Dieses Protokoll ermöglicht es uns, die epigenetischen Merkmale neurodegenerativer Erkrankungen leicht zu erforschen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es Hefe als Modellsystem ausnutzt, im Vergleich zu anderen zellulären und tierischen Modellen neurodegenerativer Erkrankungen, Hefe ist zweckmäßig und kosteneffizient. Diese Technik ermöglicht es uns, die epigenetischen Veränderungen zu kartieren, die bei neurodegenerativen Erkrankungen auftreten, was zu neuen Markern für die Diagnose führen kann, sowie neue Therapieziele.
Diese Methode ermöglicht eine weitere Untersuchung der Rolle epigenetischer Markierungen bei neurodegenerativen Erkrankungen und kann für die Beurteilung menschlicher Fibroblasten und induzierter pluripotenter Stammzellen modifiziert werden. Diese spezielle Methode enthält eine Reihe von Details, die visuell demonstriert werden müssen, wie z. B. die ordnungsgemäße Beladung des westlichen Blot-Geräts. Demonstriert wird das Verfahren von Michel Fallah und Navin Rana, beide Forscher im Torrente-Labor.
Beginnen Sie mit der Umsalzung der Hefe aus gefrorenen Glycerinvorräten auf Histidin 2%Glucose-Agar-selektive mittelplatte, für eine zwei- bis dreitägige Inkubation bei 30 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, inoculate restreaked Hefe für jede Über-Ausdrucksmodell und Kontrolle in fünf Milliliter von Histidin selektive flüssige Medium. Ergänzt mit 2%raffinose bei 30 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute, über Nacht.
Am nächsten Morgen wachsen 100 Milliliter flüssige Kultur für jedes der Überexpressionsmodelle und Kontrollen in selektiven Medien, die über Nacht mit 2% Galaktose ergänzt werden. Und messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD600, um das Volumen der Nachtkultur zu bestimmen, das benötigt wird, um über Ausdruckskulturen bei einem beginnenden OD600 von 0,3 zu rendern. Um eine Proteinüberexpression zu induzieren, wachsen Sie die Hefe auf Galaktosemedium mit Schütteln bei 30 Grad Celsius für den entsprechenden experimentellen Zeitraum.
Messen Sie dann die OD600 jeder Kultur am Ende der Induktionsperiode. Und standardisieren Sie alle Zellenanzahlen auf den niedrigsten OD600-Wert. Die Kulturen in 50 Milliliter Zentrifugenrohren durch Zentrifugieren ernten und die Pellets in einem Milliliter sterilem Stillwasser für jeden 10 Milliliter Kulturanbau wieder aufhängen.
Aliquot einen Milliliter Zellresuspension in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen für eine zusätzliche Zentrifugation und Aspirat der Übersprecher. Dann schnappen Sie die Zellpellets in flüssigem Stickstoff für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um die Zellen für die Western-Blot-Analyse zu lysieren, tauen Sie die Hefezellpellets auf Eis auf, bevor Sie in 100 Mikroliter destilliertem Wasser wieder aufsuspensionen.
Fügen Sie 300 Mikroliter 0,2-molares Natriumhydroxid und 20 Mikroliter 2-Mercaptoethanol zu jeder Zellprobe hinzu. Und die Pellets durch Pipettieren wieder aussetzen. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis die Zellen durch Zentrifugieren pellet und die Proben in 100 Mikroliter Naderfarbstoff wieder aufsetzen.
Dann kochen Sie die Proben für 10 Minuten auf einem Heizblock. Während die Proben lysiert werden, legen Sie zwei Gele in einen Gelhalter und füllen Sie die Innenkammer nach oben mit Laufpuffer und die Außenkammer bis zur Zwei-Gel-Linienmarkierung. Wenn die Proben fertig sind, laden Sie jeweils 15 Mikroliter, Zelllyselösung, in jeden Brunnen des 10 Brunnens, 12% Polyacrylamid-Gel und fügen Sie fünf Mikroliter Proteinleiter in die Proteinleiter Lane gut.
Führen Sie das Gel ca. 45 Minuten bei 150 Volt oder bis die Ladefarbe vorne den Boden des Gels erreicht. Während das Gel läuft, tränken Sie zwei Faserpads pro Gel im Transferpuffer und eine Polyvinylidenfluorid, oder PVDF, Membran pro Gel in Methanol. Wenn das Gel fertig ist, spülen Sie die Membran im Transferpuffer aus und legen Sie ein vorgetränktes Faserpad auf den Boden einer halbtrockenen Transfergerätezelle.
Gefolgt von der PVDF-Membran, dem Gel und dem zweiten vorgetränkten Faserpad. Stellen Sie dann die Leistung für eine Stunde auf 150 Milliampere ein. Am Ende des Proteintransfers die Membran aus dem Transfergerät für eine kurze Spülung mit destilliertem Wasser entfernen.
Legen Sie die abspülte Membran, Die Proteinseite in eine kleine Färbebox und bedecken Sie die Membran mit tris-gepufferter Kochsalzlösung oder TBS, wobei der Puffer für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur mit sanftem Schaukeln blockiert wird. Am Ende der blockierenden Inkubation die Membran über Nacht mit einem Anti-Hefe-Histon und modifikationsspezifischem Antikörper in TBS bei vier Grad Celsius inkubieren. Und ein richtiger Kernladekontroll-Antikörper.
Am nächsten Morgen die Membran viermal in TBS waschen, ergänzt mit 0,1%Polysorbat 20 für fünf Minuten mit Schaukeln bei Raumtemperatur pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche den Blot mit den entsprechenden Sekundärantikörpern für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Es folgten vier, fünfminütige Wätsche in TBST und eine fünfminütige Wäsche allein in TBS mit Schaukeln.
Dann stellen Sie den Fleck auf einem fluoreszierenden Western Blot Imaginierungssystem für zwei Minuten. Hierzeigt sich die Wachstumsunterdrückung in festen und flüssigen Kulturen mit signifikanten Auswirkungen auf das Hefewachstum, die in Gegenwart von Galaktose-infundiert in Sarkom-Überexpressionsmodellen beobachtet werden. Eine signifikante Abnahme der Histonspiegel sind in der im Sarkom-Überexpression-Modell verschmolzenen Und signifikante Erhöhungen der Histonacetylierung im TAR-Bindungsprotein 43-Überexpression-Modell sind beobachtet, die weder im In-Sarkom- als auch beim Alpha-Synuclein-Überexpressionsmodell zu sehen sind.
Es gibt auch signifikante Abnahmen der Histonspiegel im Alpha-Synuclein-Überexpression-Modell. In diesem Saccharose-Tuning-Experiment, je geringer die Menge an Galaktose verwendet, um in Sarkat-Überexpression verschmolzen zu induzieren, die geringere Toxizität, die sowohl in fester als auch in flüssiger Kultur beobachtet wird. Wichtig ist, je niedriger der Grad der Verschmelzung in Sarkom-Überexpression, desto kleiner ist die Größe der Verringerung der Histonspiegel.
Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es unerlässlich, die Hefemenge in jeder Probe zu standardisieren, um einen korrekten Vergleich in den Ebenen der posttranslationalen Änderung zu ermöglichen. 2-Mercaptoethanol sollte unter einer Haube verwendet werden, um einEinatmen zu vermeiden. Wenn Ponceau Fleck verwendet wird, muss es richtig entsorgt werden.
