Dieses Protokoll ist das erste, das beschreibt, wie die Mausgröße für RP-Pathologien mit Hilfe von Lichttransmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie verarbeitet und bewertet werden kann. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Einbeziehung quantitativer Beurteilungen der RP-Pathologien, wobei diese drei bildgebenden Verfahren für statistische Vergleiche verwendet werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken können auch dazu beitragen, unser Wissen über molekulare Signalwege zu erweitern, die für die Gesundheit von RPE wichtig sind.
Personen, die die Mausgröße noch nicht seziert haben, können mit diesem Protokoll Schwierigkeiten haben. Wir empfehlen diesen Personen, mit einigen Mäusen zu üben, um die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken zu beherrschen. Bereiten Sie zunächst ein Schwerkraft-Perfusionssystem auf einer saugfähigen Unterlage für die Herzperfusion in einem Abzug vor.
Gießen Sie 40 Milliliter frisch zubereiteten Fixierpuffer in den Spritzenzylinder des Perfusionssystems. Drehen Sie das Ventil parallel zur Schlauchleitung, damit der Puffer durch die Schlauchleitung fließen kann. Spülen Sie die Leitung, bis alle Luftblasen aus der Leitung entfernt sind.
Drehen Sie dann das Ventil senkrecht zur Schlauchleitung, um zu verhindern, dass der Puffer in die Schlauchleitung fließt. Um eine Herzdurchblutung durchzuführen, legen Sie die euthanasierte Maus in eine flache Schale in der Nähe des Perfusionssystems. Mit dem Bauch nach oben.
Besprühen Sie den Bauch mit 70%igem Ethanol und machen Sie dann mit einer gebogenen Schere und Pinzette einen fünf Zentimeter tieferen Schnitt durch die Haut und die Bauchdecke auf der linken Seite der Maus unterhalb des Brustkorbs. Fahren Sie mit einem drei Zentimeter langen medialen Schnitt durch die Haut und die Bauchdecke am oberen Ende des unteren Schnitts fort. Machen Sie einen weiteren fünf Zentimeter unteren Schnitt am Ende des medialen Schnitts durch die Haut und die Bauchdecke auf der äußersten rechten Seite der Maus unterhalb des Brustkorbs.
Machen Sie einen weiteren drei Zentimeter langen medialen Schnitt, um den Bauchhautlappen mit einer gebogenen Pinzette zu entfernen. Als nächstes schneidest du durch das Zwerchfell und das Brustbein, um das Herz freizulegen. Führen Sie die Messnadel in die linke Herzkammer ein und drehen Sie die Klappe.
Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer gebogenen Schere durch, damit Blut und Fixiermittel aus dem Herzen austreten können. Lassen Sie 10 Milliliter Fixierpuffer die Maus ein bis zwei Minuten lang durchbluten oder bis die Leber blass wird und kein Blut mehr aus dem rechten Vorhof fließt. Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, drehen Sie das Ventil senkrecht zur Schlauchleitung, um den Pufferfluss zu stoppen.
Um die Augen zu entkernen, nehmen Sie die Maus aus der flachen Schale und legen Sie sie auf die saugfähige Unterlage in einem Abzug. Richten Sie dann den Kopf der Maus so aus, dass das linke Auge dem Experimentator zugewandt ist und das rechte Auge außer Sichtweite ist. Markieren Sie die obere Seite des Auges mit einem Gewebemarkierungsfarbstoff.
Drücken Sie mit Daumen und Zeigefinger sanft um die Augenhöhle herum, um den Vorsprung des Auges aus der Augenhöhle zu erreichen. Halten Sie dann mit einer gebogenen Schere das Auge mit der Klinge in einem 30-Grad-Winkel von der Augenhöhle und schneiden Sie um das Auge herum. Entfernen Sie den Augapfel mit einer gebogenen Pinzette vom Kopf und legen Sie ihn auf eine saugfähige Unterlage.
Schneiden Sie die Hornhaut mit einer Skalpellklinge Nummer 11 ein und legen Sie das Auge mit einer gebogenen Pinzette in ein Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen, das zwei Milliliter Fixierpuffer enthält. Nachdem Sie beide Augen entkernt haben, inkubieren Sie sie über Nacht in einem Fixierpuffer auf einem Shaker in einem Vier-Grad-Raum mit einer Drehzahl von 75 U / min. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Fixierpuffer durch zwei Milliliter PBS und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang auf einem Schüttler bei Raumtemperatur und 75 U/min.
Als nächstes wird das Auge unter einem Präpariermikroskop in eine mit PBS gefüllte Petrischale gelegt, um hintere Segmente zu erzeugen. Heben Sie Fett und Muskeln vorsichtig mit einer Pinzette mit feiner Spitze vom Augapfel ab. Schneiden Sie das Fett und die Muskeln vorsichtig mit einer Mikropräparierschere in paralleler Richtung zum Augapfel ab, bis der Augapfel eine gleichmäßige bläulich-schwarze Farbe hat. Setzen Sie eine Pinzette mit feiner Spitze an der Hornhautpunktionsstelle an und schneiden Sie mit einer Mikropräparierschere um den Umfang der Hornhaut herum, beginnend an der Punktionsstelle, um die Hornhaut und die Iris aus dem Augapfel zu entfernen.
Entfernen Sie dann mit einer Pinzette mit feiner Spitze vorsichtig die Linse aus dem Augapfel, um den hinteren Augenabschnitt freizulegen. Legen Sie das hintere Segment in ein Röhrchen mit zwei Millilitern PBS und lagern Sie es bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius im Kühlschrank. Übertragen Sie das Auge in eine Petrischale, die PBS enthält, und entfernen Sie die Hornhaut und die Iris wie gezeigt.
Ziehen Sie die Linse mit einer Pinzette mit feiner Spitze heraus. Trennen Sie dann mit zwei Pinzetten mit feiner Spitze vorsichtig die Neuralnetzhaut vom hinteren Segment. Schneiden Sie vorsichtig die Neuralnetzhaut am Sehnervenkopf durch, um sie aus der hinteren Augenmuschel zu entfernen.
Legen Sie die Augenmuschel in ein Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen, das fünf Mikroliter PBS enthält. Um die hinteren Augenmuscheln zu fixieren, geben Sie 500 Mikroliter Methanol in das Gewebe und inkubieren Sie es fünf Minuten lang auf einem Shaker bei 75 U/min. Wiederholen Sie die Methanolfixierung dreimal mit abschließender Inkubation für zwei Stunden.
Waschen Sie das Gewebe nach der Fixierung dreimal mit PBS, bevor Sie mit der Immunfluoreszenzfärbung und der Visualisierung durch konfokale Mikroskopie fortfahren. Vier Monate alte TMEM 135 TG-Mäuse zeigten eine signifikante Verringerung der Dicke des pigmentierten Epithels oder RPE der Netzhaut in 600 und 900 Mikrometern Entfernung vom Sehnerv im Vergleich zu altersgleichen Wildtyp-Mäusen. Es wurden Fälle von RPE-Pathologien wie Mikrovaskuolisierung, Makrovakuolisierung und Migration von 325 Tage alten WT- und TMEM-135-TG-Mäusen berechnet.
Die durchschnittliche Häufigkeit der RPE-Mikrovakuolisierung war im Wildtyp niedriger als bei den TMEM 135 TG Mäusen. Im Wildtyp wurden keine RPE-Makrovakuolisierung und -Migration nachgewiesen, verglichen mit den Durchschnittswerten, die in TMEM 135 TG-Mäusen beobachtet wurden. In der Transmissionselektronenmikroskopie wurden basale laminare Ablagerungen in 24 Monate alten Netzhäuten beobachtet, die in zwei Monate alten Netzhäuten fehlten.
Die Analyse der kumulativen Häufigkeiten der basalen laminaren Ablagerungshöhen ergab eine Verschiebung nach rechts der Linie für die 24 Monate alten Mäuse im Vergleich zu den zwei Monate alten Mäusen, was eine Zunahme der Ablagerungen bei 24 Monate alten Mäusen zeigt. Diese Beobachtung wurde durch größere durchschnittliche Körpergrößen in 24 Monate alten Netzhäuten gestützt. RPE in vier Monate alten TMEM 135 TG Mäusen war dysmorph.
Das RPE in TMEM 135 TG-Netzhäuten ist größer und weniger dicht als bei altersangepassten Wildtyp-Netzhäuten. Außerdem wurden im Vergleich zu Kontrollen mehr mehrkernige RPE-Zellen in der TG-Netzhaut beobachtet. Diesem Protokoll folgend, konnten die Forscher spezifische Signalwege mit molekularbiologischen Techniken in Mäusen untersuchen, was zu unserem Verständnis beitragen könnte, wie sich diese RP-Pathologien in Mäusen entwickeln.
Dieses Protokoll wird dazu beitragen, die RP-Phänotypisierung bei Mäusen zu standardisieren, was die Erkenntnisse aus Mausstudien auf andere AMD-Modelle übertragen und unser Verständnis der AMD-Pathobiologie verbessern wird.
