Das Protokoll bietet ein einfaches Verfahren, um FRET-Experimente durch sensibilisierte Emissionen reproduzierbarer und vergleichbarer zu machen. Der Hauptvorteil von FRET sind Messungen in Echtzeit, so dass dynamische Prozesse adressiert werden können. Für die Lasereinstellung mit einem Transmissionsphotomultiplier legen Sie den Acht-Well-Objektträger mit den transfizierten Protoplasten unter das Mikroskop.
Nachdem Sie eine leere Vertiefung ausgewählt haben, wählen Sie den Zeilenabtastmodus und die Histogrammansicht, verringern Sie die Laserintensität auf das Minimum und passen Sie die Detektorverstärkung an erkennbare Hintergrundgeräusche an. Als nächstes erhöhen Sie die Laserintensität in Schritten von 0,5%, während Sie das entsprechende Signal aufzeichnen. Wählen Sie für die Lasereinstellung im Reflexionsmodus eine leere Vertiefung aus und wenden Sie dann einen Reflexionsfilter an.
Schalten Sie den Reflexionsmodus ein und stellen Sie sicher, dass der Wellenlängenbereich des Detektors die Wellenlänge des Lasers abdeckt. Wählen Sie den Zeilenabtastmodus und die Histogrammansicht, verringern Sie die Laserintensität auf ein Minimum und passen Sie die Detektorverstärkung an erkennbare Hintergrundgeräusche an. Als nächstes bewegen Sie das Objektiv in die niedrigste Position, bevor Sie es wieder nach oben bewegen, bis die Reflexion des Deckglases sichtbar ist, und erhöhen Sie dann die Laserintensität in Schritten von 0,5%, während Sie das entsprechende Signal aufzeichnen.
Für die Datenauswertung tabellieren und sortieren Sie die Daten nach Signalintensitäten, zeichnen dann die Signalintensitäten gegen die relative Laserleistung auf und wählen sie die Laserintensitäten, die zu einer ähnlichen Signalintensität führen. Wählen Sie zur Einstellung der Photomultiplier eine leere Vertiefung aus und wenden Sie einen Reflexionsfilter an, schalten Sie in den Reflexionsmodus und stellen Sie sicher, dass der Wellenlängenbereich des Detektors die Wellenlänge des Lasers abdeckt. Wählen Sie den Zeilenabtastmodus und die Histogrammansicht, verringern Sie die Detektorverstärkung auf die Hälfte des Maximums und passen Sie die Laserintensität an erkennbare Hintergrundgeräusche an.
Als nächstes bewegen Sie das Objektiv in die niedrigste Position, bevor Sie es wieder nach oben bewegen, bis die Reflexion des Deckglases sichtbar ist, erhöhen Sie dann die Detektorverstärkung in 50 bis 100 Volt Schritten und zeichnen Sie das entsprechende Signal auf. Für die Datenauswertung zeichnen Sie die Intensität gegen die Detektorverstärkung für jeden Detektor auf und wählen Sie dann die einzelnen Detektorgewinne aus, um eine ähnliche Empfindlichkeit zu erhalten. Wählen Sie für die Bildaufnahme die geeigneten Filter oder dichroitischen Spiegel und verwenden Sie denselben dichroitischen Spiegel für alle Kanäle, um zeilenweises Scannen zu ermöglichen, wählen Sie dann ein Wasserimmersionsobjektiv für die Abbildung lebender Zellen und wählen Sie 12 oder 16 Bit Scannen mit moderater Scangeschwindigkeit.
Als nächstes definieren Sie den Nachweisbereich vorzugsweise 470 bis 510 Nanometer für den Donordetektion und 530 bis 600 Nanometer für den Akzeptordetektion im Falle des FRET-Paares aus verstärktem cyan fluoreszierendem Protein oder ECFP und erhöhtem gelb fluoreszierendem Protein oder EYFP. Nachdem Sie die Detektor- und Lasereinstellungen wie zuvor gezeigt angewendet haben, überarbeiten Sie bei Bedarf die Laserintensität basierend auf der erhaltenen Laserleistungstabelle. Stellen Sie sicher, dass das Signal-Rausch-Verhältnis den gesamten Dynamikbereich der Detektoren abdeckt.
Führen Sie nach der Feinabstimmung mit dem Lochdurchmesser unter Konstanterhaltung der Laserintensitäten und Detektorgewinne die FRET-Messungen durch, die Bilder von mindestens 20 Zellen aufnehmen. Um die Übersprechkorrekturen zu bestimmen, führen Sie FRET-Messungen mit Zellen durch, die nur den Donorfluorophor exprimieren, und solchen, die nur den Akzeptorfluorophor exprimieren. Führen Sie zur Kalibrierung der Messungen FRET-Messungen mit Zellen durch, die die Donorakzeptorfusion exprimieren.
Für die Datenauswertung erhalten Sie Linienprofile der Zellen, die sicherstellen, dass jedes Profil nicht mehr als eine Zelle enthält. Speichern Sie die Profile als Textdateien. Verwenden Sie dann die Option zum Importieren von Textdateien im Datenabschnitt und importieren Sie die Textdateien in eine Tabelle.
Lesen Sie als Nächstes die Maximalwerte aus, indem Sie die Max-Funktion anwenden, und listen Sie dann die erhaltenen Werte in einer Tabelle auf, die jeweils eine Spalte für Die Donoremissions-ID, die FRET-Emission IF, die Akzeptoremission IA und mindestens vier Datensätze, Nur Donor, Nur Akzeptierer, Donor-Akzeptor-Fusion und Messung enthält. Die Laseranpassung zeigte eine lineare Zunahme der Emission mit zunehmender Laserintensität. Wie eine steilere Steigung zeigt, war die Emission der 514-Nanometer-Linie viel höher als die Emission der 458-Nanometer-Linie.
Die Variation der Detektorgewinne bei konstanter Laserleistung ergab ein exponentielles Verhalten für beide analysierten Detektoren. Die Diskrepanz und das spektrale Durchbluten des Donors und des Akzeptors, die mit rekombinant gereinigten Proteinen analysiert und mit Zellen analysiert wurden, die diese Proteine exprimieren, zeigen, dass es unmöglich ist, die Bestimmung des spektralen Durchblutens in lebenden Zellen, die wahrscheinlich durch zelluläre Pigmente verursacht werden, wegzulassen. Die FRET-Effizienz zwischen den markierten vakuolären ATPA-Untereinheiten, VHA AECFP und VHA AEYFP, nahm mit zunehmender Signalintensität ab.
Im Gegensatz dazu war die Wechselwirkung zwischen VHA E1 ECFP und VHA CEYFP unabhängig von der Signalintensität. Die Wahl geeigneter optischer Komponenten ist entscheidend für die Detektion des Spenders und Akzeptors. Dieses Protokoll kann auch für ratiometrische Sensoren in lebenden Zellen angewendet werden, um die Reproduzierbarkeit in diesen Experimenten zu erhöhen.
