Das Protokoll ermöglicht es uns, die Veränderungen in der zweiten Umstrukturierung der DNA zu visualisieren, die durch ATP-abhängige Chromatin-Remodeling-Proteine induziert wird. Die Veränderung der DNA-Struktur kann mit der Transkriptionsregulation korreliert werden. Dies ist eine einfache und hochempfindliche Technik, die eine sehr kleine Menge reiner DNA verwendet, um die strukturellen Veränderungen im Oligonukleotid aufzuzeichnen.
Diese Methode kann Einblicke in die Transkriptionsregulation geben, die durch ATP-abhängige Chromatin-Remodeling-Proteine vermittelt wird. Bereiten Sie zunächst die Arbeitskonzentrationen von Puffern und anderen Reaktionskomponenten frisch vor und halten Sie sie bei vier Grad Celsius, bevor Sie die Reaktionen einrichten, und messen Sie dann die ATPase-Aktivität des Proteins in Gegenwart verschiedener DNA-Moleküle mit einem NADH-gekoppelten Oxidationsassay. Mischen Sie 0,1 Millimolar ADAAD, zwei Millimolar ATP, 10 Nanomolar DNA und 1X REG Puffer in einer 96-Well-Platte zu einem Endvolumen von 250 Mikrolitern.
Als nächstes inkubieren Sie die Reaktion für 30 Minuten in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator und messen Dann die Menge an NAD + mit der mitgelieferten Software zusammen mit dem Mikroplattenleser. Um die Absorption bei 340 Nanometern zu messen, klicken Sie auf den NADH-Assay und legen Sie die 96-Well-Platte auf den Plattenhalter im Instrument, dann klicken Sie auf die Taste zum Lesen der Platte, um die Absorption aufzuzeichnen. Sammeln Sie die CD-Spektren in hochtransparenten Quarzküvetten.
Verwenden Sie entweder rechteckige oder zylindrische Küvetten. Um die Küvetten zu reinigen, waschen Sie sie mehrmals mit Wasser und scannen Sie dann das Wasser oder den Puffer in der Küvette, um zu überprüfen, ob sie sauber ist. Verwenden Sie für die Reaktionen PAGE-gereinigte DNA-Oligonukleotide.
Für eine schnelle Abkühlung die DNA drei Minuten lang auf dem Heizblock bei 94 Grad Celsius erhitzen und sofort auf Eis abkühlen lassen. Für eine langsame Abkühlung, nachdem Sie die DNA drei Minuten lang auf 94 Grad Celsius erhitzt haben, lassen Sie sie mit einer Rate von einem Grad Celsius pro Minute auf Raumtemperatur abkühlen. Um die Baseline-Spektren zu erfassen, stellen Sie insgesamt fünf Kontrollreaktionen nacheinander in 1,5 Milliliter-Zentrifugenröhrchen ein.
Halten Sie das Reaktionsvolumen bei allen Reaktionen bei 300 Mikrolitern. Um die CD-Spektren aufzuzeichnen, stellen Sie insgesamt fünf experimentelle Reaktionen nacheinander in 1,5 Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf. Um den Scan aufzuzeichnen, schalten Sie das Gas ein und schalten Sie das CD-Spektrometer ein.
Nach 10 bis 15 Minuten schalten Sie die Lampe ein, schalten das Wasserbad ein und stellen die Haltertemperatur auf 37 Grad Celsius ein. Öffnen Sie als Nächstes die CD-Spektrum-Software und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius, den Wellenlängenbereich auf 180 bis 300 Nanometer, die Zeit pro Punkt auf 0,5 Sekunden und die Scannummer auf fünf, klicken Sie dann auf den Pro-Datenbetrachter, erstellen Sie eine neue Datei und benennen Sie sie mit den Details des Experiments und dem Datum um. Als nächstes mischen Sie die Basis- und experimentellen Reaktionen durch Pipettieren und übertragen Sie die Reaktionsmischungen vorsichtig nacheinander auf die Küvette, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
Wenn Sie ein Zeitverlaufsexperiment durchführen, inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für die erforderliche Zeit und machen Sie dann den Scan. Fügen Sie EDTA zu dem Puffer hinzu, der die DNA, ATP, Magnesium und Protein enthält, um die ATP-Hydrolyse zu stoppen. Um die ATPase-Aktivität vollständig zu hemmen, erhöhen Sie die EDTA-Konzentration und die Inkubationszeit.
Subtrahieren Sie die Baselines von den entsprechenden Reaktionen in der Software und glätten Sie die Daten entweder in der CD-Spektrum-Software oder in der Datendiagrammsoftware, zeichnen Sie dann einen Graphen der Wellenlänge gegen die mittlere Rückstandselliptik und analysieren Sie die Peaks. M-Falten zeigten, dass beide Stränge der MYC-DNA eine stammschleifenartige Struktur bilden könnten. Die M-faltigen Strukturen der vorderen und der umgekehrten DNA-Sequenz, die den G-Quadruplex GECE enthält, sind hier dargestellt.
Die CD-Spektren von schnell gekühltem GECE in Abwesenheit und Anwesenheit von ATP und ADAAD zeigten, dass ADAAD zwei positive Peaks induziert, einen bei 258 Nanometern und den anderen bei 210 Nanometern. Die Zugabe von EDTA hebt diese Konformationsänderung auf. Die CD-Spektren haben nun einen negativen 210-Nanometer-Peak und ein breites positives Band mit Peaks bei 230 und 250 Nanometern.
QGRS-Mapper- und M-Faltungsanalysen zeigten, dass die Promotorregionen von DROSHA, DGCR8 und DICER das Potenzial besitzen, G-Quadruplex- und stammartige Strukturen zu bilden. Die CD-Spektren des DROSHA-Paares fünf zeigten, dass ADAAD einen negativen Peak bei 210 Nanometern und einen positiven Peak bei 260 Nanometern induziert. Dieses Spektrum ist ein Merkmal von ADNA.
Die CD-Spektren des DGCR8-Paares zeigten einen positiven Peak bei 210 Nanometern und einen breiten negativen Peak bei 260 Nanometern. Dieses Spektrum ist charakteristisch für den Übergang von B nach X. Für das DGCR8-Paar sieben wurden starke positive Peaks bei 210 und 270 Nanometern und ein negativer Peak bei 250 Nanometern beobachtet.
Dieses Spektrum ist charakteristisch für parallele G-Quadruplex-DNA-Strukturen. Schließlich wurden für das DICER-Paar eins ein positiver Peak bei 210 Nanometern und zwei negative Peaks, einer bei 230 Nanometern und der andere bei 260 Nanometern, beobachtet. Diese Peaks sind charakteristisch für einen DNA-Übergang von A nach X.
Stellen Sie sicher, dass die Reinheit von DNA und Protein 99% oder mehr beträgt. Die Küvette sollte sauber sein und die Grundlinie sollte weniger als einen Milligrad betragen. Alle Reagenzien sollten rein sein, so dass der Hintergrund weniger als ein Milligrad beträgt.
