We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.

1. Viruspräparate und Transcription Factor Kombinationen <ol><li> Die Lösungen mit pSIN-EF1 lentiviralen Expressionsplasmid, das Protein-kodierende DNA für ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 und LMO2 (Tabelle 1). </li><li> Messung der Konzentration und Reinheit von Plasmid-Präparationen durch die Aufzeichnung der UV-Absorption mit einem Spektrophotometer bei 230 nm, 260 nm und 280 nm für lentivirale Produktion verwendet. Hinweis: zeigen DNA-Präparationen A260 / 280 und A260 / 230-Werte größer als 1,8 werden im Allgemeinen als guter Qualität. Unter A260 / 280-Werte können Protein-Kontamination anzuzeigen, während niedrigere A260 / 230-Werte zeigen Verunreinigungen mit Salzen oder einem Lösungsmittel, wie Phenol. Empfehlens Plasmidkonzentration 1-3 ug / ul. </li><li> Erzeugen Lentiviren für Transduktionen wie in zuvor veröffentlichten Protokollen 11 beschrieben. Induktion von ER mit pan-myeloischer Wirkung bedarf Co-Expression von ETV2 und GATA1 oder ETV2 und GATA2.Induktion von ER mit erythro- und Megakaryozyten Potential erfordert GATA2 und TAL1. Die Zugabe LMO2 die Ausbeute an erythro-Megakaryozyten-Zellen aus hPSCs in Gegenwart GATA2 und TAL1 10 deutlich verbessert. </li></ol> 2. hPSCs Kultur Protocol <ol><li> Wachsen pluripotente Stammzellen in engen Kolonien mit scharfen Kanten zu 70-80% Konfluenz vor Subkultivierung. Mark und entfernen sich spontan vor Passagieren Zellen differenziert Kolonien. </li><li> Verdünnter kommerziellen extrazellulären Matrix-Gel (siehe Tabelle 2) gemß den Anweisungen des Herstellers und Mantel 6-Well-Platten über Nacht bei 4 ° C oder für mindestens eine Stunde bei 37 ° C vor der Verwendung. Vor der Passage-Zellen, saugen Sie den Matrix 2 ml frischem kommerziellen kompletten Kulturmediums (siehe Tabelle 2) und halten Platten bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die Zellen bereit für die Aussaat. </li><li> Passage hPSCs <ol><li> Aspirate Medium aus einem konfluenten Vertiefung einer 6-Well-Platte mit hPSCs und fügen Sie 1,5 ml vorgewärmten Dispase II-Lösung (2 mg / ml in DMEM / F12, durch Filtration durch 0,22 um Filter sterilisiert). Inkubation für 5-7 Minuten bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die Ränder der Kolonien beginnen, von der Oberfläche zu heben. </li><li> Saugen Sie Dispase II Lösung und vorsichtig waschen die Kolonien zweimal durch Zugabe und Absaugen von 2 ml frischem DMEM / F12-Medium. Dann, mit einem 5 ml serologische Glaspipette, distanzieren hPSCs mit 3 ml frisches kommerziellen komplettem Kulturmedium (siehe Tabelle 2) durch Pipettieren Zellsuspension nach oben und unten mehrere Male. </li><li> 0,5 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen, die 1,5 ml handelsüblicher vollständigen Kulturmedium (siehe Tabelle 2). Agitieren Platte hin und her, und von rechts nach links mehrmals, um eine gleichmäßige Zellverteilung gewährleisten, wenn situieren die Platte in den Inkubator. Halten Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 18-24 Std. </li><li> Am nächsten Tag Änderungsmedium an die frische kommerziellen komplettem Kulturmedium (siehe Tabelle 2) und untersuchen hPSCs Morphologie. Erfolgreiche Passagieren Ergebnisse in kleinen, gut befestigt Kolonien Halte HPSC Morphologie. hPSCs müssen 2,5-3 ml freshmedium pro Well täglich gefüttert und alle 4-5 Tage passagiert bei nicht mehr als 70-80% Konfluenz. HINWEIS: Wenn hiPSCs wurden auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) erhalten, müssen sie, um Feeder-freien Bedingungen übertragen und 2-3 mal passagiert, bevor eine effiziente Transduktion Differenzierung gewährleisten. </li></ol></li></ol> 3. Induktion von Hematoendothelial Pprecursors von hPSCs (Tag 0, Transduktion hPSCs) <ol><li> Zur Herstellung von Reaktionsmedium kombiniert 1,3 ml kommerziellen komplette Serum-freiem Medium (siehe Tabelle 2), Viren, Polybren und Y27632 ROCK-Inhibitor (Tabelle 1): in 1,3 ul 10 mM ROCK-Hemmer zu 1,3 ml Medium zu einer endgültigen Konzentrationention von 10 uM und Polybren bis zu einer Endkonzentration 6 ug / ml. <ol><li> Hinzufügen einer geeigneten Menge an Viruskonzentrat (e) in einer Endkonzentration von 0,5-1,0 MOI (multiplicity of infection) von jedem Virus pro Zelle. Halten Reaktionsmedium auf Eis oder bei 4 ° C, bis die Einzelzellsuspension bereit ist. HINWEIS: Die gleiche Menge des MOI für jeden Virus im GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 und GATA2 / TAL1 / LMO2 Reaktionsmischungen ist optimal für die Induktion der Differenzierung. Doch in ETV2 / GATA2 transduzierten Kulturen verdoppelt MOI für GATA2, bezogen auf ETV2 verbessert Differenzierung. Daher ist für diesen Kulturen im Verhältnis 1: 2 zur MOI von ETV2 und 1 MOI von GATA2 empfohlen (zB wenn Viruskonzentrat etwa 6,8 x 10 7 Partikel / ml geschätzt, mit 10 ul ETV2 und 20 ul GATA2 viralen Konzentrate 0,68 x 10 6 Zellen pro ETV2 / GATA2 Reaktion in einem 35-mm-Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen). </li></ol></li><li> Bereiten hPSCs in einer einzelnen Zelle suspension. <ol><li> Wachsen hPSCs in Feeder-freien Bedingungen, wie in Kapitel 2 beschrieben Am Tag 4 nach der letzten Durchgang, beachten Zelldichte und Morphologie unter einem inversen Mikroskop. hPSCs sollte in engen Kolonien mit scharfen Kanten ohne spontane Differenzierung am Tag der Transduktion wachsen und ~ 60-70% Konfluenz. </li><li> Absaugen Medium, fügen Sie 1,5 bis 2 ml kommerziellen Zelldissoziation Reagenz (Tabelle 1) pro Vertiefung und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 5-7 min. </li><li> Sammeln Zellen in gleichen Volumina von kommerziellen Vollmedium (siehe Tabelle 2) mit 10 &amp; mgr; M von ROCK-Hemmer, zählen Sie die Zellen und Lebensfähigkeit zu bestimmen. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min und anschließend hat ein Resuspendieren Zellen in kommerziellen Komplettmedium mit 10 &amp; mgr; M von ROCK-Inhibitor in einer Konzentration von 3.4-5 x 10 6 Zellen pro ml. BEACHTEN SIE: Die Zelllebensfähigkeit ist entscheidend für eine erfolgreiche virale Transduktion und nachfolgende Differenzierung.In der Regel sollte die Lebensfähigkeit der Zellen vor der Transduktion 90% überschreiten. </li></ol></li><li> Fügen Sie 200 ul der Zellsuspension, enthaltend 0,68 bis 1 x10 6 Zellen, in 1,3 ml der nach 3.1 hergestellten Reaktionsmedium. </li><li> Saugen Sie das Matrix-Lösung aus der Nacht beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen in 2.2 vorbereitet. Transfer der Reaktionsmischung auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und zu verteilen Zellen gleichmäßig. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 24 Std. Nach 24 Stunden mindestens 80% der Zellen sollte die Matrix gebunden werden. </li></ol> 4. Die Induktion von Hematoendothelial Vorstufen aus hPSCs (Tag 1-7) <ol><li> 24 Stunden nach der Transduktion, entfernen virushaltige Medium und waschen anhaftenden Zellen mit kommerziellen unvollständige Zellkulturmedium (siehe Tabelle 1) und fügen Sie dann 3 ml pro Vertiefung der Handels unvollständige Zellkulturmedium, das hämatopoetische Zytokine: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml bFGF 20 ng / ml (im folgenden als 3F-Medium bezeichnet). </li><li> Ersetzen Gesamt Medium durch frisches 3F-Medium an den Tagen 2, 3 und 4. Tag, um tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Tag 4, als schwimmende blutbildenden Zellen entstehen, ersetzen Sie die Hälfte der 3F-Medium jeden zweiten Tag, während das Gesamtvolumen bei 4 ml. HINWEIS: pSIN-EF1 &amp; agr; lentiviralen Expressionsplasmiden beinhalten Puromycinresistenzgen wodurch eine positive Selektion von transduzierten Zellen. Die 1 ug / ml Puromycin kann während der ersten 1-2 Tage der Differenzierung zu Medium zugegeben werden, um die zurückbleibende undifferenzierte hPSCs eliminieren. </li><li> Beachten Zellmorphologie am Tag 4 unter einem inversen Mikroskop: tight Cluster von Zellen mit typischen endotheliale Morphologie beginnen zu erscheinen (2A, 3A). Runde Blutkörperchen scheint von Tag 5 bis Tag 7 der Differenzierung, während einige Bereiche können hPSCs Morphologie beibehalten. Analyse HE und hämatopoetische Differenzierung wie unten beschrieben. ANMERKUNG: Erfolgreiche hematoendothelial verschiedeneniation führt zu der Produktion von Blutzellen, die lose auf die zugrunde liegenden flachen Endothelzellen gebunden als lichtbrechenden Rundzellen angezeigt. Diese Zellen aktiv vermehren Bildung kleiner Aggregate und schließlich lösen und Schwimmer (2A und 3A). Live Blutkörperchen kann visuell von den toten und sterbenden Zellen auf ihre Fähigkeit, das Licht zu reflektieren und in Kulturbedingungen zu erweitern. </li></ol> 5. Analyse der Hemogenic Endothel (HE) Stadium der Differenzierung. <ol><li> Detektieren die Bildung von HE zwischen den Tagen 3 und 4 der Differenzierung durch mikroskopische Beobachtung der Zellen mit endothelialen Morphologie. Es gibt keine schwimmBlutZellen in der Kultur in diesem Stadium der Differenzierung. Die Anwesenheit von HE kann durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt und durchflusszytometrische Analyse unter Verwendung von VE-Cadherin, CD73, CD226 und CD43 Antikörper. <ol><li> Um HE Bildung durch Durchflusszytometrieanalyse Verwendung Zellen an Tag 3 zu bewertenTag und 4 von einem Experiment. Sammeln Zellen durch Inkubation der Kulturen mit kommerziellen Zelldissoziation Reagenz (siehe Tabelle 1) für 5-10 min bei 37 ° C, 5% CO 2 und dann mit bis zu 1 x 10 5 Zellen pro Farbreaktion (Durchflusszytometrie beschrieben Färbeverfahren 12). HINWEIS: VE-Cadherin + HE-Zellen die Expression von frühen hämatopoetischen Marker CD226 zu erwerben, aber nicht über die Expression von CD73 und CD43 6. Im Gegensatz dazu nicht-HE-Zellen exprimieren CD73 (2B, 3B). </li></ol></li><li> Immunfluoreszenzfärbung für HPSC stamm er. <ol><li> Wäscht den beigefügten Monoschicht von Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und dann zu fixieren Zellen in 4% Paraformaldehyd bei 30 bis 60 min bei Raumtemperatur. </li><li> Wasche die Zellen einmal mit PBS und dann permeabilisiert mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Zellen in PBS zwei bis drei Mal und dann in inkubierenBlockierungspuffer, bestehend aus PBS mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), für 30 bis 120 min. </li><li> Vorbereitung Färbelösung, enthaltend sowohl primären Antikörper (1: 1000 Verdünnung) Maus-Anti-Human-CD43 und Kaninchen-Anti-Human-VE-Cadherin in PBS mit 5% FBS, (Tabelle 1). </li><li> Saugt den Blockierungspuffer von den Zellen und mit 1 ml pro Vertiefung Färbepuffer mit den zugesetzten primären Antikörper; inkubieren 3 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Durch Zugabe von 2 ml PBS mit 5% FBS wasche die Zellen dreimal. </li><li> Vorbereitung einer zweiten Färbepuffer mit sekundären Antikörper bei einer 1: 500 Verdünnung in PBS mit 5% FBS: Esel-Anti-Kaninchen mit grün fluoreszierenden Farbstoff und Anti-Maus mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff (Tabelle 1) konjugiert. 1 ml pro Vertiefung Sekundär Färbepuffer und bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Dreimal mit PBS ohne Serum zu waschen. Stain-Zellen mit 300 nM DAPI-Arbeitslösung in dH2 O für 10-15 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie 2-3 ml PBS in gut mit gefärbten Zellen. Beachten Fluoreszenz mit grünen, roten und blauen Mikroskop Filter. </li></ol></li></ol> 6. Analyse von induzierten hämatopoetischen Präkursoren <ol><li> Pflegen Differenzierungskulturen bis zum schwimmenden Zellen deutlich zu erweitern, bis zu 10-14 Tage, wechselnde Hälfte des 3F-Medium, wie in 3.1 beschrieben, alle zwei Tage. </li><li> Dissoziieren und sammeln Differenmonoschichten von Zellen, die durch Behandlung von Zellen mit einem kommerziellen Zelldissoziation Reagens (siehe Tabelle 1) für 5-10 min bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Führen Durchflusszytometrie unter Verwendung anti-VE-Cadherin, CD43 und CD45 Antikörper gegen die Blutbildung in Kulturen 12 zu bewerten. Beachten Sie, dass ein großer Anteil der Zellen, bis zu 40% der ETV2 und GATA2 transduzierten Zellen koexprimiert VE-cad und CD43. Die folgenden Antikörper können verwendet werden, um spezifische Zelllinien folgende E erfassenxpansion oder Differenzierung von induzierten Blutvorläuferzellen: CD235a (Erythrozyten), CD41a (Megakaryozyten), CD32 (alle Arten von Knochenmarkzellen), CD66b (Neutrophile) und CD163 (Makrophagen). </li><li> Zuführen CFC-Assay unter Verwendung eines kommerziellen klonogenen Medium (Tabelle 1) nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Transfer 1-2 × 10 4 Zellen in 3 ml handelsüblicher klonogenen Medium (siehe Tabelle 3), um die Anzahl der koloniebildenden Zellen und Arten von hämatopoetischen Kolonien zu bewerten. Optimale Aussaatdichte ermöglicht die Identifizierung und Isolierung von einzelnen Kolonien, die getrennt voneinander wachsen und sich nicht überlappen. Aussaatdichte kann zwischen den Experimenten abhängig von Differenzierung Effizienz variieren, aber sollte 1 x 10 4 Zellen pro 1 ml kommerziellen klonogenen Mediums nicht übersteigt. </li><li> Mischen Sie Zellen in kommerziellen klonogenen Medium durch sanftes Vortexen, und übertragen 3 ml Suspension zu zwei 35 mm Ultra-Low-Befestigungs Gerichtefür CFC-Assay wurden 1,5 ml der Suspension in jede Schale. Medium gleichmäßig verteilen und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 14 Tage. Vermeiden Sie das Geschirr zu stören; beobachten, Koloniebildung am Tag 7 und Tag 10 des Tests. </li><li> Zu identifizieren und zu zählen hämatopoetischen Kolonien nach ihrer Morphologie am Tag 14. </li></ol></li></ol>

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IS ist Gründungsaktionär und Berater für Cynata.

Das oben beschriebene Verfahren zur hämatopoetischen Differenzierung hPSCs durch Überexpression von TFs, stellt ein schnelles und effizientes Konzept für die Erzeugung von HE und myeloiden und erytho-magakaryocytic Progenitoren aus HES und iPSCs, wodurch die Produktion von bis zu 30 Millionen Blutzellen aus Million pluripotenten Stammzellen 10. Diese Methode zeigte konsequente Differenzierung in mehreren hESC und iPSCs Leitungen 10. Während der Differenzierung von ETV2 und GATA2, GATA1 Faktoren...

Die einzigartige Fähigkeit des menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sich selbst zu erneuern und sich in Zellen der drei Keimblätter, einschließlich Blut zu unterscheiden, machen sie ein wertvolles Werkzeug für die mechanistische Studien von hämatopoetischen Entwicklung, Modellierung von Blutkrankheiten, Wirkstoff-Screening, Toxizitätsstudien und die Entwicklung von Zelltherapien. Da die Blutbildung im Embryo Erlöse aus hemogenic Endothel (HE) durch eine endotheliale hämatopoetischen Gangs 1,2, die Erzeugung von HE in Kulturen wäre sehr wichtig, um die molekularen Mechanismen, die zur Regelung der Endothelzellen zu hämatopoetischen Übergangs und hämatopoetischen Spezifikation zu studieren. Derzeitigen Methoden für die Untersuchung der ER auf der Induktion von Differenzierung in hematoendothelial Aggregate (EVG) mit dem Zusatz von hämatopoetischen Cytokinen 3-5 und Cokultur hPSCs mit Hämatopoese-stützende Stromazellen 6,7 oder zweidimensionalen Kulturen mit extrazellulären basierend Matrizen und cytokines 8,9. Diese klassischen Differenzierung Methoden basieren auf der Einführung von Schauspiel an der Zelloberfläche und die Einleitung Kaskaden von molekularen Signalwege, die schließlich zur Aktivierung von Transkriptionsprogramm Führungs hematoendothelial Entwicklung führen externe Signale. Somit stützt sich der Wirkungsgrad hPSCs Differenzierungen in diesen Systemen auf einem effektiven Induktion von jenen Signalen, die Signaltransduktion in den Zellkern und die resultierende Aktivierung spezifischer Transkriptionsregulatoren. Darüber hinaus ist die Untersuchung von HE in herkömmlichen Differenzierungskulturen erfordert den zusätzlichen Schritt der Isolierung von HE-Zellen unter Verwendung der Zellsortierung. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die direkte Induktion von HE und Blut durch die Überexpression von hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren. Dieses Verfahren ermöglicht die effiziente Induktion HE in eine Schale und eine direkte Beobachtung der endothelialen hämatopoetische Übergang ohne die Notwendigkeit zur Isolierung von HE mit einem umständlichen Zellsortierungsverfahren. Bildung HE und Blut von menschlichen pluripotenten Stammzellen können effizient durch Überexpression nur wenige Transkriptionsfaktoren (TFs) induziert werden. Die optimale Kombination von Transkriptionsfaktoren, die zur Induktion robust pan-myeloischer Blutbildung aus hPSCs umfasst ETV2 und GATA1 oder GATA2. Im Gegensatz dazu Kombination GATA2 und TAL1 induziert erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmieren hPSCs durch Überexpression dieser Faktoren unterscheidet hPSCs direkt an das VE-cad + CD43 - CD73 - HE Zellen, die stufenweise den hämatopoetischen Phänotyp durch Expression von frühen hämatopoetischen Marker CD43 7 definiert erhalten. Diese lentiviralen basierendes Verfahren für die direkte Programmierung der menschlichen pluripotenten Stammzellen Verfahren ist anwendbar zur Erzeugung von HE und Blutzellen für mechanistische Studien, Studien endothelialer hämatopoetische Übergang und transkriptionale Regulation der hämatopoetischen Entwicklung und Spezifikation. Obwohl der current Protokoll beschreibt die Blutbildung mit konstitutiver Expression der Transgene, könnten ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von modifizierten mRNA 10 erhalten werden.

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61061</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61063</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61062</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61062</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61064</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td>Cationic polymer used to increase the efficiency of infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td>RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td rowspan="2">A11105-01</td>
			<td rowspan="2">Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete (growth factor- free) culture medium&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mTeSR1 Custom formulation&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>MCF</td>
			<td><a name="RANGE!D12">Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td>Research grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-cad) FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560411</td>
			<td>Endothelial marker (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD226 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>338305</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560199</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 APC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB5795A</td>
			<td>Endothelial marker (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555485</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Live/Dead assay (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Cell fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML&#160;</td>
			<td>Permeabilization&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD43</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551457</td>
			<td>Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human VE-cadherin</td>
			<td>BenderMedSystem</td>
			<td>BMS158</td>
			<td>Primary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated</td>
			<td>JacksonResearch</td>
			<td>715-486-152</td>
			<td>Secondary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated</td>
			<td>JacksonResearch</td>
			<td>715-516-150&#160;</td>
			<td>Secondary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nucleic acid stain</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td>D1306&#160;</td>
			<td>Live/Dead assay (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>4435</td>
			<td>CFC-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright Stain solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32857</td>
			<td>Staining cytospins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table 2. hPSCs culture.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells</td>
			<td>hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete serum-free medium for culture of hPSCs&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mTeSR1 media&#160;&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>M500&#160;</td>
			<td>Serum-free&#160; medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences/ Corning&#160;</td>
			<td>356234</td>
			<td>Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, powder&#160;</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td>12500-062</td>
			<td>Basal Medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Dulbecco&#39;s PBS powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dSH30013.04</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dispase II, powder</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td rowspan="2">17105-041</td>
			<td rowspan="2">Neutral protease, Cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primer&#39;s Name</td>
			<td>Forward (Fwd)&#160; 5&#8217; --&#62;3&#8217;</td>
			<td>Reverse (Rev) 5&#8217;--&#62;3&#8217;</td>
			<td>Discription&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN EF1a Fwd</td>
			<td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA</td>
			<td>--</td>
			<td>EF1a promoter sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA1 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAL1 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMO2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETV2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC&#160;</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct induction of hemogenic endothelium and blood by overexpression of transcription factors in human pluripotent stem cells

Während der Entwicklung von einer Fachuntergruppe von Endothelzellen entstehen hämatopoetischen Zellen, hemogenic Endothel (HE). Modellierung HE Entwicklung in vitro ist für mechanistische Studien der endothelialen-hämatopoetischen Übergangs und blutbildenden Spezifikation. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die effiziente Induktion von HE aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) durch Überexpression von verschiedenen Sätzen von Transkriptionsfaktoren. Die Kombination von ETV2 und GATA1 oder GATA2 TFs wird verwendet, um die er mit pan-myeloischer Potential zu induzieren, während eine Kombination von GATA2 und TAL1 Transkriptionsfaktoren können zur Herstellung von SE mit erythroiden und megakaryozytischen Potential. Die Zugabe von LMO2 zu GATA2 und TAL1 Kombination wesentlich beschleunigt Differenzierung und erhöht erythroiden und Megakaryozyten-Zellen-Produktion. Dieses Verfahren stellt eine effiziente und schnelle Möglichkeit HE Induktion aus hPSCs und ermöglicht die Beobachtung des Endothel-hematopoietic Übergang in der Kulturschale. Das Protokoll enthält hPSCs Übertragungsverfahren und nach der Transduktion Analyse von HE und Blutvorläuferzellen.

Die schematische Darstellung des HE und Blut Induktion aus hPSCs durch Überexpression von Transkriptionsfaktoren ist in Abbildung 1 ETV2 mit GATA1 oder GATA2 Kombination gezeigt, induziert pan-myeloischer Blutbildung, während ein GATA2, TAL1 +/- LMO2 Kombination induziert vorwiegend erythro-megakaryozytären Hämatopoese. Beide TF-Kombinationen direkt induzierte HE-Zellen, die anschließend in Blutvorläuferzellen mit einem ausgeprägten Spektrums von hämatopoetischen Differenzierung verwandelt. Diff...

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Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K Aufrufe.  University of Wisconsin-Madison. This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors. 

Serie: Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Menschliche pluripotente Stammzelle Basierend Entwicklungstoxizität Assays für chemische Sicherheit Screening und Systembiologie Datengenerierung

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.