Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer gut charakterisierten Population menschlicher hämogener Endothelzellen. Diese Zellen können verwendet werden, um die molekulare Regulation und den endothelialen zu hämatopoetischen Übergang zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Kultivierung menschlicher embryonaler Stammzellen für vier Tage, um sie in primordiale Endothelzellen zu differenzieren.
Am fünften Tag saugen Sie das Medium über den Zellen ab. Anschließend waschen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Milliliter DMEM/F-12 pro Vertiefung. Fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitetes hämogenes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Ersetzen Sie am sechsten und siebten Tag das Medium über den Zellen durch einen Milliliter frisch zubereitetes homogenes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Am achten Tag. Nach dem Ablösen und Waschen der Zellen teilen Sie sie gleichmäßig in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis auf, die jeweils mindestens 600 Mikroliter Zellen mit einer Dichte von 1 mal 10 bis 5. Zellen pro Milliliter enthalten.
Fügen Sie den Röhrchen, die Zellen enthalten, gegebenenfalls Antikörper hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf lichtgeschütztem Eis. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 1000 mal G und 4 Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 600 Mikroliter eiskaltem Sortierpuffer.
Die Proben werden durch die Mesh-Filterkappe aus fünf Milliliter-FACS-Röhrchen gespannt und die Zellen lichtgeschützt auf Eis gelagert, um sie sofort zu sortieren. Um hämogene Endothelzellen durch FACS zu isolieren, wird zunächst die CD45-negative Zellpopulation gettert. Dann innerhalb der CD45-negativen Population, Gate die CD31-positiven Zellen.
Als nächstes innerhalb der CD31-positiven Population, Tor für die VE-Cadherin-negative Zellpopulation. Und dann innerhalb der VE-Cadherin-negativen Population, Tor für die c-Kit-positiven Zellen. Aus der c-Kit-positiven Population, Gate die CD34-positive Zellpopulation.
Und schließlich aus der CD34-positiven Zellpopulation identifizieren und sammeln Sie die KDR-positiven Zellen. Nach der Aussaat hämogener Endothelzellen in einem Methylcellulose-basierten Medium, das für das Wachstum von hämatopoetischen Vorläuferzellen formuliert ist, werden am achten Tag koloniebildende Einheit-erythroide Kolonien und explosionsbildende Einheit-erythroide Kolonien gezählt. Koloniebildende Einheit-Granulozyten-Makrophage und koloniebildende Einheit-Granulozyten, Erythroide, Makrophagen und Megakaryozyten.
Multipotente hämatopoetische Vorläuferkolonien werden am 14. Tag gezählt. Pro 1000 kologen Endothelzellen werden etwa 20 koloniebildende Einheiten erzeugt. Auch Zellen mit Endothelzellmorphologie sind in den Kulturen sichtbar.
Dies sind die hämogenen Endothelzellen, die auf Einzelzellebene hämatopoetische Vorläuferzellen mit mehreren Linien hervorbringen. Dieses Protokoll ist ein 2D-Serum- und Maus-Feeder-freies Kultursystem, das in etwa einer Woche menschliche hämogene Endothelzellen erzeugen kann.
