Die Second-Harmonic Generation Imaging von biologischen Proben ist eine optische Technik, die die Visualisierung von nicht-zentrosymmetrischen Molekülen und ihren Anordnungen ermöglicht, ohne dass eine Markierung oder ein Farbstoff erforderlich ist. Die mit dieser Methode erzeugten Bilder haben einen geringen Hintergrund, da nur sehr wenige biologische Moleküle als harmonische Kraft wirken können. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Technik zur diagnostischen Bildgebung von Tubulin beta-4A im Taiep-Tiermodell.
Tubulinopathien sind kürzlich beschriebene Krankheiten. Aus diesem Grund gibt es nur eine begrenzte Menge an Informationen über die grundlegenden Mechanismen, die der Pathophysiologie auf zellulärer Ebene zugrunde liegen. Schalten Sie zunächst den Pulslaser ein, um sicherzustellen, dass er mit einem optimalen und konstanten Leistungsniveau lasen kann.
Für die Untersuchung von Tisular-Mikrotubuli werden 10 bis 20% der verfügbaren Laserleistung verwendet, was im beschriebenen System 13 bis 26 Milliwatt entspricht, gemessen an der hinteren Brennebene des Objektivs. Drehen Sie den Laser vor der Bildgebung auf 810 Nanometer. Stellen Sie dann sicher, dass das Mikroskop auf das Objektiv ausgerichtet ist, das für die Second-Harmonic Generation (SHG-Bildgebung) verwendet wird.
Entfernen Sie unerwünschte Filter aus dem optischen Erfassungspfad und stellen Sie sicher, dass die Kondensatormembran vollständig geöffnet ist und kein Licht unnötig angehalten wird. Bereiten Sie ein Ölimmersionsobjektiv mit 25x x 0,8 numerischer Apertur mit einem kleinen Tropfen Immersionsöl im Objektiv vor. Befolgen Sie die in der Tabelle aufgeführten Schritte, mit Ausnahme der Laserleistung, die bei Maisstärke weniger als 5% beträgt.
Stellen Sie sich trockene Maisstärke zwischen Glasobjektträgern vor. mit SHG-Parametern zur Erzeugung von SHG-Bildern zeigen sie die Polarisationsrichtung des Lasers an. Nehmen Sie ein Bild von spärlichen Maisstärkekörnern auf und markieren Sie die Orientierung der SHG-Läppchen in der XY-Ebene, die der Laserpolarisationsorientierung entspricht.
Nehmen Sie zur Kontrolle ein weiteres Bild derselben Probe auf, bei der eine Halbwellenplatte in den optischen Pfad eingeführt wird, um die Schwingungsrichtung des Lasers zu ändern. Das resultierende Bild zeigt gedrehte SHG-Signalläppchen. Wenn Sie einen anderen Bandpassfilter für das SHG verwenden, stellen Sie sicher, dass es optimale Übertragungseigenschaften aufweist, indem Sie die Bilder und die Signalintensitäten Pixel für Pixel entlang der Abtastlinie vergleichen.
Bereiten Sie eine Vibratom-Pufferschale vor, die mit einer warmen Hanks'Balanced Salt Solution oder HBSS gefüllt ist. Befestigen Sie das Gehirn mit Cyanacrylatkleber über ein Stück Klebeband an der Probenplatte. Der kaudalste Teil berührt den Klebstoff, so dass die verwendbaren koronalen Abschnitte aus dem gegenüberliegenden rostralen Teil geschnitten werden können.
Übertragen Sie die Probenplatte auf ihre magnetische Halterung in der Pufferschale. Beginnen Sie mit dem Schneiden von 300 bis 500 Mikrometern, bis die Scheiben die gesamte Gehirnoberfläche umfassen. Reduzieren Sie dann die Dicke des Abschnitts auf 160 Mikrometer.
Sobald ein 160-Mikrometer-Schnitt auf Höhe des Corpus callosum geschnitten ist, wird er mit einer modifizierten Pasteur-Glaspipette mit einer großen Flanschöffnung zurückgewonnen. Übertragen Sie den Schnitt in eine saubere Petrischale mit neuem warmen HBSS oder direkt auf das Deckglas oder die Glasbodenschale für die Mikroskopie. Die Probe wird unter das Mikroskop gelegt und durch direkte Beobachtung durch das Okular mit Durchlicht entsprechend unter dem Objektiv positioniert.
Entfernen Sie das überschüssige HBSS, so dass ein dünner Flüssigkeitsfilm die gesamte Probe bedeckt. Überprüfen Sie den Flüssigkeitsfilm alle paar Minuten, um eine übermäßige Verdunstung und Trocknung der Probe zu vermeiden. Bereiten Sie den Mikroskoptisch für die nicht gescannte Bildgebung vor, einschließlich des Schließens aller Türen der dunklen Inkubationskammer oder der Abdeckung der Inkubationskammer mit einem schwarzen Nylon-Polyurethan-beschichteten Gewebe.
Wählen Sie den nicht gescannten Bildgebungsmodus entlang des Übertragungspfads aus. Auf diese Weise wird die Erfassung des schwachen SH-Signals von Tubulin optimiert. Wählen Sie dann das Ziel aus.
Stellen Sie als nächstes eine Laserleistung mit einer Pixelverweilzeit von 12,6 Mikrosekunden ein. Nehmen Sie Bilder auf, die nicht größer als 512 x 512 Pixel sind, mit einer Geschwindigkeit von fünf und durchschnittlich zwei Pixeln für eine durchschnittliche Aufnahmezeit von 15 Sekunden. Nehmen Sie zuerst Bilder mit einem 485-Nanometer-Kurzpassfilter auf und fügen Sie in einem zweiten Schritt einen scharfen 405-Nanometer-Bandpassfilter hinzu.
Schneiden Sie das Kleinhirn mit einem Skalpell in zwei Hemisphären und befestigen Sie sie am mittleren Teil an der Vibratomstütze. Schneiden und fotografieren Sie das Kleinhirn mit den gleichen Vibratom-, Klingen- und Mikroskopeinstellungen, die für das Gehirn beschrieben sind. Wenn die Fasern des Corpus callosum abgebildet werden, werden faserartige kurze Strukturen und abgerundete Elemente im Taiep-Gehirn beobachtet.
Im Gegensatz dazu zeigt das Corpus callosum des Kontrollgehirns ein viel heterogeneres und isotroperes Signal in der gesamten Hirnregion. Der Ursprung des differentiellen Signals liegt speziell im Phänomen der Second-Harmonic Generation, da das Hinzufügen des schmalen Bandpassfilters nur die unspezifische Signalintensität aus den Kontrollbildern verringert, während dieses schwache diffuse Signal selektiv aus der Umgebung der somaartigen und der kurzen länglichen Strukturen in den Taiep-Bildern entfernt wird, die immer intensives SH-Licht erzeugen. Im Kontrollgewebe der zerebellären weißen Substanz wurde das völlige Fehlen eines SH-Signals beobachtet.
Die Purkinje-Zellen sind bei Verwendung des Kurzpassfilters kaum sichtbar, und die länglichen und abgerundeten Strukturen bleiben im SH-Bild des Taiep-Gewebes bestehen. Ein kritischer Schritt, um das beste Bild zu erhalten, besteht darin, Gewebeschnitte so dünn wie möglich zu schneiden. Darüber hinaus erfordert die Arbeit mit akuten Gewebeschnitten schnelle Protokolle, um eine Verschlechterung des Gewebes zu verhindern.
Daher ist es wichtig, das optische System vorher einzurichten und zu überprüfen. Das Signal der zweiten Harmonischen von Mikrotubuli ist schwächer als das Signal der zweiten Harmonischen von Stärke. Daher muss mehr Laserleistung für die Bildgebung von Mikrotubuli eingesetzt werden.
Die Laserleistung sollte vorsichtig erhöht werden, da bei der Bildgebung ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur verwendet wird, die Intensität an der Probe schnell ansteigen würde. Mit der Bildgebung der zweiten harmonischen Generation werden die pathologischen Veränderungen in der zentralen Myelinomatik des tubulinopathischen Modells schnell und einfach identifiziert. Mögliche Anwendungen dieser Technik umfassen die Untersuchung der grundlegenden Mechanismen der H-ABC-Tubulinopathie und die Beurteilung pharmakologischer Therapien zur Behandlung von Patienten. Langfristig hat die Technik das Potenzial, ein komplementäres diagnostisches Instrument zu werden, das intrakraniell oder bei frischen Biopsien eingesetzt werden kann.
