Die Bedeutung dieser Methode besteht darin, dass markierungsfreie Mikrotubuli gleichzeitig mit fluoreszierend markierten Proteinen bei hohen Bildraten abgebildet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die einfache Implementierung und minimale Anforderungen an optische Komponenten. Es umgeht auch die Notwendigkeit einer Fluor-4-Markierung von Mikrotubuli.
Bereiten Sie zunächst das PDMS-Polymer vor, indem Sie das Härter und das Basiselastomer in einem Massenverhältnis von 1:10 kombinieren. Mischen Sie sie zwei Minuten lang und entgasen Sie dann die Mischung in einer Vakuumkammer, bis alle Blasen verschwinden. Danach gießen Sie die Mischung in einer etwa 0,5 Zentimeter dicken Schicht auf die Hauptform, wobei Sie darauf achten, dass keine Blasen entstehen, und backen Sie die Mischung 40 Minuten lang in einem vorgeheizten Ofen bei 70 Grad Celsius.
Schneiden Sie dann die strukturierten Bereiche des Polymers aus und stanzen Sie Löcher an jedem Ende des Kanals mit einem PDMS-Puncher. Bereinigen Sie später die strukturierte Seite des PDMS-Blocks. Anschließend dreimal mit Isopropanol und Methanol abspülen, gefolgt von Reinstwasser, und die Oberfläche föhnen.
Als nächstes reinigen Sie das PDMS mit Sauerstoff oder Luftplasma im Plasma und legen Sie das plasmagereinigte PDMS auf ein entsprechend gereinigtes Deckglas. Erhitzen Sie es auf einer heißen Platte bei 80 Grad Celsius für 15 Minuten. Stecken Sie entsprechend dimensionierte Polyethylenschläuche niedriger Dichte in die Löcher und verbinden Sie den Auslassschlauch mit einer 0,5-Milliliter-Spritze.
Dann lassen Sie die Lösungen in die Mikrokanäle einfließen, indem Sie das Einlassrohr in die Lösung eintauchen und das erforderliche Volumen mit der Spritze ziehen. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch und schalten Sie die Epi-Illumination-Lichtquelle für die IRM-Bildgebung ein. Um das Mikroskop zu fokussieren, suchen Sie nach der richtigen Fokusebene in der Nähe der PDMS-Lösungsschnittstelle und wählen Sie ein Sichtfeld in der Nähe der Mitte des Kanals.
Als nächstes werden 0,1-Mikromolare Lösung von fluoreszierenden Mikrokügelchen in BRB80 hergestellt und in mindestens einem Kanalvolumen der Mikroperlenlösung geflossen. Überwachen Sie die Reaktion über IRM oder TIRF. Wenn die gewünschte Dichte der Mikrokügelchen erreicht ist, waschen Sie den Überschuss mit BRB80 aus.
Gießen Sie verdünnte Samen in die Reaktionskammer und überwachen Sie die Reaktion durch IRM. Wenn die gewünschte Dichte der Samen erreicht ist, waschen Sie den Überschuss mit BRB80 aus. Als nächstes bereiten Sie eine Mikrotubuli-Verlängerungsmischung vor, die 12-mikromollares unmarkiertes Tubulin, ein-millimollares GTP, fünf-millimolares DTT im BRB80-Puffer enthält.
Fließen Sie dann in mindestens einem Kanalvolumen des Erweiterungsgemisches und stellen Sie sicher, dass die Reaktionstemperatur 28 Grad Celsius beträgt. Legen Sie zunächst die Bildgebungseinstellungen in der Mikroskopsoftware fest. Starten Sie die Bildgebung und lassen Sie die Kinesin-Lösung in die Kammer fließen.
Visualisieren Sie dann die GFP-markierten Kinesin-1-Schrumpfungsmikrotubuli. Nehmen Sie nach Abschluss der Messung ein kurzes Video auf, in dem die Stufe langsam in einer kreisförmigen oder seitlichen Bewegung gedreht wird. Die mittlere Projektion dieses Videos dient als Hintergrundbild und wird von den Rohmessungen abgezogen.
Erstellen Sie eine Medianprojektion in ImageJ aus der Hintergrundaufzeichnung, indem Sie auf Bild klicken. Wählen Sie dann die Option Stacks und klicken Sie auf Z-Projekt. Subtrahieren Sie als Nächstes die mittlere Hintergrundprojektion von den Rohbilddaten, indem Sie auf Verarbeiten klicken und dann die Option Bildrechner auswählen, während Sie sicherstellen, dass Sie die 32-Bit-Float-Ergebnisoption aktivieren.
Wählen Sie für die Bildregistrierung eine Sammlung von Mikrokügelchen in der Nähe des interessierenden Mikrotubuli aus und verwenden Sie sie, um die TIRF- und IRM-Bilder auszurichten. Verwenden Sie für jede Perle in dieser Sammlung das Mehrpunktauswahlwerkzeug, um die ungefähre Position im TIRF-Kanal und dann die entsprechende Position im IRM-Kanal zu markieren. Führen Sie dann das bereitgestellte ImageJ-Makro aus.
Mikrokügelchen erscheinen als dunkle Flecken im IRM-Kanal auf der rechten Seite und als helle Flecken im TIRF-Kanal auf der linken Seite. Das Ausrichtungsverfahren überlagert die beiden Kanäle korrekt, indem eine Auswahl von Perlen lokalisiert wird. Ein Kymograph von EGFP-markierten Kinesinmolekülen, die zu den schrumpfenden Enden von Mikrotubuli gehen, wurde ebenfalls mit diesem Protokoll erhalten.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Objektive mit hoher numerischer Apertur zu wählen, um eine interne Totalreflexion zu erreichen und auch die Erfassungseffizienz und den Bildkontrast zu maximieren. Diese Methode kann für die hochauflösende Bildgebung einzelner fluoreszierender Moleküle gleichzeitig innerhalb der makromolekularen Struktur verwendet werden, die massiv genug ist, um von IRM sichtbar gemacht zu werden, wie z. B. Zellmembran oder Aktinfilament. Dieses Protokoll bietet auch ein leicht anpassbares Verfahren für die gleichzeitige Bildgebung mit einer beliebigen Kombination aus IRM, TIRF und Epifluoreszenz.
