Raz Zarivach wird von der Israel Science Foundation unterstützt (Grant Nr. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef und Arie Moran werden von der Israel Science Foundation unterstützt (Grant Nr. 2047/20). Wir danken Daniel Gitler und seiner Gruppe an der Ben-Gurion-Universität für die Zusammenarbeit, Unterstützung und Expertise.

1. Zelltransfektion
<ol><li>Kultur HEK293T Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin/Streptomycin (siehe Materialtabelle) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C/5 % CO2 bis zum Zusammenfluss auf einer 10 cm großen Platte (8,8 x 106 Gesamtzellen).</li>
	<li>Legen Sie ein 13-mm-Deckglas in jede der Vertiefungen einer 12-Well-Platte. Verdünnen Sie 0,44 x 106 trypsinisierte Zellen aus Schritt 1.1 in 12 ml vollständigem DMEM. Mischen Sie gut, indem Sie drei- bis fünfmal auf und ab pipettieren. Füllen Sie jede Vertiefung mit 1 ml der gemischten Lösung. In einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C/5 % CO2 über Nacht anbauen.</li>
	<li>Ersetzen Sie das vollständige DMEM in jeder Vertiefung durch 1 ml serumfreies DMEM (siehe Materialtabelle) in jeder Vertiefung. Legen Sie die 12-Well-Platte wie in Schritt 1.1 wieder in den befeuchteten Inkubator.</li>
	<li>Verdünnen Sie für jede Transfektionsvertiefung 1 μg pAAV2-Plasmid, das das interessierende Protein enthält, das mit dem fluoreszierenden mCherry-Protein markiert ist (Zusatzdatei 1), in 100 μl serumfreiem DMEM in einem 1,5-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 3 μg Polyethylenimin (PEI, siehe Materialtabelle) zu 100 μl serumfreiem DMEM pro Transfektion hinzu, wobei jede Transfektion in ein anderes 1,5-ml-Röhrchen gegeben wird. Das Plasmid:PEI-Verhältnis sollte 1:3 (μg:μg) betragen.</li>
	<li>Beide Röhrchen aus Schritt 1.4 und Schritt 1.5 10 s lang vortexen und mindestens 5 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen.</li>
	<li>Mischen Sie einen Teil (100 μl pro Well) der DNA-Lösung aus Schritt 1.4 mit einem Teil (100 μl pro Well) der PEI-Lösung aus Schritt 1.5. Die endgültige Lösung wird 10 s lang vorgewirbelt und bei Raumtemperatur mindestens 20 Minuten und bis zu 6 Stunden ruhen gelassen.</li>
	<li>Nehmen Sie die 12-Well-Platte aus dem Inkubator. Die endgültige Lösung aus Schritt 1.7 vortexen und 200 μl in jede der Vertiefungen in der 12-Well-Platte aus Schritt 1.3 geben. Legen Sie die 12-Well-Platte wieder in den befeuchteten Inkubator (Schritt 1.1).</li>
	<li>Ersetzen Sie nach 3 Stunden das Medium in jeder Vertiefung durch 1 ml vollständiges DMEM. Legen Sie die 12-Well-Platte wie in Schritt 1.1 wieder in den befeuchteten Inkubator.</li>
	<li>Nach 2 Tagen wird die transfizierte Zellkultur aus dem 37 °C/5 % CO2 -Inkubator entnommen und mit 10-facher Vergrößerung auf ein inverses Fluoreszenzmikroskop gelegt.</li>
	<li>Fokussieren Sie mit dem Fokusrad des Mikroskops auf die Zellen, während Sie Hellfeldlicht verwenden.</li>
	<li>Wechseln Sie zu den fluoreszierenden mCherry-Anregungs- (587 nm) und Emissionswellenlängen (610 nm) und schalten Sie das Hellfeldlicht aus. Überprüfen Sie die Fluoreszenz der Zellen, um die Expression von ZnT1 mCherry zu bestätigen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Farbstoffbeladungslösung vor.<ol><li>Ein Aliquot von 4 μl Zink-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff (siehe Materialtabelle) in seiner Acetoxymethyl (AM)-Ester-Form, gelöst in DMSO (1 μg/μl), wird aus einem lichtgeschützten Material entnommen, das in einem Gefrierschrank von −20 °C gelagert wird. Diese Form ermöglicht es dem Farbstoff, durch einfache Diffusion durch die Plasmamembran in die Zelle einzudringen.</li>
		<li>4 μl 10%ige Pluronsäure (oder 2 μl 20%ige Pluronsäure, siehe Materialtabelle) werden zu dem Aliquot aus Schritt 1.13.1 gegeben. Mischen Sie die Lösung gut, indem Sie dreimal auf und ab pipettieren, und geben Sie dann alle 8 μl in ein 1,5-ml-Röhrchen.</li>
		<li>750 μl Ringer-Lösung (intern hergestellt, siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung), ergänzt mit 1 mg/ml (~0,1 %) Rinderserumalbumin, in das Röhrchen aus Schritt 1.13.2 geben und kräftig vortexen. Fügen Sie weitere 750 μl derselben Lösung hinzu und wirbeln Sie erneut vor, um eine maximale Durchmischung zu gewährleisten.</li>
	</ol></li>
	<li>750 μl der endgültigen Lösung aus Schritt 1.13.3 in zwei Vertiefungen in einer neuen 6-Well-Kulturplatte zugeben. Mit Alufolie abdecken. HINWEIS: Um ein Bleichen zu vermeiden, wird die 6-Well-Platte ab diesem Schritt immer mit Aluminiumfolie abgedeckt.</li>
	<li>Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette bis zu vier replizierte Deckgläser von der transfizierten Zellkulturplatte und legen Sie sie in die erste gefüllte Vertiefung (bis zu vier Objektträger pro Vertiefung) der neuen 6-Vertiefungsplatte aus Schritt 1.14. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite gefüllte Mulde. HINWEIS: Alle Deckgläser in derselben gefüllten Vertiefung müssen aus demselben Zustand stammen. Jede Bohrung kann jedoch unterschiedliche Bedingungen enthalten.</li>
	<li>Mit Alufolie abdecken und 15-20 Minuten vorsichtig schütteln.</li>
	<li>Entfernen Sie die Farbstoffbeladungslösung und ersetzen Sie sie durch eine neue Waschlösung aus Ringer-Plus-Albumin, wie in Schritt 1.13.3 verwendet. Mit Alufolie abdecken. Nochmals 20 Min. schütteln lassen. Dies ermöglicht die Spaltung des AM-Esters durch die intrazellulären Esterasen.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Mikroskops
<ol><li>Ordnen Sie die erforderlichen Werkzeuge (siehe Materialtabelle) wie erwähnt an: ein inverses Fluoreszenzmikroskop, das GFP- und mCherry-Fluorophore nachweisen kann, ein Perfusionssystem, das den Wechsel zwischen mindestens zwei Lösungen ermöglicht, ein Absaugsystem und eine Perfusionskammer.</li>
	<li>Schalten Sie das Mikroskop, die Lichtquelle und die Kamera ein. Schalten Sie das Absaugsystem ein.</li>
	<li>Waschen Sie das Perfusionssystem. Waschen Sie die erste Kammer mit Ringer-Lösung und die zweite Kammer mit Ringer-Lösung, die 7 μM Zinklösung enthält, ergänzt mit 7 μM Pyrithion (Zinkionophor, siehe Materialtabelle). Um Luftblasen oder Lücken zu vermeiden, lassen Sie etwas Flüssigkeit in jeder Kammer. HINWEIS: Da beide Behälter mit demselben Schlauch verbunden sind, der mit der Perfusionskammer verbunden ist, stellen Sie immer sicher, dass das gemeinsame Segment mit der Ringer-Lösung gewaschen wird.</li>
	<li>Schließen Sie die Wasserhähne und füllen Sie die entsprechenden Kammern mit Ringer-Lösung und Ringer-Zink-Lösung, wie in Schritt 2.3 beschrieben.</li>
</ol>3. Probenvorbereitung
<ol><li>Nehmen Sie die Perfusionskammer und platzieren Sie sie mit der schmalen Seite der Rille nach oben. HINWEIS: Die Rille ist ein Loch in der Mitte der Perfusionskammer. Es ermöglicht der Perfusionsflüssigkeit den Zugang zu den Zellen. Eine Seite der Nut ist schmal und die gegenüberliegende Seite breit.</li>
	<li>Tragen Sie ein Dichtungssilikon (siehe Materialtabelle) um die Nut herum auf. Reinigen Sie das Dichtungssilikon mit einer Pipettenspitze von der Nut. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass um die Nut herum genügend Silikondichtung vorhanden ist, um ein 22-mm-Deckglas abzudichten.</li>
	<li>Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette ein Deckglas aus der Waschlösung und legen Sie es mit den Zellen nach unten auf die Rille. Auf diese Weise werden die Zellen während des Experiments der Lösung ausgesetzt, die die Rille durchströmt.</li>
	<li>Legen Sie ein 22-mm-Deckglas auf das 13-mm-Deckglas und ziehen Sie es mit der Pinzette fest. Achten Sie darauf, dass die Deckgläser nicht reißen.</li>
	<li>Drehen Sie die Kammer um und drücken Sie darauf, um alle vorhandenen Flüssigkeiten freizusetzen. Füllen Sie die Nut mit 100 μl der Waschlösung von Ringer und drücken Sie erneut, um sicherzustellen, dass keine Leckagen entstehen. HINWEIS: Wenn eine Leckage festgestellt wird, tragen Sie ein Dichtmittel an der Stelle der Leckage auf und führen Sie einen erneuten Test durch.</li>
	<li>Montieren Sie die Perfusionskammer auf der Plattform und sichern Sie sie. Platzieren Sie die Perfusions- und Saugschläuche, um eine Perfusion über die Zellen in der Rille zu ermöglichen.</li>
	<li>Ändern Sie die Perfusionsrate auf ca. 2 ml/min und schalten Sie die Perfusion der Ringerlösung ein. Stellen Sie sicher, dass das Perfusionssystem ohne Leckagen oder Überschwappen funktioniert.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Messung
<ol><li>Öffnen Sie die Imaging-Software (siehe Materialtabelle) mit einem Doppelklick auf das Symbol. Melden Sie sich mit den entsprechenden Anmeldeinformationen an. Wählen Sie die angeschlossene Kamera aus und drücken Sie OK.</li>
	<li>Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops mit der Taste auf der linken Seite des Mikroskops auf 10x ein.</li>
	<li>Wählen Sie die Live-Ansicht und verwenden Sie den Joystick, um die Plattform zu bewegen, um sich auf die Zellen in der Rille zu konzentrieren.</li>
	<li>Schalten Sie während der Perfusion das Licht aus und ändern Sie die Wellenlänge auf mCherry, indem Sie die entsprechende Taste in der Benutzeroberfläche drücken. Stellen Sie den Fokus mit dem Fokussierrad des Mikroskops ein.</li>
	<li>Sobald das Mikroskop auf die Zellen fokussiert ist, bewegen Sie die Plattform mit dem Joystick, um die Auswahl der entsprechenden Zellfelder zu ermöglichen. HINWEIS: Ein geeigneter Bereich gilt als Bereich mit mindestens 10 Zellen für eine ROI und einem leeren Bereich für den Hintergrund.</li>
	<li>Wählen Sie das Dropdown-Menü "ROIs ein-/ausschalten" aus, und wählen Sie " Zirkuläre ROIs zeichnen".</li>
	<li>Zeichnen Sie ROIs von Zellclustern mit den mCherry-exprimierenden Zellen (zeigt die Expression von ZnT1 an).</li>
	<li>Klicken Sie in der gleichen Symbolleiste wie in Schritt 4.6 auf die Schaltfläche Hintergrund-ROIs ein-/ausschalten und passen Sie die Position und Größe der Hintergrund-ROI auf einen Bereich ohne Zellen an.<ol><li>Überprüfen Sie die mCherry- und EGFP-Wellenlängen, um sicherzustellen, dass sich keine Zellen im ausgewählten Hintergrund-ROI befinden. ANMERKUNG: Die Wellenlängen wurden so eingestellt, dass mCherry eine Anregungswellenlänge von 520 nm und eine Emissionswellenlänge von 610 nm und EGFP eine Anregungswellenlänge von 470 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm verwendete.</li>
	</ol></li>
	<li>Wählen Sie die Unterregisterkarte Wellenlänge (λ) aus. Markieren Sie das entsprechende Kontrollkästchen und stellen Sie sicher, dass die GFP-Wellenlänge vorhanden und das Kontrollkästchen aktiviert ist. Wenn nicht, fügen Sie es hinzu und markieren Sie es.</li>
	<li>Wählen Sie die Unterregisterkarte Dauer aus. Definieren Sie das Messintervall als alle 5 s, und ändern Sie die Anzahl der Intervalle entsprechend der Versuchsdauer.</li>
	<li>Klicken Sie im Abschnitt Fokus auf dem Mikroskoppanel unter dem Okular auf die Schaltfläche Ein , um das perfekte Fokussystem (PFS) zu aktivieren.</li>
	<li>Stellen Sie mit dem PFS-Fokusrad den Fokus ein. Stellen Sie in der Softwareschnittstelle unter ND-Erfassung sicher, dass PFS ein aktiviert ist.</li>
	<li>Klicken Sie auf Jetzt ausführen.</li>
</ol>5. Experimenteller Ablauf
<ol><li>Beginnen Sie mit einer 90-Sekunden-Baseline-Periodenmessung mit der Ringer-Lösungsperfusion.</li>
	<li>Schalten Sie nach Ablauf des Ausgangszeitraums die Perfusion der Ringer-Lösung aus und dann die Zinklösungsperfusion des Ringers ein. Markieren Sie den Wechsel der Lösung, indem Sie auf die rote Flagge unten rechts in der Hauptoberfläche klicken. Es wird erwartet, dass ein Anstieg der Fluoreszenz auftritt.</li>
	<li>Sobald der Fluoreszenzanstieg zu sättigen beginnt, wechseln Sie wieder zur Perfusion mit Ringer-Lösung. Schalten Sie die Perfusion der Ringer-Zinklösung aus und dann die Perfusion der Ringer-Lösung.</li>
	<li>Warten Sie, bis die Testzeit abgelaufen ist. Eine spürbare, aber stetige Abnahme der Fluoreszenz ist zu erwarten, wenn das ZnT1 richtig funktioniert.</li>
</ol>6. Datenexport
<ol><li>Um die Daten mit Basisliniensubtraktion zu exportieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Basislinie subtrahieren und sehen Sie sich die Änderungen im "ND-Erfassungsfenster" an.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren in der Softwareoberfläche im "ND-Erfassungsfenster". Es öffnet sich ein Excel-Datenblatt. Speichern Sie am gewünschten Speicherort.</li>
</ol>7. Datenanalyse
<ol><li>Erstellen Sie für jeden ROI eine durchschnittliche Baseline-Fluoreszenz aus den ersten 90 bis 100 Sekunden.</li>
	<li>Geben Sie die für jede ROI berechnete Fluoreszenz als Prozentsatz des Hintergrunds für diese ROI an.</li>
	<li>Erstellen Sie einen Zeilendurchschnitt aller ROIs, und stellen Sie das Ergebnis als Liniendiagramm dar. Dadurch entsteht ein Durchschnitt aller ROIs in Abhängigkeit von der Zeit.</li>
	<li>Wählen Sie mit der linearen Anpassungsfunktion die Anfangsrate für die Abnahme der Fluoreszenz nach dem Waschen mit der Ringer-Lösung. Der Steigungswert der Gleichung korreliert mit der Transportgeschwindigkeit.</li>
</ol>

Untersuchung des Zinktransportmechanismus in Säugetierzellen mit dem FluoZin-3-Assay

<ol>
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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Die oben beschriebene Methode ermöglicht die direkte Messung der intrazellulären Zinkkonzentration mit hoher zeitlicher Auflösung. Im Vergleich zu anderen Methoden kann diese Methode, bei der Veränderungen des intrazellulärenZn2+ überwacht werden, das Hintergrundrauschen erheblich verringern. Darüber hinaus eliminiert die Selektivität des Farbstoffs für Zink mögliche Kreuzwechselwirkungen mit anderen Metallkationen18,19. Schließlich ermögli...

Zink ist ein essentielles Spurenelement im zellulären Milieu. Es enthält ein Drittel aller Proteine und ist an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt, wie z. B. Katalyse1, Transkription2 und Strukturmotive3. Obwohl sie redoxinert sind, sind hohe Zinkkonzentrationen für die Zelle toxisch, weshalb kein Säugetierorganismus ohne das Vorhandensein von Mechanismen zur Regulierung der Zinkhomöostase überlebt hat. Bei Säugetieren sind drei Mechanismen für diesen Prozess verantwortlich: (1) Metallothionine, das sind zytosolische Cystein-reiche Proteine, die Zink mit hoher Affinität binden und so einen Überschuss an freiem zytosolischem Zink verhindern4; (2) Zrt/Irt-ähnliche Proteine (ZIPs), bei denen es sich um Zinktransporter handelt, die für den Zinkeinstrom in das Zytosol durch die Plasmamembran oder aus intrazellulären Organellen verantwortlich sind 4,5,6,7,8; und (3) ZnTs, die eine Säugetier-Untergruppe der ubiquitären Familie der Kationen-Diffusions-Facilitatoren (CDF) sind und Zinktransporter sind, da sie Zink aus dem Zytosol über die Plasmamembran oder in die intrazellulären Organellen extrudieren 4,5,6,7,8,9. Aufgrund der Bedeutung von Zink für den Zellstoffwechsel ist es wichtig, die zelluläre Zinkdynamik zu verstehen.
Bisherige Methoden zur Beurteilung der Zinkdynamik beruhten auf der Bewertung der Expressionsniveaus von mRNA unter verschiedenen Zinkbedingungen, indem sie mit zellulären Zinkmessungen von fixierten Geweben oder Zellen korreliertwurden 10,11,12. Zu diesen Methoden gehören der chemische Nachweis und die immunhistochemische Färbung. Diese Methoden liefern jedoch nur indirekte Messungen und bestimmen somit nur eine Offline-Korrelation zwischen der intrazellulären Zinkkonzentration und der Expression von Zinktransportern. Folglich können diese Methoden keine Parameter ableiten, die eine hohe zeitliche Auflösung erfordern.
Für eine direktere Messung desZn2+ -Transports werden radioaktive Isotope von Zink13 verwendet. Diese Methode beruht auf der Messung von radioaktiv markiertem Zn2+ , um den Zinktransport und seine Kinetik zu überwachen. Aufgrund der Bedeutung von Zink für die zelluläre Homöostase regulieren jedoch mehrere zelluläre Prozesse die intrazelluläre Zinkkonzentration. Dazu gehören die extrazelluläre Bindung und mehrere Transportsysteme, die zusammenarbeiten, um eine strenge Kontrolle über den intrazellulärenZn2+ -Spiegel aufrechtzuerhalten. Durch die Kombination dieser Prozesse entsteht ein erhebliches Hintergrundrauschen, das es schwierig macht, einzelne zinkbezogene Transportfunktionen zu testen.
Dieser Artikel demonstriert eine Methode zur direkten Überwachung der Zinktransportrate durch Messung der intrazellulären Konzentration von freiem Zink mit einem zinkspezifischen Fluoreszenzfarbstoff, FluoZin-3. Der Farbstoff hat eine hohe Spezifität fürZn2+ und geringe Interferenzen durch andere zweiwertige Kationen, wie z. B. Kalzium. Darüber hinaus gelangt es in seiner Esterform durch nichtionische Diffusion in die Zellen und wird dann aufgrund der Aktivität der intrazellulären Diesterase gefangen. Daher korreliert seine Fluoreszenz in erster Linie mit der Konzentration des freien zytosolischen Zinks. Diese Experimente wurden durchgeführt, um die Struktur-Funktions-Beziehung von Zinktransporter 1 (ZnT1), einem Mitglied der ZnT-Familie, zu untersuchen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm coverslips</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>111530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm cover slides</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>101050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>bioWorld</td>
			<td>22070008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride anhydrous, granular</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Glentham Life Science</td>
			<td>GC6947</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#8217;s Modified Eagle Media (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-DH</td>
			<td>Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-55-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluozin-3AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F24195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SV30010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05833</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 0.8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>HEPES10</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo 5.5 sCMOS camera</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DC-152Q-FI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>163823</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 5.4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrithione</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3261</td>
			<td>Concentration in Ringer zinc solution: 7 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease Kit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>W4 64-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>190305</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 120 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration in Ringer zinc solution: 7 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31665</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mammalian zinc transporters using an in vitro zinc transport assay

Übergangsmetalle wieZn2+-Ionen müssen aufgrund ihrer zellulären Toxizität streng reguliert werden. Bisher wurde die Aktivität von Zn2+-Transportern indirekt gemessen, indem das Expressionsniveau des Transporters unter verschiedenen Konzentrationen vonZn2+ bestimmt wurde. Dies geschah mit Hilfe der Immunhistochemie, der Messung von mRNA im Gewebe oder der Bestimmung des zellulärenZn2+-Spiegels. Mit der Entwicklung intrazellulärerZn2+-Sensoren werden die Aktivitäten von Zinktransportern derzeit hauptsächlich durch die Korrelation von Veränderungen des intrazellulären Zn 2+, die mit fluoreszierenden Sonden nachgewiesen werden, mit der Expression der Zn2+-Transporter bestimmt. Doch auch heute noch beobachten nur wenige Labore die dynamischen Veränderungen des intrazellulärenZn2+ und messen damit direkt die Aktivität von Zinktransportern. Ein Teil des Problems besteht darin, dass von den 10 Zinktransportern der ZnT-Familie, mit Ausnahme von ZnT10 (transportiert Mangan), nur Zinktransporter 1 (ZnT1) an der Plasmamembran lokalisiert ist. Daher ist es schwierig, die Transportaktivität mit Änderungen der intrazellulärenZn2+-Konzentration in Verbindung zu bringen. Dieser Artikel beschreibt einen direkten Weg zur Bestimmung der Zinktransportkinetik mit einem Assay, der auf einem zinkspezifischen Fluoreszenzfarbstoff, FluoZin-3, basiert. Dieser Farbstoff wird in seiner Esterform in Säugetierzellen geladen und dann aufgrund der zellulären Diesteraseaktivität im Zytosol gefangen. Die Zellen werden mit Zn2+ beladen, indem dasZn2+-Ionophor Pyrithion verwendet wird. Die ZnT1-Aktivität wird aus dem linearen Teil der Fluoreszenzreduktion nach der Zellauswaschung beurteilt. Die gemessene Fluoreszenz bei einer Anregung von 470 nm und einer Emission von 520 nm ist proportional zum freien intrazellulären Zn2+. Die Auswahl der Zellen, die ZnT1 exprimieren, die mit dem mCherry-Fluorophor markiert sind, ermöglicht es, nur die Zellen zu überwachen, die den Transporter exprimieren. Dieser Assay wird verwendet, um den Beitrag verschiedener Domänen des ZnT1-Proteins zum Transportmechanismus von humanem ZnT1 zu untersuchen, einem eukaryotischen Transmembranprotein, das überschüssiges Zink aus der Zelle extrudiert.

Zinc is an essential trace element in the cellular milieu. It incorporates one-third of all proteins and is involved in various cellular processes, such as catalysis1, transcription2, and structural motifs3. However, despite being redox-inert, high zinc concentrations are toxic to the cell, which is why no mammalian organism has survived without the presence of mechanisms regulating zinc homeostasis. In mammals, three mechanisms are responsible for this process: (1) metallothioneins, which are cytosolic cysteine-rich proteins that bind zinc at a high affinity, thus preventing excess free cytosolic zinc4; (2) Zrt/Irt-like proteins (ZIPs), which are zinc transporters responsible for zinc influx into the cytosol through the plasma membrane or from intracellular organelles4,5,6,7,8; and (3) ZnTs, which are a mammalian subset of the ubiquitous cation diffusion facilitator (CDF) family and are zinc transporters, as they extrude zinc from the cytosol across the plasma membrane or into the intracellular organelles4,5,6,7,8,9. Due to the importance of zinc to cellular metabolism, it is vital to understand cellular zinc dynamics.
Previous methods to assess zinc dynamics depended on assessing the expression levels of mRNA under different zinc conditions by correlating them with cellular zinc measurements of fixed tissues or cells10,11,12. These methods include chemical detection and immunohistochemistry staining. However, these methods yield only indirect measures and, thus, determine only an offline correlation between intracellular zinc concentration and the expression of zinc transporters. Consequently, these methods cannot infer any parameters requiring high temporal resolution.
A more direct measurement of Zn2+ transport uses radioactive isotopes of zinc13. This method relies on the measurement of radiolabeled Zn2+ to monitor zinc transport and its kinetics. However, due to the importance of zinc to cellular homeostasis, multiple cellular processes regulate intracellular zinc concentration. Among these are extracellular binding and several transport systems that work in concert to maintain tight control of intracellular Zn2+ levels. The combination of these processes creates considerable background noise, which makes it difficult to test individual zinc-related transport functions.
This article demonstrates a method to directly monitor the zinc transport rate by measuring the intracellular free zinc concentration using a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. The dye has high specificity for Zn2+ and little interference from other divalent cations, such as calcium. In addition, in its ester form, it enters the cells by nonionic diffusion and is then trapped due to the activity of intracellular di-esterase. Thus, its fluorescence is correlated primarily with the free cytosolic zinc concentration. These experiments were conducted to study the structure-function relationship of zinc transporter 1 (ZnT1), a member of the ZnT family.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der zellulären Zinkregulation durch ZnT1-Funktionalität 

Charakterisierung von Zinktransportern in Säugetieren mit einem In-vitro-Zinktransportassay

My research focuses on the structure-function relationship of mammalian zinc transporters, with special emphasis on the regulation mechanism. Due to the importance of zinc ion to cellular function, it is challenging to obtain accurate measurement of cellular zinc dynamics. Our protocol addresses the low signal-to-noise ratio and low temporal resolution of zinc dynamics.This method allows testing of zinc influx across the cell membrane, with high temporal resolution and considerably less background noise and cross-interactions by other divalent cations. We found that the unstructured extension of the mammalian transporter ZnT1 one C-terminal domain is not involved in the zinc transport function. This allows researchers to focus on other domains of the ZnT1 protein for zinc transport regulation.

ZnT1 ist ein Zinktransporter von Säugetieren, der sich auf der Zellplasmamembran13 befindet. Es ist ein Mitglied der Familie der Kationendiffusions-Facilitatatoren (CDF), die Zink aus dem Zytosol in das extrazelluläre Millieu extrudieren14. ZnT1 hat eine Zwei-Domänen-Architektur: die Transmembrandomäne, die die Ionen durch die Membran transportiert, und eine C-terminale Domäne14. Im Gegensatz zu anderen bekannten CDF-Proteinen besitzt ZnT1 eine ...

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Die Messung des Zinktransports hat sich aufgrund der schwachen kausalen Verbindungen zur Proteinfunktion und der geringen zeitlichen Auflösung als schwierig erwiesen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Überwachung der Zn2+-Extrusion aus lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung eines Zn2+-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, der eine direkte Messung desZn2+-Ausflusses ermöglicht.

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...

Meine Forschung konzentriert sich auf die Struktur-Funktions-Beziehung von Zinktransportern in Säugetieren, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Regulationsmechanismus. Aufgrund der Bedeutung von Zinkionen für die Zellfunktion ist es schwierig, eine genaue Messung der zellulären Zinkdynamik zu erhalten. Unser Protokoll adressiert das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis und die geringe zeitliche Auflösung der Zinkdynamik.Diese Methode ermöglicht es, den Zinkeinstrom durch die Zellmembran mit hoher zeitlicher Auflösung und deutlich weniger Hintergrundrauschen und Kreuzwechselwirkungen durch andere zweiwertige Kationen zu testen. Wir fanden heraus, dass die unstrukturierte Verlängerung des Säugetiertransporters ZnT1 um eine C-terminale Domäne nicht an der Zinktransportfunktion beteiligt ist. Dies ermöglicht es den Forschern, sich auf andere Domänen des ZnT1-Proteins für die Regulierung des Zinktransports zu konzentrieren.

characterizing-mammalian-zinc-transporters-using-an-vitro-zinc

Research

JoVE Journal

Biology

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

793 Aufrufe.  Ben-Gurion University. Meine Forschung konzentriert sich auf die Struktur-Funktions-Beziehung von Zinktransportern in Säugetieren, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Regulationsmechanismus. Aufgrund der Bedeutung von Zinkionen für die Zellfunktion ist es schwierig, eine genaue Messung der zellulären Zinkdynamik zu erhalten. Unser Protokoll adressiert das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis und die geringe zeitliche Auflösung der Zinkdynamik.Diese Methode ermöglicht es, den Zinkeinstrom durch die Zellmemb...

Serie: Autor im Rampenlicht: Erforschung der zellulären Zinkregulation durch ZnT1-Funktionalität 

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Forschung

Biologie

Zinc-Specific Staining of Transfected HEK293T Cells

Begin by analyzing transfected HEK293T cells using an inverted fluorescence microscope. Once the cells are focused using bright-field light, switch to fluorescent mCherry excitation wavelength of 587 nanometers and emission wavelengths of 610 nanometers. After turning off the bright-field light, check for the fluorescence of the cells to confirm the expression of ZnT1 mCherry.To prepare dye-loading solution, take four microliters of zinc-specific fluorescent dye solution. Then add four microliters of 10%pluronic acid. Mix the solution by pipetting up and down, and transfer it to a 1.5-milliliter tube.Add 750 microliters of washing solution into the prepared solution and vortex the tube vigorously. Again, add 750 microliters of wash solution. Once vortexed, add 750 microliters of this solution into two wells of a new six-well culture plate and cover it with aluminum foil.Using tweezers, transfer a 13-millimeter cover slip from the previously cultured HEK293T cell plate into a six-well plate. After covering the plate with foil, gently shake it for 15 to 20 minutes and replace the dye-loading solution with the prepared washing solution. Once the plate is covered, shake it again for 20 minutes.

Zinkspezifische Färbung von transfizierten HEK293T Zellen

Sample Preparation and Fluorescence Measurement of Stained Transfected HEK293T Cells

To begin, turn on the microscope, light source, camera, and suction system. For washing the perfusion system, use Ringer's solution in the first chamber and Ringer's zinc solution supplemented with pyrithione in the second chamber. After closing the tap, fill the chambers with the same solutions.To begin sample preparation, place the perfusion chamber with the narrow side of the groove facing up and apply a sealing silicone around the groove. Then, using a fine tweezer, transfer a 13-millimeter coverslip from the washing solution on top of the groove with cells facing down. Place a 22-millimeter coverslip on top of the 13-millimeter coverslip and tighten it using the tweezer, taking care not to crack the coverslips.Flip the chamber and press it to release the liquids. Then, fill the groove with 100 microliters of Ringer's washing solution and press again, ensuring no leakage. Mount and secure the perfusion chamber onto the platform.Then, attach the perfusion and suction tubes for perfusion over the cells in the groove. Change the perfusion rate to approximately two milliliters per minute and turn on Ringer's solution perfusion. For measurements, open the imaging software.Set the microscope magnification to 10X using the left side button of the microscope. After choosing Live View, use the joystick to move the platform and focus on the cells in the groove. Select the appropriate wavelength for mCherry.Once the cells are focused, move the platform for the selection of appropriate cell patches. Select the Draw ROIs dropdown menu. Choose Draw Circular ROIs and draw ROIs on cell clusters with the mCherry-expressing cells.Create new ROIs beyond the first by holding down the Shift button and then by pressing and dragging the existing ROIs. Select Draw Square Background ROI from the dropdown menu and adjust the location and size of the background ROI where cells are not present. After ensuring the absence of cells in the background ROI, go to the ND Acquisition tab.Select the Wavelength subtab and mark its checkbox. Ensure that the checkbox for GFP wavelength is also marked. Click on the Time subtab and define the measurement interval as every five seconds and duration as 30 minutes.On the microscope panel, press the On to enable the Perfect Focus System, or PFS. Under ND Acquisition, ensure PFS on is ticked. Adjust the focus and click Run now.Start baseline period measurement for 90 seconds using Ringer's solution perfusion. After 90 seconds, switch from the Ringer's solution perfusion to the Ringer's zinc solution perfusion, and click the red flag on the bottom right of the main interface panel once the fluorescence rise starts to saturate. Change back to perfusion with Ringer's solution until the experiment time expires.To export the data with baseline subtraction, press the Background Correction button and view the changes in the ND Acquisition window. Click the Export button to save the data in the desired location. An increase in fluorescence resulted from increased intracellular zinc concentration, while a decrease indicated the activity of ZnT-1 transporting zinc across the cell membrane.The wild type ZnT-1 had a smoother fluorescence curve than the mutant, relating to the variability in the cellular responses to zinc load. A box plot comparing the activities of wild-type and delta USCTD showed similar average transport rates, indicating a lack of difference between the wild type and the mutant. However, the difference in the spread may indicate a functional difference.