Dieses Protokoll beschreibt einen In-vitro-Keimungs-Angiogenese-Assay, der viele Merkmale der Bildung von Blutgefäßen rekapituliert und zum Testen von Medikamenten verwendet werden kann. Diese Methode ist einfach im Labor zu implementieren, robust und skalierbar. Es hat viele Ähnlichkeiten mit Assays, die menschliche Endothelzellen und Mikrosphären verwenden.
Dieses Modell ahmt robust den Phänotyp nach, der eine fehlerhafte Selektion der Endothelspitzenzellen und eine orientierte Endothelzellmigration zeigt, die zu einer pathologischen Angiogenese führt. Die Arbeit kann Einblicke in die Mechanismen liefern, die die Angiogenese von Keimungen regulieren, die Schlüsselgene und die beteiligten Signalwege, insbesondere durch die Durchführung eines genetischen Screenings. Die größte Herausforderung besteht darin, die Qualität oder Pluripotenz embryonaler Stammzellen der Maus in Kultur zu erhalten. Die regelmäßige Überprüfung der Pluripotenzstadien und der Morphologie der Zelllinien ist wichtig.
Es ist auch wichtig, eine Karyotypisierung der Zelllinien durchzuführen, da sie dazu neigen, Chromosomen zu verlieren oder zu gewinnen. Beschichten Sie zunächst eine Vertiefung der Sechs-Well-Zellkulturplatte mit 500 Mikrolitern 0,1%iger Gelatinelösung und legen Sie sie für 30 Minuten in einen Kohlendioxid-Inkubator. Waschen Sie dann die gelatinebeschichteten Platten mit PBS und fügen Sie 500 Mikroliter frisch zubereitetes CM plus Minusmedium hinzu.
Um eine reine Population von embryonalen Stammzellen oder mES-Zellen der Maus zu erhalten, trypsinisieren Sie die Zellkulturplatte mit 10x TVP-Puffer für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Anschließend werden die Zellen in einem Milliliter Mesoderm-Differenzierungsmedium resuspendiert, bevor sie für 30 Minuten auf die mit Gelatine beschichtete Sechs-Well-Platte übertragen werden, damit sich die embryonalen Fibroblasten der Maus anheften können, während die mES-Zellen in Suspension bleiben. Die Zellsuspension wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt, bevor lebende Zellen mit einem Neubauer-Hämozytometer in Trypanblau gezählt werden.
Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem geeigneten Volumen des Mesoderm-Differenzierungsmediums. Bereiten Sie vier 94-Millimeter-Styroporschalen mit niedrigem Aufsatz vor, indem Sie 15 Milliliter steriles Wasser auf den Boden geben.
Nachdem Sie die Zellsuspension in ein steriles Kunststoffreservoir überführt haben, laden Sie vier Positionen einer Mehrkanalpipette mit 22 Mikrolitern Zellsuspension pro Kanal. Heben Sie den umgedrehten Deckel der 94-Millimeter-Schale an und legen Sie ihn mit der Innenseite nach oben auf die saubere Oberfläche des Durchlaufschranks. Geben Sie 40 Tropfen der Zellsuspension auf die Innenfläche jedes Deckels und drehen Sie den Deckel vorsichtig ohne Störung um, um ihn wieder auf die Schale zu legen, so dass die Tropfen dem Wasser zugewandt sind.
Inkubieren Sie die Gerichte vier Tage lang in einem Kohlendioxid-Inkubator, wobei Sie dies als Differenzierungstag Null betrachten. Nach vier Tagen Inkubation werden die hängenden Tropfen mit einer P1000-Pipette in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Lassen Sie EB im Röhrchen sedimentieren, bevor Sie den Überstand entfernen.
Resuspendieren Sie die EBs in drei Millilitern 2x vaskulärem Differenzierungsmedium, bevor Sie die EB-Suspension in eine 60-Millimeter-Agar-beschichtete Schale überführen und gleichmäßig verteilen. Inkubieren Sie die Gerichte in einem Kohlendioxid-Inkubator bis zum neunten Tag mit einer mittleren Auffrischung alle zwei Tage. Bereiten Sie eine 35-Millimeter-Kulturschale vor, indem Sie einen Milliliter des Keimmediums auf den Boden geben.
Um die Gelierung einzuleiten, inkubieren Sie die Schüssel fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie neun Tage alte EBs aus einer Agarschale in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die EBs in zwei Millilitern kaltem Keimmedium, um sie in die Kulturschale zu geben, die mit der ersten Schicht Keimmedium beschichtet ist.
Verteilen Sie die EBs auf der gesamten Platte und achten Sie darauf, dass sie sich in gleichem Abstand zueinander befinden. Die erste Sprossbildung sollte nach einer Inkubationszeit von etwa 24 bis 48 Stunden sichtbar sein. Verwenden Sie am 12. Tag einen Spatel, um das Kollagengel, das EBs enthält, vorsichtig auf einen Objektträger zu übertragen.
Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette und dehydrieren Sie das Gel, indem Sie eine Mullfolie aus Nylonleinen und saugfähige Filterkarten auf das Gel legen. Üben Sie zwei Minuten lang Druck mit einem Gewicht von 250 Gramm aus. Entfernen Sie dann die Nylonpapiere, damit die Objektträger 30 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen können.
Nach dem Trocknen fixieren Sie die EBs mit Zinklösung über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag das Fixiermittel, bevor Sie die Objektträger fünfmal mit PBS waschen. Permeabilisieren Sie die EBs und PBS, die 0,1 % Triton X-100 enthalten.
Entfernen Sie nach 15 Minuten die Permeabilisierungslösung, um die Objektträger fünf Minuten lang fünfmal mit PBS zu waschen. Inkubieren Sie die EBs im Blocking-Puffer für eine Stunde bei Raumtemperatur und waschen Sie sie fünf Minuten lang mit PBS. Dann den im Blockierungspuffer verdünnten Primärantikörper zugeben und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.
Anschließend inkubieren Sie die Objektträger mit dem Sekundärantikörper Goat Anti-Rat Alexa 555 in einem Blockierungspuffer für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Objektträger nach der Inkubation dreimal fünf Minuten lang mit PBS und einmal mit Wasser, bevor Sie sie für die Mikroskopie montieren. Der 3D-Keimungs-Angiogenese-Assay wurde an drei EBs mit zwei Wirkstoffen, DC101 und DAPT, durchgeführt.
Beide Verbindungen blockierten die Angiogenese im EB-Modell progressiv mit zunehmenden Konzentrationen. Die unterschiedlichen Konzentrationen von Medikamenten in EBs zeigten, dass hohe Dosen von DC101 die Anzahl und Länge der Gefäßkeime hemmen. DAPT hatte bei einer Dosis von einem Mikromol pro Liter gegenteilige Effekte.
DAPT erhöhte im Vergleich zu DC101 die Anzahl der Endothelspitzenzellen pro Gefäßsprossen, die selbst bei niedrigen Dosen einen fehlgeleiteten Phänotyp aufwiesen, stark. Defekte Gefäßsprossen wurden in hereditären hämorrhagischen Teleangiektasien-EBs aus ACVRL1-Kontroll- und ACVRL1-heterozygoten Genotypen beobachtet, wobei zahlreiche fehlgeleitete Phänotypen in zufälligen Winkeln relativ zu den Elterngefäßen sprießten. Mischungen einer Wildtyp-mESC-Linie im Verhältnis eins zu eins mit einer unmarkierten mESC-Wildtyp-Linie führten zu einem gleichen Beitrag zu den führenden Endothelspitzenzellen.
Eine mikroskopische Analyse dieser repräsentativen chimären EB wurde durchgeführt, um den genotypischen Ursprung der führenden Endothelspitzenzellen zu identifizieren. Um die Bedeckung der Muralzellen des Gefäßsprosses zu quantifizieren, wurden EBs fixiert und auf Endothelzellmarker, PECAM, und Muralzellmarker, Alpha Smooth Muscle Actin, gefärbt. Ein Bild mit hoher Vergrößerung zeigte, dass ein einzelner Gefäßspross von Wandzellen umgeben war.
Die binäre Transformation wurde nach Farbkanaltrennung durchgeführt und der Anteil der PECAM-positiven Gefäße, die von alpha-SMA-positiven Wandzellen bedeckt waren, quantifiziert. Auch der genetische Hintergrund der embryonalen Stammzelllinie ist ein wichtiger Faktor, den die Forscher berücksichtigen müssen, da einige Linien besser sprießen als andere. Mit dieser Methode kann ein genetisches Screening mit RNAi-Ansätzen oder einer Bank embryonaler Stammzellen der Maus durchgeführt werden, die Genmutationen aufweisen.
