Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32071135 und 31471010), dem Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) und der Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400) gesponsert.

1. Bestimmung der optimalen Cas9/sgRNA-Spaltstelle stromaufwärts von cDNA/ORF
<ol><li>Präparation von cDNA- oder ORF-Plasmiden mit identischem Vektorrückgrat<ol><li>Kaufen Sie cDNA/ORF-Klone, die in öffentlichen Ressourcen verfügbar sind, wie z. B. dem Drosophila Genome Resource Center (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection10,11, der mouse mammalian gene collection (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) und der humanen CCSB-breiten Lentiviral-Expressionsbibliothek12. In diesem Protokoll nehmen wir als Beispiel die pOT2-Vektor-basierten cDNA/ORF-Klone, die in der DGRC Gold Collection verfügbar sind.</li>
		<li>Extrahieren Sie Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Mini-Prep-Kit. Messen Sie die Konzentration von Plasmiden mit einem Spektralphotometer.</li>
	</ol></li>
	<li>Design von sgRNAs<ol><li>Besuchen Sie die CHOPCHOP-Website (https://chopchop.cbu.uib.no/). Klicken Sie auf die Schaltfläche Ziel einfügen und geben Sie dann die gewünschte DNA-Sequenz ein. Bei der interessierenden Sequenz handelt es sich um eine 20-100 bp große Region, die sich im pOT2-Vektorrückgrat stromaufwärts des cDNA/ORF 5'-Endes befindet.</li>
		<li>Wählen Sie die Art Drosophila melanogaster. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zielseiten suchen. Wählen Sie sgRNA-Kandidaten mit einer prognostizierten Effizienz von mehr als 80 %.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von sgRNAs<ol><li>Bestellen Sie PAGE-gereinigte Oligos, einen Forward Primer (5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTA GAAATAG-3′), wobei (N)20 die Zielsequenz einer sgRNA und eines sgRNA-Gerüst-Reverse-Primers sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′) ist. HINWEIS: Es wird empfohlen, PAGE-gereinigte, hochwertige Oligonukleotide zu verwenden.</li>
		<li>Bereiten Sie eine DNA-Vorlage durch PCR für die In-vitro-Transkription (IVT) von sgRNA vor. Richten Sie eine 100-μl-PCR-Reaktion wie folgt ein: 5 μl Template pX330 (Addgene-Plasmid 42230, ein Geschenk von Feng Zhang; 0,1 ng/μl), 5 μl Forward-Primer (10 μM), 5 μl sgRNA-REV (10 μM), 50 μl 2x High-Fidelity-PCR-Mastermix und 35 μl mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltes Wasser in einem PCR-Röhrchen.</li>
		<li>Führen Sie die PCR unter den folgenden Thermocycling-Bedingungen durch: 1 Zyklus mit 98 °C für 30 s; 5 Zyklen von 98 °C für 10 s, 51 °C für 10 s, 72 °C für 5 s; 30 Zyklen von 98 °C für 10 s, 72 °C für 15 s; 1 Zyklus von 72 °C für 2 min. Inkubieren Sie Reaktionen in einem Thermocycler.</li>
		<li>PCR-Produkte durch 0,8 % Agarose-Gelelektrophorese trennen. Ein ~120-bp-DNA-Fragment sollte unter UV-Strahlung auf dem Gel sichtbar sein. Reinigen Sie das ~120-bp-DNA-Fragment mit einem Gel-Extraktionskit. Das aufgereinigte DNA-Fragment dient als Template für die IVT von sgRNA.</li>
		<li>Richten Sie eine 5-μl-IVT-Reaktion wie folgt ein: 165 ng ~120-bp gereinigtes Gel-DNA-Fragment, 1,65 μl NTP-Puffermix, 0,33 μl T7-RNA-Polymerase-Mix und DEPC-behandeltes Wasser. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 °C für 4 h. Befolgen Sie die manuellen Anweisungen eines In-vitro-Transkriptionskits .</li>
		<li>Geben Sie 45 μl DEPC-behandeltes Wasser in das IVT-Reaktionsprodukt. Behandeln Sie die IVT-Reaktionsprodukte als RNA und verwenden Sie DEPC-behandeltes Wasser als Blindkontrolle. Messen Sie die Konzentration von sgRNA mit einem Spektralphotometer. Die Konzentration der verdünnten sgRNA liegt bei etwa 870 ng/μL.</li>
		<li>Verdünnen Sie das IVT-Reaktionsprodukt auf 20 ng/μl mit DEPC-behandeltem Wasser. Aliquotieren und lagern Sie sgRNA direkt bei -80 °C. HINWEIS: Nach der IVT-Reaktion ist die Entfernung des DNA-Templates durch DNase-Verdau nicht erforderlich, um die genaue Konzentration von sgRNA zu messen, da die Menge des DNA-Templates weniger als 0,4 % der Menge der sgRNA beträgt und das DNA-Template die nachfolgende CRISPRmass-Reaktion nicht beeinflusst. Daher ist eine sgRNA-Aufreinigung nicht erforderlich.</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluierung von sgRNAs<ol><li>Verdau eines cDNA/ORF-Plasmids mit pOT2-Vektorrückgrat mit einem Restriktionsenzym. Trennen Sie die resultierenden DNA-Fragmente durch 0,8 % Agarose-Gelelektrophorese. Reinigen Sie das DNA-Substrat mit einem Gel-Extraktionskit. HINWEIS: Ein resultierendes DNA-Fragment, das die sgRNA-Targeting-Sequenzen des pOT2-Vektorrückgrats enthält, dient als DNA-Substrat von Cas9/sgRNAs. Die Spaltstellen von Cas9/sgRNAs sind asymmetrisch im DNA-Substrat angeordnet, wodurch die Spaltung des DNA-Substrats durch Cas9/sgRNAs zwei DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe ergibt, was es einfacher macht, sie von dem ungespaltenen DNA-Substrat in der Verdauungsreaktion zu unterscheiden.</li>
		<li>Richten Sie eine 5 μl Cas9-Spaltreaktion wie folgt ein: 0,2 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,5 μl 20 ng/μl sgRNA, 0,015 pmol DNA-Substrat, 0,5 μl 10x Cas9-Puffer und DEPC-behandeltes Wasser. Reaktionen 1 h lang bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Trennen Sie die Spaltprodukte durch 0,8 % Agarose-Gelelektrophorese. Laden Sie das intakte DNA-Substrat als Negativkontrolle für das verdaute DNA-Substrat. HINWEIS: Hier bezieht sich intaktes DNA-Substrat auf DNA-Substrat, das keinen Verdauungsreaktionen durch Cas9/sgRNAs unterzogen wird. Die Spaltung des DNA-Substrats durch Cas9/sgRNAs führt zu zwei DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe, wodurch sie in der Verdauungsreaktion leichter vom ungespaltenen DNA-Substrat unterschieden werden können.</li>
		<li>Analysieren Sie Spaltmuster mit einem digitalen Bildgebungssystem (Abbildung 2). Wählen Sie die effizienteste sgRNA für nachfolgende CRISPRmass-Experimente aus. Abbildung 2 zeigt, dass alle vier sgRNAs eine hohe Spaltungseffizienz aufweisen und für CRISPRmass verwendet werden können. Wählen Sie die unterstrichene sgRNA für nachfolgende Experimente aus. HINWEIS: Je weniger ungespaltenes DNA-Substrat vorhanden ist, desto effizienter ist die sgRNA für den Cas9/sgRNA-Verdau des DNA-Substrats.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Aufbau eines UAS-Moduls
HINWEIS: Ein UAS-Modul besteht aus einem Kern-UAS und etwa 20-40 bp der 5'- und 3'-Endsequenzen, die sich mit den 5'- bzw. 3'-Enden der Rückgratspaltstelle überlappen (Abbildung 1). Die 5'- und 3'-Endsequenzen des UAS-Moduls werden durch die Spaltstelle des Rückgrats des pOT2-Vektors bestimmt.
<ol><li>Klonen Sie das vektorspezifische UAS-Modul pOT2 in die EcoRI-Stelle des pCR8GW-Vektors, was zu einem Plasmid pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 führt (Ergänzende Datei 1). Das vektorspezifische pOT2-UAS-Modul wird durch Aufschluss des Plasmids pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 mit EcoRI bei 37 °C für 1 h freigesetzt.</li>
	<li>Trennen Sie die Spaltprodukte durch 0,7 % Agarose-Gelelektrophorese. Reinigen Sie das UAS-Modul 6178-bp mit einem Gel-Extraktionskit. Verdünnen Sie das UAS-Modul auf 23 ng/μl für nachfolgende Experimente. Dieses 6178-bp-Fragment dient als UAS-Modul für die Konstruktion von UAS-cDNA/ORF-Plasmiden aus pOT2-Vektor-basierten cDNA/ORF-Klonen.</li>
</ol>3. Großmaßstäbliche Konstruktion von UAS-cDNA/ORF-Plasmiden mittels CRISPRmass
HINWEIS: CRISPRmass ist standardisiert als massiv parallele zweistufige Reagenzglasreaktionen vor der E . coli-Transformation (Abbildung 1).
<ol><li>Reagenzglasreaktion Schritt 1<ol><li>Spaltung des identischen Vektorrückgrats der cDNA/ORF-Plasmide durch Cas9/sgRNA. Ordnen Sie die 0,2-ml-Röhrchen in einem Aluminiumkühlblock auf Eis an und beschriften Sie die Röhrchen sorgfältig. Bereiten Sie den Mastermix wie folgt vor.<ol><li>Für eine Einzelreaktion fügen Sie 0,16 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,4 μl 20 ng/μl sgRNA, 0,24 μl 10x Cas9-Puffer und 1,2 μl DEPC-behandeltes Wasser hinzu. Für N-Reaktionen fügen Sie (N+1) x 0,16 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,4 μl 20 ng/μl sgRNA, (N+1) x 0,24 μl 10x Cas9-Puffer, (N+1) x 1,2 μl DEPC-behandeltes Wasser hinzu.</li>
		</ol></li>
		<li>Vortexen, gut mischen und herunterschleudern. Aliquotieren Sie 2 μl Mastermix auf jedes Röhrchen. Geben Sie 0,4 μl 0,019 μM cDNA/ORF-Plasmid in jedes Röhrchen. Die Spaltreaktionen werden 1 h lang bei 37 °C inkubiert. HINWEIS: Verdünnen Sie jedes Plasmid auf 0,019 μM mit DEPC-behandeltem Wasser. Wenn die Konzentration eines Plasmids niedriger als 0,019 μM ist, fügen Sie Plasmid-DNA direkt zur Spaltungsreaktion hinzu. Verwenden Sie RNase-freie Schläuche und DEPC-behandeltes Wasser. Das Ausführen dieser Schritte in großem Umfang dauert mehrere Stunden. Sofern nicht anders angegeben, bewahren Sie Reagenzien und Reaktionen auf Eis auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Reagenzglasreaktion Schritt 2<ol><li>Einfügen eines vektorspezifischen UAS-Moduls aus Schritt 2 in die Cas9-linearisierten cDNA/ORF-Plasmide durch einstufige Reaktionsassemblierung. Richten Sie für jede Probe eine einstufige Reaktion von 1,4 μl ein. Ordnen Sie die 0,2 mL Röhrchen in einem Aluminiumkühlblock auf Eis an und beschriften Sie die Röhrchen sorgfältig.<ol><li>Bereiten Sie den Mastermix wie folgt vor. Für eine Einzelreaktion fügen Sie 0,07 μl 0,006 μM UAS-Modul und 0,7 μl einstufigen Reaktionsassemblierungs-Mastermix hinzu. Für N Reaktionen fügen Sie (N+1) x 0,07 μl 0,006 μM UAS-Modul und (N+1) x 0,7 μl einstufigen Reaktionsassemblierungs-Mastermix hinzu.</li>
		</ol></li>
		<li>Vortexen, gut mischen und herunterschleudern. Aliquotieren Sie 0,77 μl des Mastermixes auf jedes Röhrchen. Geben Sie 0,7 μl Cas9-linearisiertes cDNA/ORF-Plasmid in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 50 °C für 1 h. HINWEIS: Eine Reinigung von einstufigen Montagereaktionsprodukten ist nicht erforderlich. Das Ausführen dieser Schritte in großem Umfang dauert mehrere Stunden. Sofern nicht anders angegeben, bewahren Sie Reagenzien und Reaktionen auf Eis auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Umwandlung von einstufigen Assemblierungsreaktionsprodukten in großem Maßstab in E. coli .<ol><li>10 μl Spitzen bei 4 °C vorkühlen. 1,5 mL Röhrchen in einem Aluminium-Kühlblock auf Eis vorkühlen.</li>
		<li>Kompetente E. coli-Zellen 5 min auf Eis auftauen. Aliquotieren Sie 10 μl kompetenter Zellen in jedes vorgekühlte 1,5-ml-Röhrchen. HINWEIS: Es werden handelsübliche kompetente E. coli-Zellen mit einer Transformationseffizienz von mindestens 1 x 108 KBE/μg pUC19-DNA verwendet.</li>
		<li>1 μl einstufiges Assemblierungsreaktionsprodukt zu 10 μl kompetenten Zellen geben, zum Mischen vorsichtig schwenken und 30 Minuten lang auf Eis legen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Röhrchen 1 min lang in einem 42 °C warmen Wasserbad und kühlen Sie sie dann sofort 2 min lang auf Eis.</li>
		<li>100 μl SOC-Medium (vorgewärmt auf 37 °C) in jedes Röhrchen bei Raumtemperatur geben und in einem Schüttelinkubator (250 U/min) bei 37 °C für 1 h inkubieren.</li>
		<li>Erwärmen Sie die LB-Platten, die ein Antibiotikum enthalten, das dem Antibiotikaresistenzgen des UAS-Moduls entspricht, auf 37 °C. Die Zellen auf die Platten verteilen und über Nacht bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: Das Ausführen dieser Schritte in großem Umfang dauert mehrere Stunden. Sofern nicht anders angegeben, bewahren Sie Reagenzien und Reaktionen auf Eis auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Verifizierung von UAS-cDNA/ORF-Plasmiden, die mit CRISPRmass konstruiert wurden<ol><li>Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und impfen Sie sie in 4,5 ml LB-Flüssigmedium, das mit der entsprechenden Auswahl an Antibiotika ergänzt wird, die dem Antibiotikaresistenzgen des UAS-Moduls entsprechen. Über Nacht bei 37 °C unter Schütteln bei 250 U/min inkubieren.</li>
		<li>Extrahieren Sie Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Mini-Prep-Kit. Eine 20-μl-Restriktionsaufschlussreaktion wie folgt einrichten: 300-500 ng/μl Plasmid, geeignete Restriktionsenzyme, Restriktionsverdauungspuffer und Reinstwasser. Reaktionen 1 h lang bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>DNA-Fragmente werden durch 0,8 % Agarose-Gelelektrophorese getrennt und mit einem digitalen Bildgebungssystem analysiert (Abbildung 3).</li>
	</ol></li>
</ol>

Aufbau einer UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek mit hohem Durchsatz unter Verwendung von CRISPRmass

<ol>
	<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+eukaryotes.">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li><li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster.">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86 (4), 521-529 (1996).</li><li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+Drosophila+melanogaster.">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Bischof, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+platform+for+creating+a+comprehensive+UAS-ORFeome+library+in+Drosophila.">A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila.</a> Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).</li><li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+functional+approach+to+uncover+human+genes+and+pathways+in+Drosophila.">A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila.</a> Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).</li><li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA/ORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans.">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+complementary+DNA+resource.">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).</li><li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+collection:+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%+of+D.+melanogaster+genes.">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs.">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die kritischsten Schritte von CRISPRmass sind das Design von sgRNAs und die Evaluierung von sgRNAs. Die Auswahl hocheffizienter sgRNAs für Cas9 ist der Schlüssel zum Erfolg von CRISPRmass. Wenn auf der Mehrzahl der antibiotikahaltigen LB-Platten nach der Transformation von E. coli mit einstufigen Reaktionsassemblierungsprodukten nur sehr wenige oder keine Kolonien beobachtet werden, ist der Plasmidverdau durch Agarosegelelektrophorese zu überprüfen. Wenn Plasmide nicht gut verdaut werden, überprüfen Sie die Cas9-Ak...

Das unvoreingenommene genetische Screening des gesamten Genoms ist ein leistungsfähiger Ansatz, um Gene zu identifizieren, die an einem bestimmten biologischen Prozess beteiligt sind, und seinen Mechanismus aufzuklären. Daher ist es in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung weit verbreitet. Ungefähr 60% der Drosophila-Gene sind beim Menschen konserviert 1,2, und ~75% der menschlichen Krankheitsgene haben Homologe in Drosophila3. Das genetische Screening wird hauptsächlich in zwei Arten unterteilt: Funktionsverlust (LOF) und Funktionsgewinn (GOF). LOF-Genetic Screens in Drosophila haben eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung von Mechanismen gespielt, die fast jeden Aspekt der Biologie steuern. Die Mehrzahl der Drosophila-Gene weist jedoch keine offensichtlichen LOF-Phänotypenauf 4, und daher ist das GOF-Screening eine wichtige Methode, um die Funktion dieser Gene zu untersuchen 4,5.
Das binäre GAL4/UAS-System wird häufig für die gewebespezifische Genexpression in Drosophila6 verwendet. In diesem System exprimiert das Gewebe spezifisch den Hefetranskriptionsaktivator GAL4, der an das GAL4-responsive Element (UAS) bindet und dadurch die Transkription der nachgeschalteten genetischen Komponenten (z. B. cDNA und ORF) aktiviert6. Um genomweite GOF-Screenings in Drosophila durchführen zu können, müssen wir eine genomweite UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek und anschließend eine transgene UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila konstruieren.
Der Aufbau einer genomweiten UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek mit herkömmlichen Methoden aus öffentlich zugänglichen cDNA/ORF-Klonen ist zeitaufwändig und mühsam, da jedes Gen ein individuelles Design erfordert, einschließlich Primerdesign und -synthese, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gelreinigung, Sequenzierung, Restriktionsverdau usw. 7,8. Daher ist der Aufbau einer solchen Plasmidbibliothek ein geschwindigkeitsbegrenzender Schritt bei der Erstellung einer genomweiten transgenen UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila. Vor kurzem haben wir dieses Problem erfolgreich gelöst, indem wir eine neuartige Methode entwickelt haben, die CRISPR-basierte modulare Anordnung (CRISPRmass)9. Der Kern von CRISPRmass besteht darin, die gemeinsam genutzten Vektorsequenzen einer Plasmidbibliothek durch eine Kombination aus Gen-Editing-Technologie und nahtloser Klonierungstechnologie zu manipulieren.
Hier stellen wir ein Protokoll für CRISPRmass vor, das massiv parallele zweistufige Reagenzglasreaktionen mit anschließender bakterieller Transformation umfasst. CRISPRmass ist eine einfache, schnelle, effiziente und kostengünstige Methode, die prinzipiell für den Hochdurchsatzaufbau verschiedener Plasmidbibliotheken eingesetzt werden kann.
CRISPRmass-Strategie Das Verfahren von CRISPRmass beginnt mit parallelen zweistufigen Reagenzglasreaktionen vor der Transformation von Escherichia coli (E. coli) (Abbildung 1). Schritt 1 ist die Spaltung der identischen Vektorrückgrate der cDNA/ORF-Plasmide durch Cas9/sgRNA. Eine ideale Spaltstelle befindet sich neben dem 5'-Ende der cDNA/ORF. Die Spaltprodukte müssen nicht gereinigt werden. Schritt 2 ist das Einfügen eines vektorspezifischen UAS-Moduls in die Cas9/sgRNA-linearisierten cDNA/ORF-Plasmide durch Gibson-Assemblierung (im Folgenden als Einzelschrittreaktion bezeichnet), was zu UAS-cDNA/ORF-Plasmiden führt. Die 5'- und 3'-terminalen Sequenzen eines UAS-Moduls überlappen sich mit denen der linearisierten cDNA/ORF-Plasmide, was die einstufige Reaktion ermöglicht.
Die einstufigen Reaktionsprodukte werden direkt der E. coli-Transformation unterzogen. Theoretisch können auf Luria-Bertani (LB)-Platten nur die gewünschten UAS-cDNA/ORF-Kolonien wachsen, die Selektionsantibiotika enthalten, die dem Antibiotikaresistenzgen des UAS-Moduls entsprechen. Das UAS-Modul besteht aus einem UAS-Kernmodul, einem Antibiotikaresistenzgen, das sich von dem der cDNA- oder ORF-Plasmide unterscheidet, und den 5'- und 3'-terminalen Sequenzen. Ein UAS-Kernmodul besteht aus 10 UAS-Kopien, einem Hsp70-Minimalpromotor, einer attB-Sequenz für die phiC31-vermittelte genomische Integration und einem Mini-White-Transformationsmarker für Drosophila7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum Cooling Block</td>
			<td>Aikbbio</td>
			<td>ADMK-0296</td>
			<td>To perform bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D2500</td>
			<td>To purify DNA from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>2500B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D6943</td>
			<td>To isolate plasmid DNA from bacterial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>Shanghai Zhichu&#160;</td>
			<td>ZQLY-180V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T series Multi-Block Thermal Cycler</td>
			<td>LongGene</td>
			<td>T20</td>
			<td>To perform PCR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans10 Chemically Competent Cell</td>
			<td>TranGen BioTech</td>
			<td>CD101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>BioSpec-nano</td>
			<td>To measure concentration of DNA or RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-based modular assembly for high-throughput construction of a uas-cdna/orf plasmid library

Das funktionelle Genomik-Screening bietet einen leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion und stützt sich auf den Aufbau genomweiter Plasmidbibliotheken. Herkömmliche Ansätze für den Aufbau von Plasmidbibliotheken sind zeitaufwändig und mühsam. Aus diesem Grund haben wir kürzlich eine einfache und effiziente Methode, die CRISPR-basierte modulare Assemblierung (CRISPRmass), für den Hochdurchsatzaufbau einer genomweiten Upstream-aktivierenden sequenzkomplementären DNA/Open Reading Frame (UAS-cDNA/ORF) Plasmidbibliothek entwickelt. Hier stellen wir ein Protokoll für CRISPRmass vor, am Beispiel des Aufbaus einer GAL4/UAS-basierten UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek. Das Protokoll umfasst massiv parallele zweistufige Reagenzglasreaktionen, gefolgt von einer bakteriellen Transformation. Der erste Schritt besteht darin, die vorhandenen komplementären DNA- (cDNA) oder Open Reading Frame (ORF)-cDNA- oder ORF-Bibliotheksplasmide zu linearisieren, indem die gemeinsam genutzten Upstream-Vektorsequenzen neben dem 5'-Ende von cDNAs oder ORFs unter Verwendung von CRISPR/Cas9 zusammen mit Single-Guide-RNA (sgRNA) geschnitten werden, und der zweite Schritt besteht darin, ein UAS-Modul in die linearisierten cDNA- oder ORF-Plasmide mit einer einstufigen Reaktion einzufügen. CRISPRmass ermöglicht den einfachen, schnellen, effizienten und kostengünstigen Aufbau verschiedener Plasmidbibliotheken. Die UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek kann für das Gain-of-Function-Screening in kultivierten Zellen und für den Aufbau einer genomweiten transgenen UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila verwendet werden.

Unbiased whole-genome genetic screening is a powerful approach for identifying genes involved in a given biological process and elucidating its mechanism. Therefore, it is widely used in various fields of biological research. Approximately 60% of Drosophila genes are conserved in humans1,2, and ~75% of human disease genes have homologs in Drosophila3. Genetic screening is mainly divided into two types: loss of function (LOF) and gain of function (GOF). LOF genetic screens in Drosophila have played a critical role in elucidating mechanisms that govern nearly every aspect of biology. However, the majority of Drosophila genes do not have obvious LOF phenotypes4, and therefore, GOF screening is an important method for studying the function of those genes4,5.
The binary GAL4/UAS system is commonly used for tissue-specific gene expression in Drosophila6. In this system, the tissue specifically expresses yeast transcription activator GAL4 that binds to the GAL4 responsive element (UAS) and thereby activates transcription of the downstream genetic components (e.g., cDNA and ORF)6. To perform genome-wide GOF screens in Drosophila, we need to construct a genome-wide UAS-cDNA/ORF plasmid library and, subsequently, a transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila.
Construction of a genome-wide UAS-cDNA/ORF plasmid library by conventional methods from publicly available cDNA/ORF clones is time-consuming and laborious, as every gene requires individualized designs, including primer design and synthesis, polymerase chain reaction (PCR), and gel purification, sequencing, restriction digestion, and so on7,8. Therefore, the construction of such a plasmid library is a rate-limiting step in creating a genome-wide transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila. Recently, we successfully solved this problem by developing a novel method, CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass)9. The core of CRISPRmass is to manipulate the shared vector sequences of a plasmid library through a combination of gene editing technology and seamless cloning technology.
Here, we present a protocol for CRISPRmass, which includes massively parallel two-step test tube reactions followed by bacterial transformation. CRISPRmass is a simple, fast, efficient, and cost-effective method that, in principle, can be used for high-throughput construction of various plasmid libraries.
CRISPRmass strategy 
The procedure of CRISPRmass starts with parallel two-step test tube reactions prior to Escherichia coli (E. coli) transformation (Figure 1). Step 1 is the cleavage of the identical vector backbones of the cDNA/ORF plasmids by Cas9/sgRNA. An ideal cleavage site is adjacent to the 5&#8242; end of cDNA/ORF. The cleavage products do not have to be purified. Step 2 is the insertion of a vector-specific UAS module into the Cas9/sgRNA linearized cDNA/ORF plasmids by Gibson assembly (hereafter referred to as single step reaction), resulting in UAS-cDNA/ORF plasmids. The 5&#8242; and 3&#8242; terminal sequences of a UAS module overlap with those of the linearized cDNA/ORF plasmids, enabling the single step reaction.
The single step reaction products are directly subjected to E. coli transformation. Theoretically, only the desired UAS-cDNA/ORF colonies can grow on Luria-Bertani (LB) plates that contain selection antibiotics corresponding to the antibiotic resistance gene of the UAS module. The UAS module is composed of a core UAS module, an antibiotic resistance gene distinct from that of cDNA or ORF plasmids, and the 5&#8242; and 3&#8242; terminal sequences. A core UAS module comprises 10 copies of UAS, an Hsp70 minimal promoter, an attB sequence for phiC31-mediated genomic integration, and a mini-white transformation marker for Drosophila7.

Autor im Rampenlicht: Vereinfachung des aufbaus genomweiter Plasmidbibliotheken mit CRISPRmass

CRISPR-basierter modularer Aufbau für den Hochdurchsatzaufbau einer UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek

Functional genomic screening offers a powerful approach to probe gene function, and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. Conventional approaches for plasmid library construction are time-consuming and laborious. To address this question, we develop a simple and efficient method, CRISPR-based modular assembly, or CRISPRmass.Through cleavage of shared vector sequences of cDNA or ORF plasmid by CRISPR/Cas9 and subsequent insertion of UAS modules by adjacent assembly, the procedure of construction of a genome-wide plasmid library by CRISPRmass is standardized as massively parallel two-step test tube reactions before bacterial transformation. CRISPRmass allows the simple, fast, efficient, and cost-effective construction of various plasmid libraries. It can also be applied to editing various genome-wide plasmid libraries in general, and it's an alternative to gateway technology in high-throughput plasmid library editing, paving the way for the global studies of biological networks.

Wir haben CRISPRmass eingesetzt, um eine genomweite UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek unter Verwendung von 3402 cDNA/ORF-Klonen mit pOT2-Vektorrückgrat aus der DGRC Gold Collection zu generieren. Wir analysierten nach dem Zufallsprinzip nur eine Kolonie für jedes UAS-cDNA/ORF-Konstrukt, und die anschließende Restriktionsanalyse mit PstI zeigte, dass 98,6% der UAS-cDNA/ORF-Konstrukte erfolgreich erzeugt wurden9. Die Begründung für die Verwendung von PstI für die Restriktionsanalyse von UAS-cDNA/...

Wir stellen ein Protokoll für die CRISPR-basierte modulare Assemblierung (CRISPRmass) vor, eine Methode zum Hochdurchsatzaufbau von UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliotheken in Drosophila unter Verwendung öffentlich verfügbarer cDNA/ORF-Ressourcen. CRISPRmass kann zur Bearbeitung verschiedener Plasmidbibliotheken eingesetzt werden.

Functional genomics screening offers a powerful approach to probe gene function and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. ...

Das funktionelle genomische Screening bietet einen leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion und beruht auf dem Aufbau genomweiter Plasmidbibliotheken. Herkömmliche Ansätze für den Aufbau von Plasmidbibliotheken sind zeitaufwändig und mühsam. Um diese Frage zu beantworten, entwickeln wir eine einfache und effiziente Methode, die CRISPR-basierte modulare Baugruppe, kurz CRISPRmass.Durch die Spaltung gemeinsamer Vektorsequenzen von cDNA- oder ORF-Plasmid durch CRISPR/Cas9 und die anschließende Insertion von UAS-Modulen durch benachbarte Assemblierung wird das Verfahren zum Aufbau einer genomweiten Plasmidbibliothek mittels CRISPRmass als massiv parallele zweistufige Reagenzglasreaktionen vor der bakteriellen Transformation standardisiert. CRISPRmass ermöglicht den einfachen, schnellen, effizienten und kostengünstigen Aufbau verschiedener Plasmidbibliotheken. Es kann auch zur Bearbeitung verschiedener genomweiter Plasmidbibliotheken im Allgemeinen angewendet werden, und es ist eine Alternative zur Gateway-Technologie bei der Bearbeitung von Hochdurchsatz-Plasmidbibliotheken, die den Weg für die globale Erforschung biologischer Netzwerke ebnet.

crispr-based-modular-assembly-for-high-throughput-construction-uas

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR-Based Modular Assembly for High-Throughput Construction of a UAS-cDNA/ORF Plasmid Library

500 Aufrufe.  University of South China. Das funktionelle genomische Screening bietet einen leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion und beruht auf dem Aufbau genomweiter Plasmidbibliotheken. Herkömmliche Ansätze für den Aufbau von Plasmidbibliotheken sind zeitaufwändig und mühsam. Um diese Frage zu beantworten, entwickeln wir eine einfache und effiziente Methode, die CRISPR-basierte modulare Baugruppe, kurz CRISPRmass.Durch die Spaltung gemeinsamer Vektorsequenzen von cDNA- oder ORF-Plasmid durch CRISPR/...

Serie: Autor im Rampenlicht: Vereinfachung des aufbaus genomweiter Plasmidbibliotheken mit CRISPRmass

Functional genomics screening offers a powerful approach to probe gene function and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. Conventional approaches for plasmid library construction are time-consuming and laborious. Therefore, we recently developed a simple and efficient method, CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass), for high-throughput construction of a genome-wide upstream activating sequence-complementary DNA/open reading frame (UAS-cDNA/ORF) plasmid library. Here, we present a protocol for CRISPRmass, taking as an example the construction of a GAL4/UAS-based UAS-cDNA/ORF plasmid library. The protocol includes massively parallel two-step test tube reactions followed by bacterial transformation. The first step is to linearize the existing complementary DNA (cDNA) or open reading frame (ORF) cDNA or ORF library plasmids by cutting the shared upstream vector sequences adjacent to the 5&#39; end of cDNAs or ORFs using CRISPR/Cas9 together with single guide RNA (sgRNA), and the second step is to insert a UAS module into the linearized cDNA or ORF plasmids using a single step reaction. CRISPRmass allows the simple, fast, efficient, and cost-effective construction of various plasmid libraries. The UAS-cDNA/ORF plasmid library can be utilized for gain-of-function screening in cultured cells and for constructing a genome-wide transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila.&#160;

We present a protocol for CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass), a method for high-throughput construction of UAS-cDNA/ORF plasmid library in Drosophila using publicly available cDNA/ORF resources. CRISPRmass can be applied to editing various plasmid libraries.

Forschung

Genetik

Large-Scale Construction of UAS-cDNA/ORF Plasmids by CRISPR-Based Modular Assembly (CRISPRmass)

Großmaßstabsgetreue Konstruktion von UAS-cDNA/ORF-Plasmiden durch CRISPR-basierte modulare Anordnung (CRISPRmass)

Large-Scale Transformation of UAS-cDNA/ORF Plasmids from CRISPR-Based Modular Assembly into E. coli

To transform the UAS cDNA/ORF plasmids products obtained from the CRISPR based modular assembly into Escherichia coli, pre-chill 10 microliter tips at four degrees Celsius. Also, pre-chill 1.5 milliliter tubes in an aluminum cooling block on ice. After thawing competent E.coli cells on ice for five minutes, add an aliquot of 10 microliters of the cells to each pre-chilled 1.5-milliliter tube.Then add one microliter of the UAS cDNA/ORF plasmid products to each tube containing 10 microliters of competent cells. Swirl the tube gently to mix and place it on ice for 30 minutes. Incubate the tubes at 42 degrees Celsius in a water bath for one minute.Then immediately chill on ice for two minutes. Add 100 microliters of SOC medium, prewarmed to 37 degrees Celsius, to each tube at room temperature and incubate the tubes in a shaking incubator at 250 RPM and 37 degrees Celsius for one hour. Next, warm the LB plates containing an antibiotic corresponding to the UAS module's antibiotic resistance gene to 37 degrees Celsius.Spread the cells onto the warm plates and incubate them at 37 degrees Celsius overnight.