Dieses Protokoll verwendet einen neuartigen Ansatz zur Probenahme des Chorions aus geschlüpften Schmetterlingsovi für die genetische Analyse. Es kann besonders nützlich sein, wenn andere Gewebeentnahmetechniken unpraktisch, nicht verfügbar oder nicht zulässig sind. Dieses Protokoll hat relativ niedrige Gesamtkosten mit einfach zu beschaffenden Vorräten und zielt auf organisches Restmaterial ab, wodurch die Notwendigkeit entfällt, lebende Organismen vorübergehend zu fangen oder zu manipulieren und möglicherweise zu schädigen, um genetische Proben zu erwerben.
Das Gesamtprotokoll ist unkompliziert und leicht zu erlernen, erfordert jedoch Geschicklichkeit und strenge Liebe zum Detail, insbesondere um sehr kleine Zielproben erfolgreich zu lokalisieren, zu identifizieren und zu entfernen, um Kreuzkontaminationen zwischen Probenentnahmeereignissen zu vermeiden. Beginnen Sie mit der sorgfältigen Überprüfung und Zusammenstellung der vollständigen Liste der benötigten sammlungsbezogenen Vorräte. Wenn die Probenentnahme an mehreren Standorten oder durch mehrere Einzelpersonen oder Teams erfolgt, sammeln und organisieren Sie alle benötigten Vorräte in separaten einsatzfähigen Einheiten.
Transport von Hilfsgütern an Wissenschaftler der Gemeinschaft oder anderes Personal, das für die Feldsammlung verantwortlich ist. Wenn das Personal nicht vor Ort ist, verpacken Sie die Vorräte sorgfältig in einen separaten Versandkarton mit einem vollständigen Versandetikett und versenden Sie sie. Überprüfen Sie nach Erhalt der Sammelmaterialien einschließlich der Sammelverpackung sorgfältig die laminierte Lieferliste und führen Sie eine vollständige Bestandsaufnahme durch.
Benachrichtigen Sie den Projektleiter, wenn Vorräte fehlen. 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit 180 Mikroliter Lysepuffer vorfüllen. Kleben Sie ein vorgedrucktes, eindeutiges ID-Etikett auf jedes Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie alle Röhrchen in die Aufbewahrungsbox für 64-Well-Mikrozentrifugenröhrchen.
Verschließen Sie den Deckel nach dem Beladen fest. Stellen Sie sicher, dass alle digitalen Geräte vollständig aufgeladen sind und alle Ersatzbatterien verpackt sind. Füllen Sie einen kleinen Kühler teilweise mit Eis für die Feldlagerung und den lokalen Transport der gesammelten Proben.
Verpacken Sie alle Sammelutensilien in die Sammelgerätebox oder einen ähnlichen stabilen wetterfesten Behälter für sicheren Transport und konsolidierte Lagerung. Überprüfen Sie das zerstörungsfreie Protokoll zur Entnahme genetischer Proben und Details, bevor Sie sich auf den Weg machen. Wenn Sie am Standort vor Ort ankommen, verwenden Sie einen Bleistift oder einen Allwetterstift, um die Tageszeit, das Datum, den allgemeinen Eigenschaftsnamen, den Namen oder die Beschreibung des Standorts eines bestimmten Feldstandorts, den GPS-Messwert, falls verfügbar, sowie den vollständigen Namen und die Rollen aller im wetterfesten Feldnotizbuch anwesenden Personen aufzuzeichnen.
Finden Sie einen geeigneten Lebensraum für die Anwesenheit einer Larvenwirtspflanze für den artspezifischen Zielschmetterling. Machen Sie mit einem Smartphone oder einer Kamera detaillierte Fotos von allen Feldstandorten, Probenentnahmeorten, Wirtspflanzen und anderen relevanten Informationen. Verwenden Sie Smartphones oder andere Kameras, die GPS-Koordinaten aufzeichnen.
Durchsuchen Sie umfassend alle Larvenwirtspflanzenteile wie Blätter, Blütenknospen, Blüten oder sich entwickelnde Früchte, von denen bekannt ist, dass sie von eistellenden erwachsenen weiblichen Schmetterlingen nach geschlüpften Eiern ausgewählt werden. Suchen Sie bei den meisten Lycaenidae nach weiß geschlüpften Eiern mit einem deutlichen Loch in der Mitte, das einem Donut ähnelt, aus dem die neugeborene Larve hervorgegangen ist. Suchen Sie nach ungeschlüpften Eiern, die dunkler gefärbt sind, oft grün oder bläulich, und ohne ein Loch in der Mitte vollständig intakt sind.
Sobald ein geschlüpftes Ei gefunden ist, tragen Sie Nitrilhandschuhe. Greifen Sie das geschlüpfte Ei mit sterilen und spitzen Pinzetten und ziehen Sie es vorsichtig von der Wirtspflanze und legen Sie es direkt in ein beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen, das mit Lysepuffer vorgefüllt ist. Ebenso können andere Gewebeproben verwendet und verarbeitet werden.
Stellen Sie sicher, dass das gesamte gesammelte Material vollständig in den Lysepuffer in jedem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen eingetaucht ist. Klopfen Sie auf den Boden des Röhrchens auf eine harte Oberfläche, um bei Bedarf die Proben wieder einzutauchen. Wenn Sie eine neue Probe entnehmen, werfen Sie gebrauchte Nitrilhandschuhe weg und ersetzen Sie sie durch ein sauberes Paar.
Reinigen Sie die Pinzettenspitzen nach jeder Eizellentnahme sorgfältig, indem Sie sie in eine Durchstechflasche mit 95% Ethanol aus einer Quetschflasche tauchen oder übergießen oder Alkoholtücher verwenden. Sammeln Sie mindestens fünf Proben pro Wirtspflanzenbeet pro Standort, wobei jede Probe ein bis 20 Eier enthält, wobei insgesamt mehr als 50 Eier an einem Standort angestrebt werden, falls verfügbar. Sammeln Sie ein bis 20 geschlüpfte Eier von mehreren Pflanzen im selben Wirtsbeet in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen und schließen Sie den Deckel fest.
Für Schmetterlingsarten, die größere krautige oder holzige Wirtsarten verwenden, sammeln Sie mehrere Eier von verschiedenen Standorten derselben Pflanze, wenn die Wirtsflecken begrenzt sind. Notieren Sie im wetterfesten Feldnotizbuch das zugewiesene eindeutige ID-Etikett zusammen mit der Art der Probe, der ungefähren Anzahl der geschlüpften Eier und den Entnahmeinformationen. Legen Sie das geschlossene Mikrozentrifugenröhrchen mit der Eirestprobe zurück in die 64-Well-Mikrozentrifugen-Aufbewahrungsbox.
Bewahren Sie die Aufbewahrungsbox in einem Kühler mit Eis auf, während Sie auf dem Feld sind. Legen Sie alle anderen Sammelvorräte in die Sammelbehälterbox für eine sichere und konsolidierte Lagerung und den Transport zwischen den Standorten. Aus diesen 160 Proben wurde erfolgreich DNA aus 88 mit einer durchschnittlichen Konzentration von 1,67 Nanogramm pro Mikroliter extrahiert und die höchste DNA-Ausbeute betrug 26,8 Nanogramm pro Mikroliter.
DNA-Konzentrationen nach Gewebetyp bestätigten, dass die Proben, die einen einzelnen Eirest enthielten, nur eine Eizelle hatten und Proben, die mehrere Eizellen enthielten, mindestens zwei Fälle mit einer Anzahl von zwei bis 20, durchschnittlich 5,3 pro Probe. Materialien zum Sammeln von bis zu 563 Proben wurden an acht Naturschutz- und Gemeindewissenschaftler aus neun Staaten des gesamten Artenspektrums im Osten Nordamerikas geschickt. Die Materialien wurden im Jahr 2021 über drei Monate vor den lokalen Spitzenflugzeiten verschickt.
Insgesamt wurden 160 Calephelis iris-Gewebeproben erhalten. Es ist wichtig, Kreuzkontaminationen zwischen den Proben zu minimieren, sicherzustellen, dass die gesammelte Probe vollständig in den Lysepuffer eingetaucht ist, und das eindeutige ID-Etikett und die Entnahmedaten für jede Probe genau aufzuzeichnen. Dieses Protokoll ermöglichte den breiten Einsatz und die Verwendung durch Gemeindewissenschaftler, um zerstörungsfreie Probenahmen vorhandener Populationen eines seltenen Schmetterlings durchzuführen, um eine bereichsweite genetische Strukturanalyse durchzuführen.
