Unser Protokoll bietet einen bedeutenden Fortschritt bei der Synthese von proteinbeladenen Nanogelen unter 100 Nanometern in einem einzigen Schritt Vernetzungs- und Copolymerisationstechnik unter milden wässrigen Reaktionsbedingungen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Fähigkeit, proteinbeladene Nanogele unter milden Bedingungen zu synthetisieren, aggressive organische Lösungsmittel und hohe Temperaturen zu vermeiden und so die Integrität der biologischen Nutzlast zu erhalten. Beginnen Sie damit, die Gläser mit gefiltertem enionisiertem Wasser zu waschen.
Um die Gläser zu trocknen, befestigen Sie eine sichere Düse am Druckluftauslass an der Seite des Abzugs. Halten Sie das Fläschchen fest, positionieren Sie die Düse im Inneren und aktivieren Sie die Druckluft, um einen kontrollierten Strom abzugeben. Füllen Sie anschließend ein 10-Milliliter-Glasfläschchen mit entionisiertem Wasser und verschließen Sie es mit einem Gummiseptum.
Um das Wasser sauerstoffarm zu machen, füllen Sie einen Ballon mit Stickstoffgas und befestigen Sie eine Nadel am Ballon. Legen Sie es auf das Septum und stechen Sie in das Gummiseptum, um den Stickstofffluss zu ermöglichen. Befestigen Sie außerdem eine Austrittsnadel am Kolben, um einen gleichmäßigen Stickstofffluss aufrechtzuerhalten.
Als nächstes lösen Sie BSA oder Cy7-markiertes BSA in sauerstoffarmem, deionisiertem Wasser auf. Geben Sie diese Lösung dann in ein sauberes 10-Milliliter-Glasfläschchen. Geben Sie AETC-Lösung in den Kolben und verschließen Sie ihn mit einem weiteren Gummiseptum.
Lösen Sie Acrylamid und sauerstoffarmes, deionisiertes Wasser auf und fügen Sie diese Lösung der Mischung des Fläschchens hinzu. Lösen Sie dann den Disulfidvernetzer in entionisiertem Wasser auf und geben Sie ihn zu der Mischung im Fläschchen. Spülen Sie das Gemisch 20 Minuten lang mit Stickstoffgas.
Lösen Sie anschließend SDS in sauerstoffarmem, deionisiertem Wasser auf. Führen Sie es mit einer stickstoffgasgespülten Spritze in die Mischung ein. Als nächstes fügen Sie TEMED zum Reaktionsgemisch hinzu.
Lassen Sie das Gemisch drei Minuten lang unter einem kontinuierlichen Strom von Stickstoffgas sauerstoffarm werden. Ammoniumpersulfat wird in einem Milliliter sauerstoffarmem, deionisiertem Wasser gelöst und in das Reaktionsgemisch eingebracht. Dann verschließen Sie den Kolben unter einer Stickstoffatmosphäre und rühren Sie das Gemisch drei Stunden und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur um.
Um die Reaktion zu beenden, ist die Versiegelung vom Kolben zu entfernen. Die Reaktion endet, sobald die Mischung klar und farblos wird. Um Nanogele zu reinigen, geben Sie das Reaktionsgemisch in eine 15-Milliliter-Zentrifugalfiltereinheit.
Füllen Sie das Gerät mit entionisiertem Wasser und zentrifugieren Sie, um nicht reaktive Chemikalien oder nicht verkapselte Nutzlast zu entfernen. Geben Sie zwei Milliliter entionisiertes Wasser in die Zentrifugaleinheit, um die Nanogelprobe zu verdünnen. Lagern Sie die endgültige Probe bei zwei bis acht Grad Celsius, um einen Abbau des verkapselten Proteins zu verhindern.
Nehmen Sie eine Küvette oder eine gefaltete Einweg-Kapillarzelle zur Analyse. Reinigen Sie es mit deionisiertem Filterwasser und blasen Sie anschließend Druckluft, um große Staubpartikel zu entfernen. Füllen Sie dann die Küvette mit 50 bis 100 Mikrolitern der Probe und verdünnen Sie sie mit 750 bis 1.000 Mikrolitern gefiltertem deionisiertem Wasser.
Um die Küvette in das DLS-Instrument einzusetzen, öffnen Sie die Abdeckung des Probenfachs und halten Sie die Küvette an den oberen Rändern, um Fingerabdrücke auf den optischen Fenstern zu vermeiden. Platzieren Sie die Küvette richtig ausgerichtet mit dem Strahlengang des Instruments. Schließen Sie dann den Probenraum, um das Umgebungslicht zu blockieren.
Starten Sie die Partikelgrößenmessung mit der entsprechenden Software an der DLS-Maschine. Wählen Sie nach der Messung die für die Probe relevanten Ergebnisse aus, einschließlich des Z-Durchschnitts, des durchschnittlichen PI, der Zählrate pro Minute, des Zetapotenzials und der zugehörigen Grafiken. Vergewissern Sie sich, dass die Korrelationsfunktion eine glatte sigmoidale Kurve anzeigt, die auf eine einheitliche Stichprobe hinweist.
Sobald die Analyse abgeschlossen ist, nehmen Sie die Küvette vorsichtig aus dem DLS-Gerät. Es wurde eine allmähliche Abnahme der Intensität des mit dem BSA-Protein assoziierten Peaks beobachtet, was auf eine Verkapselung des Proteins innerhalb der Nanogelstruktur hindeutet. Die physikalisch-chemische Charakterisierung der Cy7-markierten BSA-beladenen Nanogele zeigte einen einzigen definierten Peak bei 50 bis 100 Nanometern.
Leere Nanogele zeigten jedoch inkonsistente und größere Größen. Bis zu 86 % der verkapselten Cy7-markierten BSA wurden innerhalb von 48 Stunden freigesetzt. Auf der anderen Seite führten Kontrollexperimente ohne Zusatz von Glutathion nur zu einer Proteinfreisetzung von 15 %.
Die Fourier-Transformations-Infrarotanalyse zeigte, dass BSA, das während der Nanogelsynthese und nach der Glutathion-Inkubation isoliert wurde, seine Struktur beibehielt, was durch den Peak bei 1.662 Zentimetern invers angezeigt wird, der intakte Beta-Windungen darstellt. BSA aus Nanogelen, die 30 Tage gelagert wurden, zeigte jedoch einen Peak bei 1.613 Zentimetern invers, was auf intermolekulare Beta-Faltblattstrukturen und Proteinaggregation hinweist. Der Zirkulardichroismus zeigte unveränderte Spektren wie bei nativem BSA, was auf eine erhaltene alpha-helikale Struktur hinweist.
Geringfügige Abweichungen in den charakteristischen Peaks für BSA, die nach 30 Tagen isoliert wurden, deuteten jedoch auf eine gewisse Aggregation hin. Die Aufrechterhaltung eines kontinuierlichen Stickstoffflusses ist entscheidend, um zu verhindern, dass Sauerstoff die Polymerisation freier Radikale hemmt. Darüber hinaus müssen die initiierenden Systemkomponenten für eine erfolgreiche Synthese schnell hinzugefügt werden.
Nach diesem Verfahren können die nanogelgroße Verteilung, die Morphologie und die Kinetik der Nutzlastfreisetzung durch DLS, TEM und Redox-Responsiveness durch Inkubation mit dem physiologischen Reduktionsmittel Glutathion weiter charakterisiert werden.
