Das Protokoll hilft den Schülern, einzelne Infektionen klar zu identifizieren und den Assay einfach durchzuführen, wodurch es effizienter wird, den viralen Titer zu quantifizieren. Dieses Protokoll beinhaltet ein einfaches Fixierungs- und Färbeverfahren, das zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Diese Methode kann einen Einblick in die Genauigkeit und Wirksamkeit antiviraler Behandlungen gegen Krankheiten geben.
Die schwierigeren Hürden dieses Plaquing-Protokolls sind die Zellzahlen für die Aussaatplatten, um sicherzustellen, dass die Zellen während des gesamten Prozesses nicht überfüllt, austrocknen oder zerkratzt werden. Man kann auch Schwierigkeiten in der insgesamt akribischen Natur dieses Protokolls haben. Die Praxis trägt jedoch wesentlich zum Erfolg dieses Experiments bei.
Schließen Sie zunächst die Probenverdünnung unter Zugabe von Viren zu Zellen in einer Laborsitzung ab. Verdünnen Sie seriell jede Virusprobe, die in PBS plaquet wird. Verwenden Sie in der Regel 10-fache Verdünnungen für die präziseste Nachverfolgung.
Halten Sie alle viralen Verdünnungen auf Eis, bis Sie bereit sind, diese verdünnten Virusproben zu den Zellen hinzuzufügen. Entfernen Sie das Zellkulturmedium mit einer Pipette aus einer oder zwei Vertiefungen. Fügen Sie die verdünnte Virusprobe tropfenweise zu jeder Monoschicht von Zellen tropfenweise durch die Seite jedes Brunnens hinzu.
Wiederholen Sie den Vorgang für alle ein oder zwei Vertiefungen, bis die gesamte Platte mit den Virusproben gefüllt ist, die mit Plaque behaftet sind. Den gesamten Teller vorsichtig von Hand schaukeln. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um die Virusadsorption zu ermöglichen.
Entfernen Sie alle 10 Minuten die Platte aus dem Inkubator, schaukeln Sie sie vorsichtig wieder, um das Virus gleichmäßiger über jedes Bohrloch zu verteilen, und legen Sie es dann wieder in den Inkubator. Um die Möglichkeit zu verringern, versehentlich nicht absorbiertes Inokulum zu zählen, entfernen Sie die Virusprobe mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze aus den Vertiefungen und entsorgen Sie die Probe in einem Abfallbecherglas. Legen Sie 2,5 Milliliter eines Methylcellulose-Overlays auf die Platte und legen Sie es wieder in den Inkubator.
Desinfizieren Sie das Abfallbecherglas, typischerweise unter Zusatz von Bleichmittel, einem Iodophor oder einem ähnlichen Viruzid, bevor Sie es aus der Biosicherheitskabine entfernen. Entfernen Sie nach der zweitägigen Inkubation das Methylcellulose-Overlay mit einer Pipette aus einer oder zwei Vertiefungen gleichzeitig und legen Sie es in ein Abfallbecherglas. Fügen Sie etwa zwei Milliliter 1% Kristallviolett in 50% Ethanol zu jeder Vertiefung hinzu.
Inkubieren Sie die Platte mit allen mit dem Fleck gefüllten Vertiefungen für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Desinfizieren Sie an dieser Stelle das Abfallbecherglas, wie zuvor gezeigt. Waschen Sie die Teller kräftig mit Leitungswasser, bis der Abfluss klar ist.
Stellen Sie sicher, dass es ungefähr 10-fache Unterschiede in der Anzahl der Plaques über jede Verdünnungsreihe hinweg gibt. Die Abbildung zeigt eine 10-fache Abnahme der Plaque-Anzahl, wobei die abzählbare Anzahl von Plaques für alle drei Replikate in den Bereich von 10 bis minus vier fiel. Die ersten drei Bilder in der Abbildung zeigen Tafeln in der 10 bis minus drei Verdünnung.
Die untere Reihe zeigt jedoch Ergebnisse, wenn ein Plaque-Assay nicht gut durchgeführt wird. Es gibt nur sehr wenige Plaques, die von einer Verdünnung in den sichtbaren Bereichen um die Oberseite sichtbar sind, wo die Vero-Zellen vollständig vom Substrat abgehoben wurden. In ähnlicher Weise zeigt diese Abbildung Probleme mit dem Austrocknen von Zellen oder der falschen Handhabung während des Plaque-Assays.
Diese Zahl zeigt jedoch kritisch eine schlechte Vero-Zellaussaat. Jeder Brunnen zeigt dunklere violette Flecken, die auf Zellen hinweisen, die sich nicht gut über den Brunnen ausbreiten und in Clustern übereinander gestapelt sind. Für beste Ergebnisse stellen Sie sicher, dass das Virus gleichmäßig über die Platte verteilt wird, um verklumpte Plaque-Assays zu vermeiden. Plaque-Assays sind effektiver als andere quantitative Methoden, da sie nur lebende Viren zählen.
Auf diese Weise kann eine echte antivirale Wirksamkeit festgestellt werden. Darüber hinaus hat uns diese Technik ermöglicht, die virale Präsenz auf Fomiten zu quantifizieren und die Wirksamkeit der Arzneimittelabgabe von neuartigen Medizinprodukten in unserem Bereich der Herpesvirusforschung zu untersuchen.
