Das onkolytische Herpes-simplex-Virus ist eine emergente Form der Krebsimmuntherapie. Ein effizientes System der Virusvermehrung, -reinigung und -bestimmung ist entscheidend für den Einsatz in experimentellen Studien. Diese Methode ist sehr einfach und kann leicht in jedem Labor der Biosicherheitsstufe zwei eingesetzt werden, um einen qualitativ hochwertigen Virusbestand für präklinische Studien zu erhalten.
Die Produktion eines hochwertigen, reinen Virusbestands ist von entscheidender Bedeutung, da er zur Untersuchung der Immunantwort gegen Krebs und zur Entwicklung einer neuartigen Form der virusbasierten Krebsimmuntherapie verwendet wird. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um jedes Wildtyp- oder gentechnisch veränderte Herpes-simplex-Virus zu reinigen. Dieses Protokoll sollte für eine Person, die diese Technik noch nie zuvor durchgeführt hat, leicht zu lesen und leicht zu befolgen sein.
Die aufgeführten Materialien und Reagenzien sollten vorhanden sein, bevor Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren. Beginnen Sie mit dem Waschen der T-150 Quadratzentimeterkolben mit zweifach hohen Glukose-DPBS, ergänzt mit 1% IFCS. Saugen Sie das DPBS an und fügen Sie sieben Milliliter Virusinokum pro Kolben hinzu.
Die Kolben fünf Minuten lang vorsichtig schaukeln und bei 37 Grad Celsius 1,5 bis 2 Stunden inkubieren. Entfernen Sie dann das Inokum und fügen Sie jedem Kolben 25 Milliliter DMEM hinzu, ergänzt mit 1% IFCS. Nach der Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei bis vier Tage 20 Milliliter des Kulturüberstandes aus jedem Kolben in 50 Milliliter Zentrifugenröhrchen sammeln.
Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber vom Boden der Kolben ab. Geben Sie etwa 15 Milliliter des zuvor gesammelten Kulturüberstands in jeden Kolben, um das Volumen auf 20 Milliliter zu erhöhen, und verwenden Sie dann eine sterile serologische Pipette von 10 Millilitern, um den Boden der Kolben einige Male vorsichtig zu waschen. Sammeln Sie die Zellen mit Medium in 50 Milliliter konische Zentrifugenröhrchen, die auf Eis gelegt werden.
Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie jedes Pellet gründlich in 1,25 Milliliter Viruspuffer oder VB und 1,25 Milliliter zuvor gesammelter Kulturüberstand. Mischen Sie alle resuspendierten Pellets in einem 50 Milliliter konischen Zentrifugenröhrchen.
Schnappen Sie die resuspendierten Zellen mit Trockeneis und 100% Ethanol ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Die zuvor geschnappten gefrorenen Zellen in einem warmen Wasserbad bei 37 Grad Celsius auftauen und eine Minute lang für drei Zyklen in einem Wasserbad beschallen. Fügen Sie 175 Einheiten Benzonase-Nuklease und zwei Mikroliter von zwei millimolarem Magnesiumchlorid pro Milliliter Zelllysat und Wirbel hinzu.
Nach einer Inkubation von 30 Minuten und einem warmen Wasserbad bei 37 Grad Celsius den Schlauch auf Eis legen. Drehen Sie das Zelllysat bei 300 mal G für 10 Minuten. Sammeln Sie den Überstand in einem neuen 50 Milliliter konischen Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern VB. Bezeichnen Sie es als Pellet eins.
Drehen Sie den gesammelten Überstand erneut bei 500 mal G für 10 Minuten und lagern Sie den Überstand separat in einem frischen 50 Milliliter konischen Zentrifugenröhrchen, um es später zu verwenden. Resuspend das Zellpellet in 500 Mikroliter VB und bezeichnen Sie es als Pellet zwei. Kombinieren Sie das resuspendierte Pellet eins und Pellet zwei in einem neuen 1,75 Milliliter Zentrifugenrohr und Wirbel und beschallen Sie zweimal in einem Wasserbad, bevor Sie die Röhrchen bei 400 mal G für 10 Minuten drehen.
Sammeln Sie den Überstand aus dem 1,7-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und kombinieren Sie ihn mit dem zuvor gesammelten 50-Milliliter-Kegelzentrifugenröhrchen. Filtern Sie den Überstand durch einen sterilen fünf Mikrometer großen PVDF-Membranfilter in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenrohr namens Tube One. Fügen Sie einen Milliliter VB in das 50-Milliliter-Zentrifugenrohr hinzu, das nach dem Filtern des Überstands aus dem vorherigen Schritt, Dem Wirbel, entleert wurde, und führen Sie es durch den gleichen PVDF-Membranfilter, der auf Rohr eins platziert ist.
Leiten Sie das Filtrat von Rohr eins durch einen sterilen 0,8 Mikrometer MCE-Membranfilter, der auf einem neuen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen namens Rohr zwei platziert ist. Fügen Sie einen Milliliter VB in das entleerte Rohr eins, Wirbel, hinzu und führen Sie es durch den gleichen MCE-Filter, der auf Rohr zwei platziert ist. Leiten Sie das Filtrat von Rohr zwei durch einen sterilen 0,45-Mikrometer-PVDF-Filter, der auf einem neuen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung Rohr drei platziert ist.
Wie bereits beschrieben, wiederholen Sie das Waschen von Rohr zwei mit einem Milliliter VB, um Filtrat zu Rohr drei hinzuzufügen. In dieser repräsentativen Analyse konnte der zytopathische Effekt in Vero-Zellen 36, 48 und 72 Stunden nach der oHSV-Infektion mit der Rundung der betroffenen Zellen beobachtet werden. Das im Laufe der Zeit zunehmende CPE-Niveau ist offensichtlich, wie durch den mCherry-Ausdruck visualisiert.
72 Stunden nach der Infektion wurden virale Plaques mit X-gal gefärbt, um oHSVs mit lacZ-Expression zu visualisieren. Das sanfte Abwaschen von virusinfizierten Zellen und das sanfte Waschen des Bodens auf dem Kolben ist entscheidend, um alle HSV-infizierten Zellen intakt zu halten, damit ein virusreicher Bestand mit hohem Titergehalt erhalten werden kann.
