Das Projekt wurde vom NIH U01HL098180 vom National Heart, Lung, and Blood Institute unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt den offiziellen Standpunkt des National Heart, Lung, and Blood Institute oder die National Institutes of Health

1. Reagenzien-Setup 1.1 Dissection und Imaging Medium Leibovitz L-15-Medium (L15) mit FBS (10%) und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten / ml Penicillin G-Natrium und 100 ug / ml Streptomycin Sulfat) ergänzt wird sowohl während der Ernte und Abbildung Luftröhre Proben verwendet. 2. Shallow Walled Kultur Chamber Assembly Die Kammer zur Luftröhre Gewebe halten ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Boden der Kammer ist der Glasboden 35 mm Kulturschale. Die obere und die Seite der Kammer wird, indem ein kleines Stück 0,3 mm dicken Silikon Folie über die Glasschale generiert. Der Rand der Platte geschnitten wird, um die runde Bodenschale passen und das Zentrum weiter getrimmt, um eine flache zentrale Kammer zu bilden (siehe Schritte 2.1-2.3). Am Anfang dieser Montage wird ein 18 mm runden Deckglas platziert, um eine geschlossene Kammer für Bildgebung erzeugen. <ol><li> Komplett decken ein 18 mm runden Deckglas mit einem Quadrat von 0,3 mm dicke Folie Silikon. </li><li> Mit Standard scharfe Sektion Schere überstehendes Silikon Folie aus um den Rand des Deckglases (resultierend in einer kreisförmigen Schicht aus Silikon-Folie). </li><li> Mit einem scharfen Skalpell ausgeschnitten und Entfernen eines zentralen Platz von Silikon-Folie (ca. 10 mm im Quadrat) von der Mitte der überdachten Deckglas (wodurch die Oberseite und die Seiten des bildgebenden Kammer). </li></ol> 3. Luftröhre Ernte und Vorbereitung <ol><li> Euthanize Mäusen in Übereinstimmung mit den örtlichen Institutionen Tierpflege und verwenden Ausschuss und / oder staatlichen Richtlinien und entfernen Luftröhre in einem Standard-Kunststoff 35 mm Kulturschale mit genug L15 Medien zu versenken Gewebe (Autoren haben Mäuse kurz vor der Geburt bei Trächtigkeitstag 16.5 verwendet, bis hin zu Neugeborenen, Neugeborenen und erwachsenen Tieren 2). </li><li> Entfernen nicht-Trachea zugehörigen Gewebe an der Außenseite desdie Luftröhre mit stumpfen Dissektion. </li><li> Entfernen Sie den Kehlkopf mit einem Schnitt quer unterhalb des Ringknorpels mit Mikro Schere Dissektion (2A, Zeile 1). </li><li> Entfernen Sie die linke und rechte primäre bronchiale Äste mit einem Schnitt quer oberhalb der Carina mit Mikro Schere Dissektion (2A, Zeile 2). </li><li> Halten Sie das Luftröhre mit feinen Pinzetten und bündig die Lumen 2-3 mal mit ~ 1 ml der Baden L15 Medium mit einem P1000 und P1000 Pipetman Spitze, um Schleim und Blut zu löschen. </li><li> Schneiden Sie einen Ring 3-4 Segment der Luftröhre mit einem Schnitt quer mit Mikrodissektion Schere (2B, Zeile 1). </li><li> Schneiden in Längsrichtung durch die Mitte des trachealis Muskel dieser kurzen Luftröhrensegment mit Mikro Schere Dissektion (2B, Zeile 2). </li><li> Schneiden in Längsrichtung durch die Mitte der Trachealknorpels Ringe mittels Mikrodissektion Schere (2C </strong&gt;, Zeile), so dass zwei Abschnitte der Luftröhre Gewebe geeignet zur Bildgebung (einzigen Abschnitt in 2D gezeigt). </li></ol> 4. Cilia Imaging <ol><li> Übertragen Luftröhre Gewebe Segmenten Lumen unten, auf der Mitte eines 35 mm Glasboden Kulturschale mit 100-200 ul L-15-Medium. </li><li> Zur Quantifizierung Zilien generierte Strom eine geringe Menge von 0,20 um fluoreszierenden Mikrosphären auf den L-15-Medium baden die Luftröhre Gewebeprobe (~ 1 x 10 11 Partikel / ml oder 20 ul / ml des Fluoresbrite 2,5% wässrige Mikrokugel-Suspension). </li><li> Legen Sie die Imaging-Kammer zuvor (siehe Vorgehensweise 1-3 oben) auf der Oberseite der Luftröhre Probe Silikon-Blatt nach unten vorbereitet, mit der Luftröhre Probe in der Mitte des flachen ummauerten Kammer durch das Fenster in die Silikon-Folie geschnitten gebildeten (Abbildung 1 ). </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf dem Deckglas, um im Platz zu sichern und entfernen Sie überschüssiges L-15 Medien aus dem Kanten usinga P1000 und P1000 Pipetman Spitze. </li><li> Montieren Sie das 35 mm Glasboden Kulturschale und Luftröhre Probe auf einem inversen Mikroskop mit 100x-Objektiv und DIC-Optik. </li><li> Mit einem High-Speed-Kamera und Film-Erfassungs-Software sammeln Filme von Zilien Motilität bei 200 + Frames pro Sekunde entlang der Luftröhre ciliated Epithelien der zusammengerollt Rand des trachealis Muskel (Abbildung 2D eingerahmten Feld, E: Beispiel Standbild aus aufgezeichneten Film) (Supplementary Film 1). </li><li> Mit FITC epifluoreszenten Bildgebung und ein wenig Licht CCD-Kamera (siehe Ausstattungsliste oben), sammeln Filme von fluoreszierenden Mikrokügelchen Bewegung über die Oberfläche des ciliated trachealen Epithel später Quantifizierung der Zilien erzeugte Strömung (Ergänzende Movie 2) zu ermöglichen. </li></ol> 5. Quantifizierung von Cilia Motilität <ol><li> Legen DIC abgebildeten Filme in der ImageJ Software-Paket und im Anschluss an die Technik, die von I beschriebenain Drummond 13 verwenden Sie die Zeile Werkzeug, um ein Raster-Linie über den Wimpern schlagen zu ziehen. A &quot;reslice&quot; dieser Linie erzeugt eine Art Bild kymograph wo Zilien Bewegung über die Linie erzeugt ein Wellenmuster. Die Anzahl der Pixel zwischen jedem Wellenberg ist sie gemessen (ein Pixel = ein Film-Frame), aus denen die Anzahl der Schläge pro Minute (dh Hz) kann dann berechnet werden. </li><li> Um Zilien erzeugte Strömung Last fluoreszierenden Kügelchen Filme in der ImageJ Software-Paket zu messen, und verwenden Sie das Plugin MTrackJ 14 manuell verfolgen fluoreszierende Kügelchen über die Oberfläche der Luftröhre Epithelien und lassen Sie die Software erzeugen Wulst Geschwindigkeit und Ausrichtung für jede Perle verfolgt. </li></ol> Es sollte darauf geachtet bei der Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen zu fließen wie der Abstand von dem schlagenden Cilien quantifizieren stark beeinflussen können gemessenen Flußbetrags werden. Der Wulst Bewegung in Supplemental Movie 2 ist ein gutes Beispiel dafür. In diesem Beispiel WulstBewegung an der Oberfläche des schlagenden Cilien schnell und deutlich fällt für Perlen weiter weg in den baden-Medien. Um dies zu kontrollieren, sollte Wulst Kurven nur in einem festen Abstand über der Flimmerepithelien in allen Proben gesammelt werden, damit die korrekte Vergleich möglich ist. Schließlich, um repräsentative Daten über Strömung zu erhalten, sollte Perlen für so lange wie möglich verfolgt werden; wir lieber zu Wulst Tracks, 10 + Flimmerzellen decken zur Berechnung Strömung verwenden.

<ol>
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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+heterotaxy+with+single+ventricle+spectrum+of+cardiac+anomalies.">Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies.</a> Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).</li><li>Tan, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotaxy+and+complex+structural+heart+defects+in+a+mutant+mouse+model+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia.</a> J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+sequencing+identifies+the+gene+Megf8+with+ENU-induced+mutation+causing+heterotaxy.">Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).</li><li>Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+scraping+in+diagnosing+ciliary+dyskinesia.">Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia.</a> Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).</li><li>Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+improving+the+diagnostic+approach.">Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach.</a> Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).</li><li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices.">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).</li><li>Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+3D+tissue+model+of+the+airway+wall+and+mucosa.">Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa.</a> Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).</li><li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).</li><li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia.">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cilia+in+zebrafish.">Studying cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Schwabe, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia+associated+with+normal+axoneme+ultrastructure+is+caused+by+DNAH11+mutations.">Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations.</a> Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).</li><li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia.">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li><li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells.">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Messung der Zilien Überlagerungsfrequenz (CBF) ist relativ einfach mit hoher Leistung Mikroskop-Objektive und schnelle Bildaufnahme Hardware 13,15, und erklärt, warum CBF-Messungen die Grundlage der meisten Studien untersuchen mukoziliäre Clearance bei Gesundheit und Krankheit bilden. Doch während CBF-Messung ist für das Verständnis mukoziliäre Clearance, Messung der CBF allein wesentlichen ignoriert die zugrunde liegende Bedeutung sowohl ciliary erzeugt Strom und Cilienschlag Wellenform, die beide meh...

Analyse von beweglichen Zilien Funktion im Atemwegsepithelien ist experimentell wichtig für die Aufklärung der genetischen und umweltbedingten Faktoren, die mukoziliäre Clearance und pulmonale Gesundheit 1 beeinflussen können. Das einfache Protokoll für die Bildgebung der Maus Atemwegsepithelien entwickelt bietet eine effiziente Methode, um Atemwege Zilien Motilität in Mutanten und Knockout Mausmodelle verhören und erfordern nur Grundkenntnisse in Maus Luftröhrengewebe Dissektion und ex-vivo-Bildgebung der Atemwege Zilien Motilität mit hoher Auflösung Videomikroskopie. Dieses Protokoll wurde gegründet und während eines großen Maus Mutagenese Bildschirm verfeinert, um eine schnelle Auswertung der beweglichen Zilien Funktion (Zilien Überlagerungsfrequenz, Cilienschlag Form, Zilien erzeugte Strömung) in Mutanten mit angeborenen Herzfehlern mit Heterotaxie 2-5 ausgesetzt sind. Aktuelle Techniken zur Atemwege Zilien Motilität studieren kann entweder in der akuten ex vivo-Typ oder lon gruppiert werdenger Begriff in vitro experimentelle Ansätze. Akute Experimente umfassen ex vivo Visualisierung der menschlichen Nase / Atemwege Pinsel Biopsien 6,7 und Analyse einfacher quer Atemwege Abschnitte 8. Die in-vitro-Ansätze nutzen verschiedene Techniken, um Zellkultur Blatt differenzierte Flimmerepithelien wie in Luft Grenzfläche Kulturen oder Atemwege Suspensionskulturen 9-11 erzeugen. Jedoch erfordern diese Atemwegsepithelien reciliation Techniken sehr bedeutende Investition in Zeit und Training, bevor irgendwelche brauchbaren Flimmerepithelzellen zum Experimentieren (4-6 Wochen 9,10) hergestellt werden. Während akute ex vivo Analyse der Atemwegsepithelzellen Pinsel Biopsien häufig für klinische Studien am Menschen verwendet werden, ist diese Methode nicht verwendbar in Mäusestudien aufgrund verschärft mechanische Gewebeschädigung 12. Die Technik in diesem Protokoll für die Analyse von mous skizziertene tracheal Atemwegsepithelien ist nicht nur einfach auszuführen, aber es erfordert keine speziellen Fähigkeiten Dissektion noch irgendeine spezielle Ausrüstung außer denjenigen Standard für die Bildgebung von Videomikroskopie. Es gibt viele Vorteile dieser einfachen Protokoll. Zunächst wird, wie die Maus Luftröhre Gewebe Ernte ist schnell und einfach durchzuführen, ermöglicht es eine schnelle Beurteilung der Atemwege Cilien-Funktion in einer großen Anzahl von Mäusen. Dazu kann auch scharfsinnige Analyse der kurzfristigen Auswirkungen der verschiedenen in vitro-Behandlungen. Zweitens ist eine Ex-vivo-Technik bleibt die ciliated Atemwegsepithel attached to it zugrunde Stützgewebe und behalten somit verbundenen Zelle Signalwege. Daher im Vergleich zu in vitro reciliated Atemwegsepithelien, ist dieses Präparat eine bessere Darstellung des natürlichen Gewebe in vivo Umgebung. Drittens erlaubt das Protokoll der Erwerb einer Reihe von verschiedenen quantitativen Parameter, die die objektive Beurteilung der beweglichen Zilien f liefern kannSalbung. Schließlich, im Gegensatz zu anderen aktuellen Methoden zur Sicherung der Atemwege Zilien Visualisierung, ermöglicht dieses Protokoll für die Visualisierung der Flimmerhärchen im rechten Winkel zu der Cilienschlag Richtung, so dass Profilansicht der Zilien, die optimal für hochauflösende Bildgebung von Cilienschlag und metachronal Welle Generation . Dieses Protokoll kann in einer Reihe von Möglichkeiten, um eine breite Palette von experimentellen Anforderungen wie die Rolle von pharmakologischen Mitteln, genetische Faktoren, Umwelteinflüsse und / oder mechanische Faktoren wie Schleim Belastung der Atemwege Cilien-Funktion und Erzeugung / Wartung adressieren geändert werden Atemwege Cilienschlag und metachronal Wellenausbreitung.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz's L-15 Medium </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>21083-027 </td>
 <td>No phenol red </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum </td>
 <td>Hyclone </td>
 <td>SH30088.03 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>15140-122 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2x fine forceps </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-4976 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5676 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5620 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-9801-15 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 pipetman </td>
 <td>Gilson, Inc </td>
 <td>F123602 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 tips </td>
 <td>Molecular BioProducts </td>
 <td>2079E </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 mm round glass cover slips </td>
 <td>Fisher Scientific </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic 35 mm culture dishes </td>
 <td>Corning </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom 35 mm culture dishes </td>
 <td>Warner Instruments </td>
 <td>W3 64-0758 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick </td>
 <td>AAA Acme Rubber Co </td>
 <td>CASS-.012X36-63908 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.20 &mu;m diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres </td>
 <td>Polysciences </td>
 <td>09834-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters </td>
 <td>Lecia</td>
 <td>DMIRE2 </td>
 <td>Brand is not critical. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters</td>
 <td>Lecia </td>
 <td></td>
 <td>Brand is not critical.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope stage Incubator</td>
 <td>Lecia </td>
 <td>11521749 </td>
 <td>Not required if imaging cilia at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed camera bright field </td>
 <td>Vision Research </td>
 <td>Phantom v4.2 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 125 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed fluorescent camera </td>
 <td>Hamamatsu </td>
 <td>C9100-12 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 10 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Movie analysis software</td>
 <td>National Institutes of Health</td>
 <td>ImageJ with MtrackJ plugin</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

ex vivo method for high resolution imaging of cilia motility in rodent airway epithelia

Ex-vivo-Imaging-Technik für Maus Atemwegsepithelien für die quantitative Analyse von beweglichen Zilien Funktion wichtig für Einblick in mukoziliäre Clearance-Funktion wurde eingerichtet. Frisch geerntete Maus Luftröhre wird in Längsrichtung durch den trachealis Muskel geschnitten und in einer flachen ummauerten Kammer auf einem Glasboden-Gericht. Die Luftröhre Probe wird entlang seiner Längsachse positioniert, um von der trachealis in Längsrichtung gewellt nehmen. Dies ermöglicht die Abbildung von Flimmerbewegung im Profil entlang der gesamten Länge Luftröhre. Videos mit 200 Bildern / sec werden unter Verwendung von Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie und eine Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera der quantitativen Analyse der Cilienschlag Frequenz und Wellenform ciliary ermöglichen. Mit dem Zusatz von fluoreszierenden Kügelchen während der Bildgebung, Zilien erzeugten Fluidstroms bestimmt werden kann. Das Protokoll Zeit erstreckt sich über etwa 30 min mit 5 min für Kammer Vorbereitung, 5-10 min für ProbeMontage und 10-15 min für Videomikroskopie.

Steuerung Atemwege Zilien muss deutlich sichtbar sein und gesehen in einer koordinierten Art und Weise (Supplemental Film 1; Filmwiedergabe auf 15% verlangsamt Echtzeit) zu schlagen, mit spürbarer Strömung in Richtung der Zilien schlagen (Supplemental Movie 2; Filmwiedergabe ist 100% real time). Die Quantifizierung der Zilien Filme sollten zu Ergebnissen führen ähnlich wie in Abbildung 3 zu sehen. Sammlung von High-Speed-DIC Filme ermöglicht die Quantifizierung der...

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Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Eine einfache und zuverlässige Technik für die Visualisierung und Quantifizierung Atemwege Zilien Motilität und Zilien erzeugte Strömung mit der Maus Luftröhre beschrieben. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um zu bestimmen, wie eine Vielzahl von Faktoren Zilien Motilität beeinflussen, einschließlich pharmakologischer Wirkstoffe, genetische Faktoren, Umwelteinflüssen und / oder mechanische Faktoren wie Schleim zu laden.

Ex-vivo-Verfahren für High Resolution Imaging von Cilia Motilität in Nagetier Atemwegsepithelien

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

20.7K Aufrufe.  University of Pittsburgh. Eine einfache und zuverlässige Technik für die Visualisierung und Quantifizierung Atemwege Zilien Motilität und Zilien erzeugte Strömung mit der Maus Luftröhre beschrieben. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um zu bestimmen, wie eine Vielzahl von Faktoren Zilien Motilität beeinflussen, einschließlich pharmakologischer Wirkstoffe, genetische Faktoren, Umwelteinflüssen und / oder mechanische Faktoren wie Schleim zu laden.

Serie: Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Neuronalen Zellkulturen von Aplysia für High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Forschung

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Raum-Zeit-Mapping der Motilität in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Vorbereitung des Darms

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...