Drehen Sie zunächst 10-Milliliter-Vollblutröhrchen 10 Mal bei Raumtemperatur vorsichtig um. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit einem schwingenden Schaufelrotor 10 Minuten lang bei 22 Grad Celsius bei angezogener Bremse. Legen Sie die Proben dann in eine biologische Sicherheitswerkbank und prüfen Sie, ob es sich um drei unterschiedliche Schichten handelt.
Beschriften Sie drei Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen mit den Buchstaben A, B und C.Swirl und sammeln Sie einen Milliliter des Buffy-Coats durch Aspiration und übertragen Sie es in das mit A beschriftete Röhrchen.Geben Sie dann 60 Mikroliter 0,1 molaren EDTA in das Röhrchen A, das den Buffy-Coat enthält. Geben Sie 50 Mikroliter der Cocktailmischung in das Röhrchen A. Pipettieren Sie mindestens dreimal auf und ab, um es zu mischen, und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie danach 890 Mikroliter PBS in das Röhrchen A und mischen Sie es durch mindestens dreimaliges Pipettieren.
Wirbeln Sie anschließend das magnetische Bead-Rohr 30 Sekunden lang vortexen. Geben Sie 50 Mikroliter der magnetischen Kügelchen in das Röhrchen A und pipettieren Sie mindestens dreimal, um die Kügelchen gründlich zu mischen. Röhrchen A sofort in das Magnetstativ setzen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Pipettieren Sie dann die angereicherte Zellsuspension vorsichtig in Röhrchen B und sammeln Sie die klare Fraktion ohne oder mit minimalen roten Blutkörperchen für eine optimale PBMC-Rückgewinnung. Nehmen Sie danach das Rohr A vom Magnetständer und entsorgen Sie es. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter magnetische Kügelchen in die Zellsuspension in Röhrchen B und pipettieren Sie mindestens dreimal auf und ab.
Röhrchen B sofort in das Magnetstativ setzen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Pipettieren Sie die angereicherte Zellsuspension vorsichtig in das Röhrchen C und sammeln Sie nur die klare Fraktion. Nehmen Sie das Rohr B vom Magnetständer und entsorgen Sie es.
Setzen Sie dann sofort das Röhrchen C in das Magnetstativ ein und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie die angereicherte Zellsuspension vorsichtig in ein markiertes Zentrifugenröhrchen und füllen Sie bis zu zwei Milliliter mit PBS auf. Übertragen Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension in einen Probenbecher des automatisierten Zellzählers.
Fügen Sie 450 Mikroliter PBS hinzu, um eine Verdünnungszellzahl von 1 bis 10 zu erhalten.
