Wir möchten Ryan Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) für die Dreharbeiten unsere Verfahren und Rodney McPhail (Department of Biological Sciences, Purdue University) für die Unterstützung bei der Bearbeitung der Dissektion Video danken. Die Forschung im Labor Suter wird durch Zuschüsse aus dem NIH (R01 NS049233) und die Bindley Bioscience-Center an der Purdue University, um DMS unterstützt

Lösungen <ul><li> L15-ASW Zellkulturmedium (1l) <ul><li> 1 Beutel Pulver L15 </li><li> Add 800 ml H 2 O Reinstwasser </li><li> NaCl 400 mM </li><li> MgSO 4 27 mM </li><li> MgCl 2 28 mM </li><li> L-Glutamin 4 mM </li><li> Gentamicin 50 pg / ml </li><li> HEPES 5 mM </li><li> Passen Sie auf pH 7,9 </li><li> Add Tropfen für Tropfen CaCl 2 9,3 mm (Stopp, wenn Niederschläge) </li><li> Add H 2 O Reinstwasser auf 1 l </li><li> Überprüfen Sie Osmolarität (950-1000 mmol / kg) mit Osmometer (Dampfdruck, Wescor # 5520) </li><li> Filter 0,22 um mit einer positiven Druckfiltration Einheit (Filter: Millipore SVGV010RS) </li><li> Lagerung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat </li></ul></li><li> Poly-L-Lysin (70-150 kD) 200 pg / ml Stammlösung in sterilem H 2 O Reinstwasser bei -20 o C </li><li> 0,5 M MgCl 2-Lösung </li></ul> Tag 1: Präparation Aplysia Abdominalganglion Vorbereitung der enzymatischen Spaltung Lösung <ol><li> Wiegen 9-10 mg der Dispase Enzym (Worthington, Cat: LS02111) in ein Eppendorf-Röhrchen </li><li> Add 900 ul L15-ASW Kulturmedium und 100 ul sterilem H 2 O Reinstwasser </li><li> Mix und bei Raumtemperatur (RT) </li></ol> Präparation Abdominalganglion <ol><li> Füllen Sie eine 50 ml Spritze mit 0,5 M MgCl 2-Lösung. </li><li> Nehmen Sie ein Tier aus dem Tank, sanft behandeln, um Tieres Farbwerk Abwehrreaktion zu vermeiden. </li><li> Legen Sie die Aplysia auf seiner Seite auf eine Dissektion Bord (Styropor board), rostral Seite auf die rechte, kaudalen Seite nach links. </li><li> Legen Sie die Nadel in Tier unmittelbar hinter dem Kopf und injizieren alle MgCl 2-Lösung in die Körperhöhle. </li><li> Reiben Sie das Tier auf die MgCl 2-Lösung im gesamten Körperhöhle zerstreuen, für ein paar Minuten für das Tier warten, um vollständig betäubt. </li><li> Pin den Kopf und Schwanz des Tieres, um die Zerlegung Board mit zwei Nadeln. </li><li> Verwenden einer Pinzette die Haut anheben, Schnitt durch Haut und Muskel-Schicht mit großen Scheren auf den Kopf und Schwanz, um eine große Öffnung an der Seite zu machen. </li><li> Finden Sie die Abdominalganglion unter der Bürste wie Eierstock. Verwenden einer Pinzette, um den Anschluss Nerven ca. 1 cm vor dem Abdominalganglion halten, schneiden Sie die Nerven mit Dissektion Schere vor der Zange Halteposition und hinter dem Abdominalganglion. </li><li> Legen Sie Ganglion in die Dispase-Lösung und Inkubation für den 15./16 h bei 22 ° C mit einer Temperatur-kontrollierten Wasserbad. </li></ol> Tag 2: Beschichtung von Aplysia Tasche Zellen Herstellung von Poly-Lysin-beschichtete Deckgläschen <ol><li> In einem Fluss Bank, bereiten drei 35mm Petrischalen als Arbeitszeit Gerichte für die Präparation des Ganglion, die sie mit 4 ml L15-ASW Medium jeder. Übertragen Sie die Abdominalganglion aus der Dispase Lösung für eine der Arbeitssprachen Gerichte nach 15,5 Stunden der Verdauung. </li><li> Mit einer Pinzette zu nehmen Säure gereinigt # 1.5 Deckgläser (22x22 mm) in Ethanol gelagert, entfernen Sie Alkohol und sterilisieren Deckgläser durch Abflammen sie kurz über Bunsenbrenner. Lassen Sie sie kurz abkühlen, bevor Sie die Deckgläser in den Kulturschalen. </li><li> Bereiten Sie eine gebogene Spitze Beschichtung durch Biegen einer gelben Spitze über dem Bunsenbrenner (Flamme nur kurz zum Schmelzen von Kunststoff zu vermeiden!). </li><li> Bereiten Sie entsprechende Menge von 20 ug / ml Poly-Lysin-Lösung durch Verdünnung 200 ug / ml Stammlösung mit sterilem H 2 O Reinstwasser. </li><li> Cover jede Deckglas mit 500 ul 20 pg / ml Poly-Lysin und inkubieren für 20 Minuten bei RT. </li><li> Waschen Sie jeden Deckglas 3-5 mal mit 500 ul sterilem H 2 O Reinstwasser jeder. </li><li> Entfernen von Wasser aus Deckgläser; füllen jedes Gericht mit 4 ml L15-ASW Kulturmedium. </li></ol> Die Dissoziation von bag-Zellen <ol><li> Unter einem Dissektionsmikroskop, schneiden Sie die Abdominalganglion in Hälfte mit Dissektion Schere und Pinzette zuvor mit 95% igem Ethanol (Abbildung 1 Zeile 1) gereinigt. </li><li> Auf der einen Hälfte des Ganglion, zwischen Sack Zellverband und die hemiganglion Zellen (Abbildung 1 Zeile 2) geschnitten, und schneiden übrigen Nerven-Erweiterungen auf der anderen Seite der Tasche Zellen (Abbildung 1 Zeile 3). Die Arbeit auf der einen Hälfte des Ganglion zu einer Zeit, lassen Sie die andere Hälfte in die Schüssel, während Zellen, die aus ersten Cluster sind vergoldet werden. </li><li> Mit zwei Zangen (oder einer Pinzette und Schere Dissektion), Release Bag Zellverband, indem Sie neben dem Bindegewebe um die Tasche Zellverband. Cut entfernt Bindegewebe mit Dissektion Schere, wenn nötig. Vorsicht nicht zu quetschen und berühren Sie die Tasche Zellverband zu viel während dieses Prozesses. </li><li> Wenn die meisten der Bindegewebe entfernt ist, übertragen Sie die bag Zellklumpen in einer neuen Arbeitsgruppe Schale mit dem gebogenen gelben Spitze vorbereitet früher. Seien Sie vorsichtig, dass keine der Tasche Zellhaufen innerhalb der gelben Spitze eingefangen werden oder stecken in der Luft / Medium-Schnittstelle. </li><li> Man reibt den Cluster mit gelber Spitze, um einzelne Tüte Zellen zu entfernen. Tun Sie dies durch Pipettieren der Cluster in und aus der Spitze. Beginnen Sie mit geringen Scherkräften und erhöhen Kraft nach Bedarf. Verwenden Sie immer den niedrigsten Kraft benötigt, um Neuronen, ohne töten zu viele Zellen zu entfernen. </li><li> Sammeln Sie 3-5 gesunde Tasche Zellen und übertragen Sie sie auf einen Teller mit einem Poly-Lysin-beschichtete Deckglas. Vermeiden Abholung toten Zellen (sie sind schwarz / transparent in der Mitte) und Bindegewebe Schutt. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6. Ort und ca. 15-25 Live-Neuronen in der Mitte jedes Deckglas. Wenn tote Zellen oder Schmutz sowie transferiert werden, entfernen Sie die unerwünschten Material, indem man es nach oben oder bläst es weg von den gesunden Zellen. Dieser Vorgang dauert ca. 2-3 Stunden für beide Cluster. </li><li> Sobald Sie fertig sind halten die Kulturschalen auf der Flow Bench für mindestens 2 Stunden bei RT, damit Zellen zu befestigen (keep Flow Bench Gebläse ausschalten, um unerwünschte Schwingungen zu vermeiden). </li><li> Die Schalen werden in einem Brutschrank bei 14 ° C über Nacht oder bis zur weiteren Verwendung. Wachstum Kegel kann in 4-10 Stunden zu entwickeln. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="Abbildung 1. Schematische Darstellung der Aplysia californica Abdominalganglion. Farbe Linien zeigen, wo zu schneiden, um bag Zellhaufen zu erhalten." /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Aplysia californica Abdominalganglion. Farbe Linien zeigen, wo zu schneiden, um bag Zellhaufen zu erhalten. Tag 3: Einrichten Kammer für die Live-Darstellung von Aplysia Tasche Zellen Versammlung der Bildgebung Kammer <ol><li> Vor der Verwendung Tasche Zellen für Live Cell Imaging Experimenten untersuchen Zellen auf einem Low-Power-Mikroskop. Wenn Zellen nicht ein gesundes Wachstum Kegel entwickelt haben, liefern frisches Medium und lassen bei RT für 1-2 Stunden. </li><li> Zur Versorgung Platten mit frischem L15-ASW Medium, entfernen Sie die Hälfte (~ 2 ml) des alten Mediums mit einer Vakuum-Linie, und 2 ml der neuen L15-ASW Medium pro Petrischale. Es ist wichtig, nicht vollständig entfernen Medium aus der Schale auf einmal, da diese Zellen aus dem Deckglas entfernt werden. </li><li> Für Beutel cell imaging, montieren wir zwei Deckgläsern und zwei Abstandhalter aus Kunststoff in einer Sandwich-Imaging-Kammer. Die obere Deckglas in das Sandwich ist kürzer geschnitten, um den einfachen Austausch von Medium und Reagenzien ermöglichen. Bei der Montage sollte Deckgläser mit Tasche Zellen befestigt in L15-ASW Medium jederzeit getaucht werden, um Zellen aus Verdrängen zu verhindern. </li><li> Zur Vorbereitung der Kammer, abgeschnitten ~ 2mm von der rechten Seite eines # 1 Deckgläser 22x22 mm mit Diamant-Stift (Glasschneider) und der Herrscher. </li><li> Mit einer 1 ml Spritze, gelten Hochvakuumfett zu beiden Seiten der kürzeren Deckglas, und befestigen Sie Abstandhalter aus Kunststoff auf beiden Seiten. Bewerben Vakuumfett an die Spitze der beiden Abstandshalter. </li><li> Kehren Sie die Deckglas und spacer Montage, und setzen in Petrischale mit Tasche Zellen auf einem Deckglas. Richten und sanft nach unten drücken, um Top-Deckglas nach unten Deckglas-Stick mit dem hinteren Ende von zwei Q-Tips. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig aus Sandwich-Montage aus der Petrischale, ohne das Medium austritt. Richten Sie die beiden Deckgläser, falls erforderlich, und wischen Sie überschüssiges Medium mit einem Kimwipe. Legen Sie das Sandwich auf den unteren Teil der Objektträger Halter und befestigen Sie den Deckel vorsichtig mit Clips. </li><li> Reinigen Sie die Mitte der oberen Seite des Sandwich mit Q-Tips abgetupft in Glasreiniger (Sparkle ist als Glasreiniger verwendet). Trocknen schnell aus dem Glasreiniger mit einem zweiten, trockenen Q-Tip, der Streifen Linien zu vermeiden. Machen Sie dasselbe für die untere Deckglas. Saubere Deckgläser frei von Streifen Linien sind für hohe Bildqualität wichtig. </li></ol> Bag-Zellen unter dem Mikroskop Da Aplysia Tasche Zelle neuronalen Kulturen mit geringer Dichte sind, ist es am besten, wenn Ihr Mikroskop Setup Tischpositionierarbeitsweg Funktionen zur Erleichterung der Wechsel zwischen den Zellen. Bag-Zellen können leicht bei RT für mehrere Stunden auf der Bühne gehalten während der Bildgebung Experimente. Austausch des Mediums in regelmäßigen Abständen, um Verdunstung zu vermeiden.

<ol>
	<li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons.">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li><li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule,+apCAM,+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling.">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li><li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones.">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li><li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering.">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li></ol>

Aplysia Tasche Zelle Neuronen eine serumfreien neuronalen Zellkultur-System mit sehr wenigen nicht-neuronalen Zellen. Diese Neuronen bilden sehr große Wachstum Kegel geeignet, um eine Reihe von wichtigen zellbiologischen Fragestellungen zu beantworten. Bag Zelle Neuronen können leicht manipuliert werden und abgebildet bei Raumtemperatur über mehrere Stunden. Unter Verwendung von fluoreszierenden Speckle Microscopy (FSM) kann man quantitativ zu analysieren die verschiedenen Parameter des F-Aktin und Mikrotubuli-Polymerisation und Translok...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>#1 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>48366067</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#1.5 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>2870-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm Petri dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Falcon</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filters for medium filtration</td>
<td>Tool</td>
<td>Millipore</td>
<td>SVGV010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High vacuum grease</td>
<td>Tool</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Osmometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Wescor</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic shims</td>
<td>Tool</td>
<td>Small Parts Inc </td>
<td>SHSP-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>C79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L15 medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41300-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8540</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>5958-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>6070-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-lysine (70-150 kD) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt </td>
<td>7581</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutral Protease (Dispase)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Worthington</td>
<td>LS02111</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

neuronal cell cultures from aplysia for high-resolution imaging of growth cones

Neuronale Wachstum Kegel sind die sehr beweglichen Strukturen an der Spitze der Axone, die Führung cues in der Umgebung zu erkennen und kann transduzieren diese Informationen in gerichtete Bewegung in Richtung der entsprechenden Zielzelle. Um vollständig zu verstehen, wie Führung Informationen von der Zelloberfläche an die zugrunde liegende Dynamik des Zytoskeletts Netzwerke übertragen, benötigt man ein Modell-System eignet sich für Live Cell Imaging von Protein Dynamik bei hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Typische Wirbeltiere Wachstum Kegel sind zu klein, um quantitativ zu analysieren F-Aktin und Mikrotubuli-Dynamik. Neuronen aus dem Seehasen Aplysia californica sind 5-10 mal größer als Wirbeltiere Neuronen, kann leicht bei Raumtemperatur aufbewahrt werden und sind sehr robust Zellen für Mikromanipulation und biophysikalische Messungen. Ihr Wachstum Kegel sehr zytoplasmatischen Regionen und eine gut beschriebene Zytoskelett-System definiert. Die neuronalen Zellkörpern können mit einer Vielzahl von Sonden zur Untersuchung von Wachstum Kegel Motilität und Führung mikroinjiziert werden. In der vorliegenden Protokoll zeigen wir ein Verfahren für die Präparation des Abdominalganglion, Kultur bag Zelle Neuronen und die Einrichtung eines bildgebenden Kammer für Live Cell Imaging Wachstum Kegel.

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Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Aplysia californica Neuronen entwickeln große Wachstum Kegel in Kultur, die sich hervorragend für hochauflösende Bildgebung des Wachstums Kegel Motilität und Führung sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Präparation und Beschichtung von Aplysia Tasche Zelle Neuronen sowie für die Einrichtung einer Kammer für Live Cell Imaging.

Neuronalen Zellkulturen von Aplysia für High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Aufrufe.  Purdue University. Aplysia californica Neuronen entwickeln große Wachstum Kegel in Kultur, die sich hervorragend für hochauflösende Bildgebung des Wachstums Kegel Motilität und Führung sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Präparation und Beschichtung von Aplysia Tasche Zelle Neuronen sowie für die Einrichtung einer Kammer für Live Cell Imaging.

Serie: Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Forschung

Biologie

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. Addition of interleukin 2 to the culture media during the expansion phase is necessary to prevent cell death and sufficient to maintain short-term T cell lines but has been shown to increase Th1 polarization 3. Replacement of interleukin 2 by T cell growth factor (TCGF) which contains a mix of cytokines is more effective than interleukin 2 in maintaining long-term T cell lines in vitro 3. Moreover, TCGF can easily be prepared in large amounts in the laboratory and is much cheaper than recombinant interleukin 2. 
Here, we show how to prepare TCGF from rat splenocyte culture supernatants. For this procedure, we harvest spleens from naive Lewis rats euthanized for thymus and blood collection. We prepare single-cell suspensions from the spleens, lyze the red blood cells by osmotic shock, and seed the splenocytes in culture medium. The cells are stimulated with concanavalin A, a mitogen that non-selectively activates all rat T lymphocytes, inducing the production of cytokines. The culture supernantant is collected 48 hours later andexcess concanavalin A is bound to alpha methyl mannoside to prevent it from activating T cell lines to which TCGF will be added. The TCGF is then sterile-filtered, aliquoted, and stored at -20&deg;C.

We describe the preparation of T cell growth factor used for the in vitro expansion of antigen-specific rat T lymphocyte lines.

Vorbereiten T Cell Growth Factor von Rat Splenozyten

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

Vorbereitung der Aplysia Sensory-Motor neuronalen Zellkulturen

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Generierung von Dispersed präsomitischen Mesoderm Zellkulturen für Imaging der Zebrafisch-Segmentierung Uhr in Einzelzellen

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Ex-vivo-Verfahren für High Resolution Imaging von Cilia Motilität in Nagetier Atemwegsepithelien

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Verwendung plusTipTracker Software zum Messen in die Dynamik der Mikrotubuli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wachstumskegel

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...