einschließlich hämatopoetischer Stammzellen und embryonaler Stammzellen. iPSC-abgeleitete unreife T-Zellen, die mit dieser Methode erzeugt werden, könnten für die Erzeugung von reifen menschlichen Tumor-Antigen-spezifischen naiven T-Zellen für zukünftige therapeutische Anwendungen weiter verbessert werden.
Nach dem Betrachten dieses Videos sollte der Betrachter verstehen, wie man menschliche iPSC-abgeleitete CD8-Alpha-Beta-Einzel-positive T-Zellen mit dem OP9-Delta-1-Kokultursystem generiert.
