Die NSW Health Statewide Biobank dankt der NSW Health Pathology, dem NSW Office for Health and Medical Research und dem Sydney Local Health District. Darüber hinaus danken die Autoren Omico und anderen Forschungsstudien, die von der NSW Health Statewide Biobank unterstützt wurden, für die Erlaubnis, intern generierte Daten zu veröffentlichen und ungenutzte Exemplare für Forschungszwecke zu verwenden. Die Autoren danken Professor Jennifer Bryne (NSW Health Pathology, University of Sydney) für die kritische Führung und die Diskussionen. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

Blutproben für die Qualitätskontrolle und intern generierte Daten (wie Zellzahl, Lebensfähigkeit und Alter der Probe bei der Verarbeitung) wurden aus genehmigten Forschungsstudien in der NSW Health Statewide Biobank des Royal Prince Alfred Hospital gewonnen (HREC-Zulassung: 2019/ETH06776). Verarbeitete (d. h. plasmaarme), nicht gescreente und anonymisierte adulte menschliche Blutproben wurden in EDTA-Röhrchen entnommen. Diese Blutproben zur Qualitätskontrolle wurden weniger als 72 Stunden nach der Entnahme verarbeitet und für PBMC-Isolierungsexperimente verwendet, bei denen der Dichtegradient und die auf Kügelchen basierenden Methoden verglichen wurden. Für die Methode zur Trennung des Dichtegradienten, die in den repräsentativen Ergebnissen verwendet wird, siehe das Verfahren in der Zusatzdatei 1. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und den für diese Studie verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vollblut-Präparat
<ol><li>10 ml Vollblutröhrchen (beschichtet mit Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA], Säurecitrat-Dextrose [ACD] oder Lithiumheparin) 10 Mal bei Raumtemperatur vorsichtig invertieren.</li>
	<li>Optional: Wenn Vollblut gelagert werden soll, aliquotiert in Kryoröhrchen für eine Lagerung von -80 °C.</li>
	<li>Die Röhrchen mit einem Schwingrotor bei 800 x g für 10 min bei 22 °C bei eingeschalteter Bremse zentrifugieren (9 Beschleunigung/ 9 Verzögerung).</li>
</ol>2. Buffy-Mantel-Kollektion
<ol><li>Legen Sie die Proben nach der Zentrifugation in eine biologische Sicherheitswerkbank und prüfen Sie, ob die drei verschiedenen Schichten vorhanden sind (wie in Abbildung 1 gezeigt). HINWEIS: Erythrozyten befinden sich in der unteren dunkelroten Schicht des Zentrifugenröhrchens. Über der Erythrozytenschicht befindet sich eine weiße, undurchsichtige Schicht mit weißen Blutkörperchen und Blutplättchen, die als Buffy Coat bekannt ist. Die oberste gelbe Schicht enthält Plasma.</li>
	<li>Optional: Wenn Plasma gelagert werden soll, aliquotes Plasma in Kryoröhrchen für eine Lagerung von -80 °C.</li>
	<li>1 ml Buffy Coat (Ausgangsmaterial) aus einem 10-ml-Blutröhrchen pipettieren und in das in Schritt 3.1 und Schritt 4.1 für die manuelle bzw. automatisierte Methode angegebene und beschriftete Röhrchen überführen. Den Buffy Coat (weiße, undurchsichtige Schicht) mit der Pipettenspitze schwenken und den Buffy Coat durch Ansaugen auffangen. HINWEIS: Weniger als 100 μl Plasma und Erythrozyten sind während der Aspiration akzeptabel. Wenn für einen Teilnehmer mehrere Blutröhrchen entnommen werden, können Buffy-Mäntel gepoolt werden; Dies kann jedoch die Thrombozytenkonzentration beeinflussen13.</li>
	<li>Für die manuelle Verarbeitung fahren Sie mit Abschnitt 3 fort. Für die automatisierte Verarbeitung fahren Sie mit Abschnitt 4 fort.</li>
	<li>Optional: Wenn Erythrozyten gelagert werden sollen, aliquotieren Sie die Erythrozyten in Kryoröhrchen für eine Lagerung von -80 °C.</li>
</ol>3. PBMC-Reinigung - Manuelle Methode
HINWEIS: Bis zu 8 Proben pro Magnethalter können von einem einzigen Bediener verarbeitet werden.
<ol><li>Beschriften Sie 3 x 5 mL Polystyrolröhrchen mit den Buchstaben A-C. HINWEIS: Verwenden Sie die fortlaufende Nummerierung, wenn Sie mehr als eine Stichprobe durchführen, z. B. 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.</li>
	<li>60 μl 0,1 M EDTA (für eine endgültige EDTA-Konzentration von 6 mM, pH 8,0, siehe Zusatzdatei 2 für das Rezept) in das Röhrchen A geben, das den in Schritt 2.3 übertragenen Buffy Coat enthält.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl des Cocktail-Mix-Röhrchens (siehe Materialtabelle) in das Röhrchen A, mischen Sie, indem Sie es mindestens 3 Mal auf und ab pipettieren und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Geben Sie 890 μl PBS in das Röhrchen A und mischen Sie, indem Sie es mindestens 3 Mal auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Wirbeln Sie das magnetische Bead-Rohr (siehe Materialtabelle) 30 s lang vortexen.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl der magnetischen Kügelchen in das Röhrchen A und mischen Sie, indem Sie mindestens 3 Mal auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Röhrchen A sofort in das Magnetstativ setzen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Pipettieren Sie die angereicherte Zellsuspension vorsichtig in das Röhrchen B und sammeln Sie die klare Fraktion mit keinen/minimalen (<100 μl) Erythrozyten für eine optimale PBMC-Rückgewinnung. HINWEIS: Stören Sie nicht die am Magneten gebundenen Perlen. Eine Transferpipette wird empfohlen.</li>
	<li>Nehmen Sie das Rohr A vom Magnetständer und entsorgen Sie es.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl magnetische Kügelchen in die Zellsuspension in Röhrchen B und mischen Sie, indem Sie mindestens 3 Mal auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Röhrchen B sofort in das Magnetstativ setzen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Pipettieren Sie die angereicherte Zellsuspension vorsichtig in das Röhrchen C und sammeln Sie nur die klare Fraktion. HINWEIS: Stören Sie nicht die am Magneten gebundenen Perlen. Eine Transferpipette wird empfohlen.</li>
	<li>Nehmen Sie das Rohr B vom Magnetständer und entsorgen Sie es.</li>
	<li>Röhrchen C sofort in das Magnetstativ setzen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Pipettieren Sie die angereicherte Zellsuspension vorsichtig in ein markiertes Zentrifugenröhrchen und füllen Sie es mit PBS auf 2 mL auf.</li>
	<li>Übertragen Sie 50 μl der Zellsuspension in einen Probenbecher des automatisierten Zellzählers. Für eine Verdünnungszellzahl von 1:10 fügen Sie 450 μl PBS hinzu. Fahren Sie mit Abschnitt 5 für die Schritte zur Zellzählung fort.</li>
</ol>4. PBMC-Aufreinigung - Automatisiertes Verfahren
HINWEIS: Bis zu 4 Proben können mit einem einzigen automatisierten PBMC-Gerät verarbeitet werden. Mehrere Geräte können von einem einzigen Bediener parallel betrieben werden.
<ol><li>Beschriften Sie 2 x 14 mL Röhrchen mit den Buchstaben A und B, 1 x 50 mL Zentrifugenröhrchen mit Buchstabe C und 1 x 50 mL Zentrifugenröhrchen mit "Abfall". HINWEIS: Für jeden Lauf auf dem automatisierten PBMC-Gerät ist nur ein Abfallbehälter erforderlich. Verwenden Sie die fortlaufende Nummerierung, wenn Sie mehr als eine Stichprobe durchführen, z. B. 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.</li>
	<li>60 μl 0,1 M EDTA (für eine EDTA-Endkonzentration von 6 mM) in das Röhrchen A geben, das den in Schritt 2.3 übertragenen Buffy Coat enthält.</li>
	<li>Wirbeln Sie das magnetische Bead-Rohr (siehe Materialtabelle)  30 s lang vortexen.</li>
	<li>Schalten Sie das automatische PBMC-Gerät ein, indem Sie es an der Vorderseite des Geräts einschalten.</li>
	<li>Wählen Sie auf dem Startbildschirm des automatisierten PBMC-Geräts das Profil und dann das gewünschte Protokoll aus. HINWEIS: EasySep Direct Human PBMC isolation 19654 - buffy coat war das Protokollprofil, das für diese PBMC-Isolierung ausgewählt wurde. Siehe das Standardverfahren des Herstellers für dieses Profil im Protokollbericht14.</li>
	<li>Geben Sie das Ausgangsvolumen (die Menge des Buffy Coat, die in Röhrchen A angesaugt wird) ein und wiederholen Sie den Vorgang für jede Probe.</li>
	<li>Wählen Sie alle Quadranten aus, für die dasselbe Reagenzienkit verwendet werden soll. HINWEIS: Wenn dasselbe Protokoll für mehr als einen Quadranten verwendet wird, schlägt das automatisierte PBMC-Gerät vor, dasselbe Reagenzienkit für alle Quadranten14 zu verwenden.</li>
	<li>Beladen Sie das Karussell des Instruments mit beschrifteten Verbrauchsmaterialien, Filterspitzen und Pufferbehältern. Das Reagenzienkit, das das magnetische Bead-Röhrchen und das Cocktail-Mix-Röhrchen enthält, ist in Quadrant 1 zu laden. HINWEIS: Das Gerät fragt den Benutzer, ob er 1 Reagenzienkit für alle Quadranten verwenden möchte. Wählen Sie "Ja" und markieren Sie alle Quadranten mit dem Reagenzienkit.</li>
	<li>Sobald der Ladevorgang abgeschlossen ist, entfernen Sie die Deckel von Verbrauchsmaterialien und Reagenzien und wählen Sie auf dem Gerätebildschirm die Option Ausführen.</li>
	<li>Wenn der Lauf abgeschlossen ist, wählen Sie Entladen und entnehmen Sie Proben (die PBMC-Suspension enthalten, die in Röhrchen C gekennzeichnet sind) aus dem Karussell des Geräts. Lagern Sie das magnetische Bead-Röhrchen, das Cocktail-Mix-Röhrchen und den Pufferbehälter bei 4 °C. Entsorgen Sie die mit A, B gekennzeichneten Röhrchen und Abfall (siehe Schritt 4.1) und Filterspitzen. HINWEIS: Für die automatisierte Methode ist keine Nachfüllung mit PBS erforderlich, da die PBMC-Suspension ein Endvolumen von 7 ml erzeugt.</li>
	<li>Übertragen Sie 500 μl der Zellen in einen Probenbecher, um eine Zellzählung ohne Verdünnung zu erhalten. Fahren Sie mit Abschnitt 5 für die Zellzählung fort.</li>
</ol>5. Zellzählung
<ol><li>Führen Sie die Zellzählung und -viabilität mit der Methode zum Ausschluss von Trypanblau-Farbstoffen gemäß den Anweisungen des Herstellersdurch 15. HINWEIS: Für die internen Prozesse des Autors wird die Zellanalyse mit einem automatisierten Zellzähler mit den folgenden Einstellungen durchgeführt, um die PBMCs zu erfassen. Verdünnungsfaktor = 10 (für manuelles Protokoll, wenn die Zellsuspension in einem geringen Volumen vorliegt) oder 1 (für automatisiertes Protokoll) Zelltyp: PBMC Konzentrationsbereich = 5 x 104 bis 1 x 107 Zellen/ml Größenbereich (Durchmesser) = 8 μm bis 50 μm Anzahl der Bilder = 50</li>
</ol>6. Vorbereitung der Kryokonservierung
<ol><li>Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen (mit einem schwingenden Schaufelrotor) bei 300 x g für 8 min bei 22 °C bei eingeschalteter Bremse (9 Beschleunigung/ 9 Verzögerung).</li>
	<li>Legen Sie die Proben nach der Zentrifugation wieder in die biologische Sicherheitswerkbank.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Eine kleine Menge Überstand kann mit dem PBMC-Pellet belassen werden, um sicherzustellen, dass es nicht gestört wird.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 3 mL kaltem Kryokonservierungsmedium. Mischen Sie die Suspension langsam und sanft auf und ab, bis eine homogene Masse entsteht. HINWEIS: Das Volumen des Cyrokonservierungsmediums kann auf der Grundlage der gewünschten PBMC-Endkonzentration angepasst werden.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml des resuspendierten PBMC in ein vorab zugewiesenes Kryoröhrchen und legen Sie es für mindestens 4 Stunden bei -80 °C in einen Gefrierbehälter mit Kontrollrate. HINWEIS: Das Volumen der PBMCs, die auf jedes Kryoröhrchen aliquotiert sind, kann je nach Präferenz des Untersuchers angepasst werden.</li>
	<li>Nachdem Sie Kryoröhrchen mindestens 4 Stunden lang bei -80 °C gelagert haben, übertragen Sie die Kryoröhrchen zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstoffdampfphasentank.</li>
</ol>7. Statistische Datenanalyse
<ol><li>Repräsentative Ergebnisdaten wurden mit Hilfe von Statistik- und Grafiksoftware analysiert, wie in der Zusatzdatei 3 angegeben.</li>
</ol>

Hochdurchsatz-PBMC-Isolierung mit immunomagnetischen Beads

<ol>
	<li>Alexovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+mononuclear+cells:+A+review+of+recent+proteomic+applications.">Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications.</a> Proteomics. 22 (15-16), e2200026 (2022).</li><li>Zhang, M., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multi-differentiation+potential+of+peripheral+blood+mononuclear+cells.">The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48 (2012).</li><li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+(PBMC)+by+density+gradient+centrifugation+on+percoll.">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li><li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).</li><li>Gautam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+gene+expression+profiles+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+multiple+collection+and+processing+methods.">Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods.</a> PLoS One. 14 (12), e0225137 (2019).</li><li>Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+validation+for+automated+isolation+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells.</a> Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).</li><li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+biobanking+using+a+robotized+liquid+handling+workstation.">Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation.</a> J Transl Med. 17 (1), 371 (2019).</li><li>Stemcell Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 27156, (2020).</li><li>Hornschuh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+magnetic+sorting+preserves+the+functionality+of+ex+vivo+cultivated+non-adherent+human+monocytes.">Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes.</a> Biology (Basel). 11 (11), 1583 (2022).</li><li>Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+isolated+by+positive+and+negative+magnetic+sorting+techniques+show+different+molecular+characteristics+and+immunophenotypic+behaviour.">Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour.</a> F1000Res. 6, 2045 (2017).</li><li>Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+processing+for+pathogen+inactivation+of+double-dose+buffy-coat+platelet+concentrates:+Maintained+in+vitro+quality+over+7-day+storage.">Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage.</a> Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).</li><li>Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology, white blood cell. , (2024).</li><li>Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+buffy+coat+extract+on:+Methodology,+feasibility,+optimization,+and+validation+study.">Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study.</a> Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).</li><li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield,+but+severly+compromise+cell+viability.">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li><li>Yi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+delayed+PBMC+processing+on+functional+and+genomic+assays.">Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays.</a> J Immunol Methods. 519, 113514 (2023).</li><li>Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. 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J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+(PBMC)+functional+applications.">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Humane PBMCs sind vielseitige Zelltypen, die für zahlreiche Assays verwendet werden. Der Isolationsdurchsatz ist jedoch in vielen Laboratorien, einschließlich Biobanken, oft eine Einschränkung16. Zuvor hatte die NSW Health Statewide Biobank PBMCs mit der Dichtegradientenmethode isoliert. Die Automatisierung der Methode zur Trennung von Dichtegradienten zur Erhöhung der Verarbeitungskapazität wurde untersucht, aber es wurden Hindernisse für die Implementierung identifiziert, einschließlich (i) der Kosten für einen vollständig zu automatisierenden Liquid-Handler mit einer Zentrifugationseinheit, mit der zusätzlichen Anforderung einer HEPA-Einheit zur Herstellung eines sterilen Produkts, (ii) geschultem Personal für die Programmierung und (iii) Zeitaufwand für Protokolltests. Daher wurden in dieser Studie alternative Methoden untersucht und das kommerziell erhältliche humane PBMC-Kit identifiziert, das für die manuelle und automatisierte Verarbeitung verwendet werden könnte. Die Sterilität ist gewährleistet, da die für die Verarbeitung erforderliche Ausrüstung in eine Standard-biologische Sicherheitswerkbank (Länge 1,2 m) passt. In diesem Dokument werden Änderungen an dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll14 beschrieben, um die Effizienz zu steigern und die Reagenzienkosten zu senken, ohne die Qualität zu beeinträchtigen. Darüber hinaus wurde das Protokoll des Herstellers erweitert, um detaillierte Schritte zu Biobank-Proben für zukünftige Forschungen zu beschreiben, einschließlich Vollblut (Schritt 1.2), Plasma (Schritt 2.2) und Erythrozyten (Schritt 2.5), die aus dem ursprünglichen Blutröhrchen aliquotiert werden, sowie Zellzählung und Kryokonservierung.
In dieser Studie wurden drei PBMC-Isolationsprotokolle verglichen: Dichtegradiententrennung, manuelle und automatisierte Bead-basierte Isolierung. Es wurden Änderungen am manuellen Bead-basierten Protokoll des Herstellers vorgenommen, einschließlich der Entfernung der Buffy-Coat-Verdünnung vor der PBMC-Isolierung und der Eliminierung der Notwendigkeit eines Break-Offs für Zentrifugen, so dass die Prüfärzte einem anpassungsfähigen, kostengünstigen PBMC-Isolationsprotokoll mit hohem Durchsatz folgen können. Zunächst wurden acht übereinstimmende Vollblutproben verwendet, um PBMCs zu isolieren und die Dichtegradiententrennung und die manuelle Bead-basierte Technik zu vergleichen. Wichtig ist, dass sich die Verteilung der Zellpopulation, die Zellviabilität und die Wiederfindung von PBMCs zwischen den beiden verglichenen Methoden nicht signifikant unterschieden, wie in Abbildung 2A-F, Abbildung 3A bzw. ergänzender Abbildung 1 gezeigt. In den repräsentativen Daten waren die Zellzahlen für die Dichtegradienten-Trennmethode unter Verwendung der Trypanblau-Ausschlussmethode höher, nicht jedoch bei Verwendung eines hämatologischen Zellanalysators. Die PBMC-Zelltypeinstellungen auf dem Zellzähler verwendeten einen Zelldurchmesserbereich von 8 bis 50 μm, und daher umfassen die Zählungen sowohl PBMCs als auch Granulozyten (ungefähr 12 bis 15 μm im Durchmesser), wenn die Trypanblau-Ausschlussmethode17 verwendet wird. Während der hämatologische Zellzähler eine höhere Spezifität aufwies als die Trypanblau-Ausschlussmethode, lagen einige Wiederfindungsberechnungen über 100 %, was die Fehlermarge des Instruments widerspiegelt (siehe Ergänzende Abbildung 1). Es wird daher empfohlen, dass die Forscher beim Vergleich der Ausbeuten aus PBMC-Isolationsprotokollen eine Kombination von Zellzähltechniken anwenden, da die meisten Techniken nicht sowohl spezifische als auch hochempfindliche differentielle Zellzählungen bieten. Darüber hinaus wurden keine Assays durchgeführt, um die funktionelle Aktivität von PBMCs zu vergleichen, die mit einer der beiden Techniken erzielt wurden, was eine Einschränkung unserer Analyse darstellt.
Als nächstes wurden die manuellen und automatisierten Bead-basierten Methoden verglichen, und es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen PBMC-Ausbeute oder Lebensfähigkeit aus 8 übereinstimmenden Proben festgestellt (Abbildung 4A,B). Die Zellpopulationen wurden nicht einzeln verglichen, da für beide Methoden der gleiche Antikörper-Isolierungscocktail verwendet wurde. Wichtig ist, dass die Hands-on-Zeit für die Verarbeitung von 8 Proben mit dem automatisierten Protokoll von 43 Minuten auf 22 Minuten reduziert wurde (Abbildung 4C). Während der Durchsatz, die Vermeidung von Burnout durch den Techniker und die Konsistenz der Probenverarbeitung durch Automatisierung sichergestellt werden, sind die Kosten für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien mit dem 3- bis 4-fachen höher als bei der manuellen Bead-basierten Methode. Dies geschieht nach Änderungen am Protokoll des Herstellers, um 1 ml Buffy Coat (ab einem Vollblutvolumen von 10 ml) anstelle des empfohlenen Bereichs von 2-5 ml (ab einem Vollblutvolumen von 10 ml und/oder mehr) zu verwenden. Wenn das Budget begrenzt ist, kann die Entscheidung für die manuelle Methode die Verarbeitungszeit um ~25 % verkürzen und gleichzeitig die Kosten für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien beibehalten, die mit denen der Dichtetrennmethode vergleichbar sind. Es wird empfohlen, nicht mehr als 8 Proben gleichzeitig pro Techniker zu verarbeiten, um eine angemessene Staffelung der Proben (~30 s/Probe) innerhalb der 5-minütigen Inkubationszeiten (Schritte 3.7, 3.11 und 3.14) zu gewährleisten.
Sowohl bei den manuellen als auch bei den automatisierten Bead-basierten Methoden ist die Entfernung des Buffy-Coats ein entscheidender Schritt, um eine optimale PBMC-Isolierung zu gewährleisten. Es ist wichtig zu beachten, dass in diesem Protokoll ein Buffy Coat anstelle von Vollblut verwendet wird, da das Volumen der Reagenzien auf dem AusgangsmaterialVolumen 10 basiert. Das gesamte Volumen des Buffy-Fells effektiv zu entfernen, kann eine technische Herausforderung sein. Ursprünglich wurde bei dieser Methode 0,5 ml Buffy Coat entfernt, die jedoch auf 1 ml erhöht wurde, um die Regeneration zu verbessern. Um eine angemessene und konsistente Wiederherstellung des Buffy Coat zu gewährleisten, ist es wichtig, diesen Prozess in der Protokolldokumentation und Schulung detailliert zu beschreiben. Es wird empfohlen, eine Pipettenspitze beim Ansaugen des Buffy Coats zu schwenken und dabei darauf zu achten, nicht zu viele Erythrozyten aus der darunter liegenden Schicht abzusaugen (Schritt 2.3). Es ist wichtig, den Antikörpercocktail, der unerwünschte Zellen (d. h. Granulozyten und rote Blutkörperchen) bindet, nicht zu sättigen, was sich auf die Ausbeute und Reinheit auswirken kann10. Um die bei der Extraktion des Buffy Coats angesammelten Erythrozyten zu minimieren, sollte sich die Pipettenspitze zwischen der Plasma- und der Buffy-Coat-Schicht befinden. Das Volumen des Buffy Coats kann ab 1 mL erhöht werden; Es muss jedoch darauf geachtet werden, dass nicht mehr als 10 % des gesammelten Volumens Erythrozyten enthalten. Alternativ kann ein automatisierter Liquid Handler verwendet werden, um Buffy Coats konsistent zu sammeln18. Die für die Kalibrierung und Fehlerbehebung von Liquid-Handling-Instrumentenprotokollen erforderlichen Stunden sind jedoch für die meisten Labore möglicherweise nicht durchführbar, insbesondere angesichts der Kosten.
Die Umstellung und Anwendung des auf Automatisierungsbeads basierenden Protokolls war angesichts des Ziels der NSW Health Statewide Biobank, in den nächsten 3 Jahren 23.000 PBMCs zu verarbeiten, von entscheidender Bedeutung. Hier wurde gezeigt, dass PBMCs bis zu 9 Tage nach der Entnahme aus ACD-Röhrchen isoliert werden können, mit einer durchschnittlichen Viabilität von >70%. Während die Ausbeute 24 Stunden nach der Entnahme optimal war, ist eine Verarbeitung innerhalb dieses Zeitrahmens nicht immer möglich, da möglicherweise Proben transportiert werden müssen. Es wurde gezeigt, dass PBMCs, die entweder mit der manuellen oder der automatisierten Bead-basierten Methode isoliert wurden, Ausbeuten von >3 x 105 Zellen/ml Vollblut aufweisen können, wenn sie innerhalb von 4 Tagen nach der Entnahme isoliert werden, und >1 x 105 Zellen/ml Vollblut, wenn sie innerhalb von 10 Tagen nach der Entnahme isoliert werden. Niedrige Zahlen für Proben über 5 Tage werden als Einschränkung dieser Analyse angegeben. Darüber hinaus wurden die Daten nicht nach Alter, Geschlecht und klinischer Anamnese der Teilnehmer getrennt, da diese Informationen nicht zur Verfügung gestellt wurden. Obwohl eine vergleichende Analyse erforderlich ist, um die Auswirkungen von Verzögerungen in den Verarbeitungszeiten für beide Methoden zu untersuchen, wurde bereits berichtet, dass Verzögerungen bei der PBMC-Isolierung mit der Dichtegradientenmethode die Zellqualität verringern und die Erythrozytenkontamination signifikant erhöhen19,20. Darüber hinaus nehmen die Granulozytenanteile zu, wenn die Verarbeitung verzögert wird, und daher sollten Proben ähnlichen "Alters" für nachgelagerte Analysen gruppiert werden 20,21,22. Bemerkenswert ist, dass dieses Experiment unter Verwendung von Blut durchgeführt wurde, das mit saurer Zitronendextrose (d. h. Trinatriumcitrat, Zitronensäure und Dextrose) antikoaguliert wurde. Die Ausbeute und/oder der Anteil der Zelltypen können jedoch variieren, wenn andere Antikoagulanzien verwendet werden23; Daher wird den Prüfärzten empfohlen, ein geeignetes Antikoagulans auf der Grundlage der vorgesehenen nachgeschalteten PBMC-Analysen auszuwählen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein Protokoll für die PBMC-Isolierung mit magnetischen Beads, das an Arbeitsabläufe mit hohem Durchsatz angepasst werden kann, detailliert beschrieben wird, um die Anforderungen an die Skalierung zu erfüllen, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Sowohl die manuelle als auch die automatisierte Methode können optimiert werden, um durch Änderung des Start- und Resuspensionsvolumens spezifische Zellkonzentrationen zu erzeugen. Die NSW Health Statewide Biobank ist von der Extraktion von ~60 PBMCs pro Monat mit der traditionellen Dichtegradiententrenntechnik auf ~300 PBMCs pro Monat mit dieser automatisierungskompatiblen, beadbasierten Methode umgestiegen. Das nächste Ziel der Autoren ist es, die automatisierte Plattform zu nutzen, um bis zu 1200 PBMCs pro Monat zu verarbeiten und PBMCs, die sowohl durch magnetische Bead-basierte (manuelle und automatisierte) als auch durch Dichtegradiententechniken isoliert wurden, weiter zu vergleichen, um die Implementierung dieser Technik in anderen Labors mit besonderem Schwerpunkt auf Biobanken zu leiten.

Die Isolierung mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) ist eine Technik, bei der Lymphozyten und Monozyten von anderen Vollblutbestandteilen getrennt und isoliert werden. PBMCs sind ein vielseitiger Zelltyp, der für zahlreiche Anwendungen eingesetzt wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Immuntherapien, Impfstoffentwicklung, Ziel- oder Biomarker-Identifizierung und Entwicklung von Antikörpern/niedermolekularen Medikamenten 1,2. Diese Zellen können von gesunden oder kranken Personen isoliert und sofort in nachgelagerten Prozessen verwendet oder für zukünftige Forschungen kryokonserviert werden3. In einigen Fällen ist der nachgelagerte Zweck bekannt, während in anderen, wie im Biobanking üblich, PBMCs isoliert und für zukünftige nicht näher spezifizierte Anwendungen gelagertwerden 4.
Die Dichtegradientenzentrifugation ist die traditionelle Technik zur Isolierung der PBMCs 5,6,7 aus Vollblut, wobei die differentielle Trennung der konstituierenden Zelltypen basierend auf der Zelldichte während der Zentrifugation genutzt wird. Obwohl es bei dieser Methode einige Unterschiede geben kann, wird Vollblut im Allgemeinen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt, über ein Dichtegradientenmedium in einem speziellen oder Standardzentrifugenröhrchen geschichtet und dann geschleudert. Es ergeben sich vier unterschiedliche Schichten: Die obere Plasmaschicht ist mit Blutplättchen angereichert, eine dünne PBMC-Schicht befindet sich über dem Dichtegradientenmedium und die untere Schicht schließlich besteht aus roten Blutkörperchen (RBCs) und Granulozyten. Obwohl diese Methode früher als "Goldstandard"8 bezeichnet wurde, gibt es Einschränkungen für das Scale-up, wie z. B. lange Verarbeitungszeit, Zentrifugenkapazität, Schwierigkeiten bei der Aliquotierung anderer Blutprodukte (d. h. Plasma und Erythrozyten) und die mühsame Automatisierung. Obwohl eine Automatisierung für dieses Verfahren9 möglich ist, erfordert es eine umfassende Programmierung eines Liquid Handlers (mit einem Zentrifugationsmodul, das vollständig automatisiert werden soll) und würde ein langwieriger Prozess bleiben.
Von nun an wird ein alternativer Arbeitsablauf vorgestellt, der die immunomagnetische Bead-Trennung entweder mit einem Acht-Halter-Magneten für die manuelle Verarbeitung oder einem Instrument für die vollautomatische Verarbeitung verwendet. Bei dieser Methode wird ein Antikörper-Cocktail verwendet, der den Zellen zugesetzt wird und unerwünschte Zellpopulationen, in diesem Fall Blutplättchen, Granulozyten und Erythrozyten, bindet. Diese unerwünschten Populationen werden anschließend durch magnetische Trennung entfernt, so dass Monozyten- und Lymphozytenpopulationen in der negativen Fraktion verbleiben, die für die nachgelagerte Verarbeitung bereit sind10. Diese Methode der negativen Selektion ist schneller als die Methode der positiven Selektion, die zusätzliche Schritte erfordert, um den Antikörper und den magnetischen Bead-Komplex aus den PBMCs zu entfernen. Die negative Selektion ist zusätzlich vorteilhaft, da sie als eine Möglichkeit zur Erhaltung der Zellfunktionalität beschrieben wurde11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell cryopreservation media CS10, 100 mL (CRYOSTOR)</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>51033311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell 1 mL FX</td>
			<td>BioTools</td>
			<td>BCS-407P</td>
			<td>This is the control rate freezing container used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water&#160;</td>
			<td>Bacto Laboratories</td>
			<td>561832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DxH 500 Hematology Analyzer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B40601</td>
			<td>Referred to as external automated cell counter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyEightsTM EasySepTM Magnet</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>18103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>19654</td>
			<td>Kit includes the magnetic bead tube and the cocktail mix tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td>Instructions to make 0.1M EDTA solution from EDTA salt is located in supplemental file 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoprepTM Density Gradient Medium</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>7851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge ST4 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>THR75009903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion Star A211 pH meter electrode</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion&#8482; ROSS Ultra&#8482; Glass Triode&#8482; pH/ATC Combination Electrodes</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>8302BNURCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), solution, 1X, 500ml</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSepTM Buffer 1X</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>20104</td>
			<td>Software used for statistical analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSepTM-S</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>21000</td>
			<td>Fully automated cell separator instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep&#8482; Filter Tips</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>20125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SepMateTM-50 (IVD) tubes</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>85460</td>
			<td>IVD - In vitro diagnostics. Also known as SepMateTM-50 tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Cell Anlayzer</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Internal automated cell counter. Instrument obsolete and no longer available for purchase (as of December 31, 2022). Alternative instrument is the ViCell BLU Cell Viability Analyzer (Product no. C19196).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Quad Pack Reagent Kit</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>383722</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating human peripheral blood mononuclear cells from buffy coats via high throughput immunomagnetic bead separation

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) sind eine heterogene Population von Monozyten und Lymphozyten. Kryokonservierte PBMCs haben eine stabile Lebensfähigkeit bei langfristiger Lagerung, was sie zu einem idealen Zelltyp für viele nachgelagerte Forschungszwecke macht, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunoassays und Genomsequenzierung. In der Regel werden PBMCs durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert, jedoch handelt es sich um einen Arbeitsablauf mit niedrigem Durchsatz, der schwierig und kostspielig zu skalieren ist. In diesem Artikel wird ein Hochdurchsatz-Workflow unter Verwendung einer auf magnetischen Beads basierenden PBMC-Isolationsmethode vorgestellt, die schnell zu implementieren ist. Die Gesamtzellkonzentration, die Lebensfähigkeit und die Populationsverteilung mit PBMCs, die mittels Dichtegradientenisolierung erhalten wurden, wurden verglichen, und die Zellviabilität und der Anteil der Zelltypen waren für beide Techniken vergleichbar. Isolierte PBMCs zeigten bis zu 9 Tage nach der Blutentnahme eine Lebensfähigkeit von über 70 %, obwohl die Ausbeute nach 5 Tagen im Vergleich zu PBMCs, die innerhalb von 24 Stunden nach der Blutentnahme verarbeitet wurden, um die Hälfte abnahm. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Artikel ein PBMC-Protokoll beschreibt, das einen Bead-basierten Ansatz zur Anpassung an einen Hochdurchsatz-Workflow verwendet, und zeigt, dass sowohl manuelle als auch automatisierte Bead-basierte Methoden die Verarbeitungskapazität erhöhen und Flexibilität für verschiedene Budgets bieten können.

Peripheral blood mononuclear cell (PBMC) isolation is a technique that separates and isolates lymphocytes and monocytes from other whole blood constituents. PBMCs are a versatile cell type used for numerous applications including, but not limited to, immunotherapy, vaccine development, target or biomarker identification, and antibody/small molecule drug development1,2. These cells may be isolated from healthy or diseased individuals and can be used immediately in downstream processes or cryopreserved for future research3. In some instances, the downstream purpose is known, while in others, as is common in biobanking, PBMCs are isolated and stored for future unspecified applications4.
Density gradient centrifugation is the traditional technique for isolating PBMCs5,6,7 from whole blood, utilizing the differential separation of the constituent cell types based on cell density during centrifugation. While there may be some variation in this method, whole blood is generally diluted with phosphate-buffered saline (PBS), layered over a density gradient medium in a specialized or standard centrifuge tube, and then spun. Four distinct layers result: the top plasma layer is enriched with platelets, a thin PBMC layer is above the density gradient medium, and finally, the bottom layer consists of red blood cells (RBCs) and granulocytes. Although this method has previously been termed &#39;the gold standard&#39;8, there are limitations for scale-up, such as lengthy processing time, centrifuge capacity, difficulty in aliquoting other blood products (i.e., plasma and RBCs), and being laborious to automate. While automation is possible for this method9, it does require comprehensive programming of a liquid handler (with a centrifugation module to be fully automated) and would remain a lengthy process.
Henceforth, an alternate workflow that uses immunomagnetic bead separation with either an eight-holder magnet for manual processing or an instrument for fully automated processing is presented. This method utilizes an antibody cocktail that is added to cells and binds unwanted cell populations, in this case, platelets, granulocytes, and RBCs. These unwanted populations are subsequently removed by magnetic separation, leaving monocyte and lymphocyte populations in the negative fraction that are ready for downstream processing10. This negative selection method is faster than positive selection methods which require additional steps to remove the antibody and magnetic bead complex from the PBMCs. Negative selection is additionally advantageous as it has been described as a way to preserve cell functionality11,12.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei der PBMC-Isolierung - Verbesserung des Durchsatzes und der Konsistenz in der Forschung

Isolierung von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes aus Buffy Coats durch immunmagnetische Hochdurchsatz-Bead-Trennung

Isolating peripheral blood mononuclear cells, also known as PBMCs, is typically a lengthy and manual process. We saw an alternative method that'd be quick to implement and capable of processing high numbers of samples. Our protocol offers an automated high throughput method, ensuring consistency while preventing technician burnout.We also detail our medium throughput automation-compatible method that can be utilized during equipment downtime. This medium throughput option is a more budget-friendly alternative for other laboratories. A biobank can now process more samples with the same number of technicians.This will increase the specimen collection size as well as its diversity, enabling future research and improving patient care.

Die Anteile von Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen vor (d. h. im Vollblut) und nach der PBMC-Isolierung wurden gemessen, wenn PBMCs unter Verwendung der Bead-basierten oder Dichtegradienten-Trennmethode isoliert wurden. Die Anteile von Lymphozyten und Monozyten wurden durch beide Methoden signifikant angereichert (Abbildung 2A,B). Darüber hinaus waren die Anteile von Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen (d. h. Granulozyten) in PBMCs, die mit der Bead-basierten Methode isoliert wurden, signifikant verringert (Abbildung 2C-F). Es gab keine signifikanten Unterschiede in den Anteilen von Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen und Granulozyten zwischen dem Dichtegradienten und den Bead-basierten Methoden (Abbildung 2). Für die oben aufgeführten Zelltypen wurde zusätzlich die prozentuale Wiederfindung berechnet (siehe Ergänzende Abbildung 1). Die mittlere Zellviabilität lag bei beiden Methoden bei über 95 % und unterschied sich nicht signifikant (Abbildung 3A). PBMCs wurden auch in einem Größenbereich (Durchmesser) von 8 μm bis 50 μm gezählt, wobei die Methode der Dichtegradiententrennung eine etwa doppelt so hohe Gesamtzellzahl ergab (Abbildung 3B). 
Als nächstes wurde die automatisierte bead-basierte Methode mit der manuellen Methode verglichen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf die Zellviabilität (Abbildung 4A) oder die Gesamtzellzahl (Abbildung 4B) mit der manuellen oder automatisierten Methode festgestellt. Die Zeit für die Verarbeitung dieser 8 Proben wurde verglichen, einschließlich der Hands-Off-Zeit, die kein menschliches Eingreifen erforderte. Die Gesamtverarbeitungszeit von 8 Proben betrug 43 min vs. 57 min für das Handbuch vs. die automatisierte Methode. Die automatisierte Methode umfasste eine 35-minütige Hands-off-Verarbeitung (Abbildung 4C).
Der Bead-basierte Workflow der PBMC-Isolierung (mit Vollblut- und Plasma-Aliquotierung) wurde über 9 Monate pilotiert, wobei 1410 PBMC-Proben aus nicht gescreentem menschlichem Blut unter Verwendung der manuellen Plattform für die ersten 820 Teilnehmer und dann unter Verwendung der automatisierten Methode für die nächsten 590 Teilnehmer isoliert wurden. Die Verarbeitung erfolgte entweder am selben Tag oder bis zu 10 Tage nach der Entnahme gemäß den Akzeptanzkriterien der Studie, wobei Verzögerungen bei der Verarbeitung hauptsächlich auf die Transitzeiten der Proben zurückzuführen waren. Bei der manuellen oder automatisierten Methode wiesen PBMCs, die innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme verarbeitet wurden, die höchste Lebensfähigkeit und Wiederfindung auf (Abbildung 5). Die mittlere Zellviabilität betrug >90 % für PBMCs, die innerhalb von 5 Tagen verarbeitet wurden, und >70 % für PBMCs, die innerhalb von 10 Tagen verarbeitet wurden (Abbildung 5A). Die durchschnittliche PBMC-Ausbeute sank nach 5 Tagen um 50 % im Vergleich zu Proben, die innerhalb von 24 Stunden verarbeitet wurden (Abbildung 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematischer Ablauf des bead-basierten PBMC-Isolationsprotokolls aus Buffy Coat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig02.jpg"> Abbildung 2: Anteile von Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen und Granulozyten in der Vollblutisolierung vor und nach der PBMC-Isolierung durch Dichtegradienten- und Bead-basierte Methoden. Prozentsatz der Lymphozyten (A), Monozyten (B), Neutrophilen (C), Eosinophilen (D), Basophilen (E) und Granulozyten (F) in passendem Vollblut vor der PBMC-Isolierung (Quadrate) und in PBMCs nach der Isolierung über die Methode des Dichtegradienten (offene Kreise) oder der Bead-basierten Methode (geschlossene Kreise) (n = 8). ns = nicht signifikant und *p < 0,05, bestimmt durch One-Way-ANOVA (A und B) oder Friedman-Test (C- F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig03.jpg"> Abbildung 3: Viabilität und Gesamtzellzahl von PBMC, isoliert durch Dichtegradient und Bead-basierte Methoden. (A) Mittlere (± SD) Zellviabilität für Proben, die mit Hilfe eines Dichtegradienten (Quadrate, dunkler Balken) im Vergleich zu Bead-basierte (Kreise, offener Balken) Methoden für 8 gepaarte Samples. ns = nicht signifikant durch gepaarten t-Test. (B) Gesamtzellzahl für Proben, die mit Hilfe eines Dichtegradienten (Quadrate, dunkler Balken) verarbeitet wurden, vs. Bead-basierte (Kreise, offener Balken) Methoden für 8 gepaarte Samples. *p < 0,05, bestimmt mit einem gepaarten t-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig04.jpg"> Abbildung 4: Vergleich von manuellen und automatisierten Bead-basierten Methoden. (A) Mittlere (± SD) Zellviabilität für Proben, die mit manuellen (Quadrate, dunkler Balken) vs. Automatisierte (Kreise, offener Balken) bead-basierte Methoden für 8 gepaarte Proben. ns = nicht signifikant nach Mann-Whitney-Test. (B) Gesamtzellzahl für Proben, die manuell (Quadrate) verarbeitet wurden, vs. Automatisierte (Kreise) bead-basierte Methoden für 8 gepaarte Proben. ns = nicht signifikant durch gepaarten t-Test. (C) Verarbeitungszeit für 8 Proben, die manuell vs. Automatisierte Methoden, einschließlich Hands-on- (Lichtbalken) und freihändiger Zeiträume (dunkler Balken). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig05.jpg"> Abbildung 5: Lebensfähigkeit und Ausbeute von PBMC, isoliert aus der bead-basierten Methode, entweder manuell oder durch Automatisierung entsprechend der Zeit zwischen Probenentnahme und PBMC-Lagerung. (A) Mittlere (± 95 % KI) Zellviabilität für Teilnehmerproben, die manuell (dunkler Balken) verarbeitet wurden, vs. Automatisierte (Open Bar) Bead-basierte Methoden. Tabelle mit den Teilnehmerzahlen. ns = nicht signifikant. na = nicht zutreffend. *p < 0,05 im Tukey-Mehrfachvergleichstest. (B) Gesamtzellzahl für Teilnehmerproben, die manuell verarbeitet wurden (dunkler Balken) vs. Automatisierte (Open Bar) Bead-basierte Methoden. Tabelle mit den Teilnehmerzahlen. ns = nicht signifikant. na = nicht zutreffend. *p < 0,05 im Tukey-Mehrfachvergleichstest. Kein Wert für Automatisierter Tag 10, da die Replikationszahl kleiner als 3 ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Abbildung der differentiellen prozentualen Zellrückgewinnung mit den Dichtegradienten- und Bead-basierten Methoden. Der Prozentsatz wurde anhand der absoluten Zellzahlen vor der Isolierung im Vollblut und der Zellsuspension nach der Isolierung unter Verwendung der Dichtegradientenmethode (Quadrate, dunkler Balken) und der bead-basierten Methode (Kreise, offener Balken) (n = 8) berechnet. ns = nicht signifikant und *p < 0,05, bestimmt durch den ungepaarten t-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: Dichtegradienten-Protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%201_editedv2.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Aufbereitung von 0,1 M EDTA, pH 8,0 in PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%202_editedv2.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 3: Detaillierte Verfahren zur Generierung der repräsentativen Daten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%203_editedv2.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt eine automatisierungskompatible Methode mit hohem Durchsatz zur Isolierung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes für Biobanking und andere Zwecke.

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a heterogeneous population of monocytes and lymphocytes. Cryopreserved PBMCs have stable viability in ...

isolating-human-peripheral-blood-mononuclear-cells-from-buffy-coats

Research

JoVE Journal

Biology

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells from Buffy Coats via High Throughput Immunomagnetic Bead Separation

1.3K Aufrufe.  New South Wales Health Pathology. Die Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes, auch PBMCs genannt, ist in der Regel ein langwieriger und manueller Prozess. Wir sahen eine alternative Methode, die schnell zu implementieren ist und in der Lage ist, große Mengen an Proben zu verarbeiten. Unser Protokoll bietet eine automatisierte Methode mit hohem Durchsatz, die Konsistenz gewährleistet und gleichzeitig ein Burnout der Techniker verhindert.Wir beschreiben auch unsere ...

Serie: Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei der PBMC-Isolierung - Verbesserung des Durchsatzes und der Konsistenz in der Forschung

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a heterogeneous population of monocytes and lymphocytes. Cryopreserved PBMCs have stable viability in long-term storage, making them an ideal cell type for many downstream research purposes, including flow cytometry, immunoassays, and genome sequencing. Typically, PBMCs are isolated via&#160;density gradient centrifugation, however, it is a low-throughput workflow that is difficult and costly to scale. This article presents a high-throughput workflow using a magnetic bead-based PBMC isolation method that is quick to implement. Total cell concentration, viability, and population distribution with PBMCs obtained using density gradient isolation were compared, and cell viability and proportion of cell types were comparable for both techniques. Isolated PBMCs demonstrated over 70% viability up to 9 days after blood collection, although yield decreased by half after 5 days compared to PBMCs processed within 24 h of collection. In summary, this article describes a PBMC protocol that utilizes a bead-based approach to adapt to a high throughput workflow and demonstrates that both manual and automated bead-based methods can increase processing capacity and provide flexibility for various budgets.

This protocol details a high-throughput automation-compatible method to isolate human peripheral blood mononuclear cells for biobanking and other purposes.

Forschung

Biologie

Whole Blood Purification and Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Isolation Using Manual Method

To begin, gently invert 10-milliliter whole blood tubes 10 times at room temperature. Using a swinging bucket rotor, centrifuge the tubes at 800 g for 10 minutes at 22 degrees Celsius with the brake on. Then place the samples in a biological safety cabinet and check for the three distinct layers.Label three five-milliliter polystyrene tubes with letters A, B, and C.Swirl and collect one milliliter of the buffy coat by aspiration and transfer to the tube labeled as A.Then add 60 microliters of 0.1 molar EDTA to tube A containing the buffy coat. Add 50 microliters of the cocktail mix to tube A.Pipette up and down at least three times to mix it and incubate for five minutes at room temperature. After that, add 890 microliters of PBS to tube A and mixed by pipetting at least three times.Next, vortex the magnetic bead tube for 30 seconds. Add 50 microliters of the magnetic beads to tube A and pipette at least three times to mix the beads thoroughly. Immediately place tube A into the magnet stand and incubate for five minutes at room temperature.Then carefully pipette the enriched cell suspension into tube B, collecting the clear fraction with no or minimal red blood cells for optimal PBMC recovery. After that, remove tube A from the magnet stand and dispose of it. Next, add 50 microliters of magnetic beads to cell suspension in tube B and pipette up and down at least three times.Immediately place tube B into the magnet stand and incubate for five minutes at room temperature. Carefully pipette the enriched cell suspension into tube C, collecting only the clear fraction. Remove tube B from the magnet stand and dispose of it.Then immediately place tube C into the magnet stand and incubate for five minutes at room temperature. Carefully pipette the enriched cell suspension into a labeled centrifuge tube and top up to two milliliters with PBS. Transfer 50 microliters of the cell suspension to a sample cup of the automated cell counter.Add 450 microliters of PBS for a 1 to 10 dilution cell count.

Vollblutreinigung und Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) mit der manuellen Methode

Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Purification Using a High Throughput Automated Bead-Based Method

To begin, label two 14-milliliter tubes as A and B, one 15-milliliter centrifuge tube as C, and one 15-milliliter centrifuge tube as waste. After centrifuging the whole blood, collect and add one milliliter of the prepared buffy coat to tube A.Add 60 microliters of 0.1 molar EDTA to tube A.Then vortex the magnetic bead tube for 30 seconds. To turn on the automated PBMC instrument, switch the power on at the front of the instrument.On the instrument's home screen, select profile and choose the desired protocol. Then enter the starting volume and repeat for each sample. Select all the quadrants that will use the same reagent kit.Next, load labeled consumables, filter tips, and buffer container into each quadrant of the instrument's carousel as directed on the automated PBMC instrument screen. Once loading is complete, remove lids from consumables and reagents and select run on the instrument screen. When the run is complete, select unload and remove samples from the instrument's carousel.Transfer 500 microliters of the cells to a sample cup for a no-dilution cell count. Comparing the automated bead-based method to the manual method, no significant differences were identified in cell viability or total cell counts. The manual method processed eight samples in 43 minutes while the automated method took 57 minutes, including 35 minutes of hands-off processing.Mean cell viability was greater than 90%for PBMCs processed within five days and greater than 75%for those processed within 10 days. Mean PBMC yields decreased by 50%after five days compared to specimens processed within 24 hours.