Name: sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
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Vor Beginn des Tests, müssen wir sicherstellen, dass die folgenden Reagenzien richtig vorbereitet sind: <ol><li> Eine 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5. Bereiten Sie mit 11,4 mg / ml Kalium Phosphat zweiwertigen Trihydrat in gereinigtem Wasser und Einstellen des pH mit 1 M HCl. Diese Lösung wird bei 37 ° C vor dem Einsatz platziert. </li><li> A 0,65% Gewicht / Volumen Casein-Lösung durch Mischen 6,5 mg / ml Casein in der 50 mM Kaliumphosphatpuffer vorbereitet. Allmählich stieg die Temperatur der Lösung unter leichtem Rühren auf 80-85 ° C für ca. 10 Minuten, bis eine homogene Dispersion erreicht ist. Es ist sehr wichtig, nicht die Lösung kochen. Der pH-Wert wird dann angepasst, wenn nötig mit NaOH und HCl. </li><li> A 110 mM Trichloressigsäure-Lösung durch Verdünnen einer 6.1N Lager 1.55 mit gereinigtem Wasser hergestellt. Trichloressigsäure ist eine starke Säure und sollten mit Vorsicht behandelt werden. </li><li> 0,5 mM Folin &amp; Ciolcaltea ist, oder Folin ist Phenolreagenz, die die Lösung, die mit Tyrosin reagieren wird, um eine messbare Farbwechsel, die direkt auf die Aktivität von Proteasen bezogen werden zu generieren. Folin ist Phenolreagenz ist eine Säure und sollte mit Sorgfalt behandelt werden. </li><li> A 500 mM Natriumcarbonatlösung, hergestellt unter Verwendung von 53 mg / ml anyhydrous Natriumcarbonat in gereinigtem Wasser. Ein Enzym, Verdünnungsmittel Lösung, die von 10 mM Natriumacetat-Puffer mit 5 mM Calcium Acetate, pH 7,5, besteht bei 37 ° C. Diese Lösung ist es, was wir feste Protease-Proben auflösen oder verdünnten Enzym-Lösungen verwenden. </li><li> 1,1 mM L-Tyrosin-Standard-Stammlösung. Hergestellt unter Verwendung von 0,2 mg / ml L-Tyrosin in gereinigtem Wasser und leicht, bis die Tyrosin löst erwärmt. Wie mit dem Casein, nicht kochen diese Lösung. Lassen Sie die L-Tyrosin-Standard auf Raumtemperatur abkühlen. Diese Lösung wird weiter verdünnt werden, um unsere Standard-Kurve machen. </li><li> Protease-Lösung. Unmittelbar vor der Anwendung aufgelöst Protease in Enzym-Verdünnungslösung in Schritt 6 erstellt. </li></ol> Wenn nötig, verwenden Sie eine feste Protease-Probe von vorbestimmten Tätigkeit, die aufgelöst mit Enzym Verdünnungsmittel auf 0,1-0,2 Einheiten / ml ist. Diese Lösung dient als positive Kontrolle für die Qualitätskontrolle Test und Validierung für die Berechnungen führen wir die Enzymaktivität bestimmt wird. Einrichten des Protease-Assay-und Standard-Kurven <ol><li> Zu Beginn dieses Tests finden Sie passende Fläschchen, dass etwa 15 mls halten wird. Für jedes Enzym, das getestet werden soll, sind 4 Flaschen benötigt. Ein Fläschchen wird als Rohling verwendet werden, und drei andere wird Assay Aktivität von drei Verdünnungen der Protease verwendet werden. Drei Verdünnungen sind nützlich, wenn die Überprüfung endgültigen Berechnungen gegeneinander. <ol><li> Zu jedem Satz von vier Flaschen, fügen 5mls unserer 0,65% Casein-Lösung. Lassen Sie sie in ein Wasserbad Gleichgewicht bei 37 ° C für ca. 5 Minuten. </li><li> Fügen unterschiedlicher Menge Enzymlösung, dass drei der Probe Fläschchen getestet werden, aber nicht die leer. Mix durch Schütteln und Inkubation für 37 ° C für genau 10 Minuten. Die Protease-Aktivität und Folgeschäden Befreiung von Tyrosin während dieser Inkubationszeit ist, was wird gemessen und verglichen werden zwischen Testproben. </li></ol></li><li> Nach diesem 10-minütigen Inkubation, fügen Sie die 5 ml des TCA-Reagenz in jedes Röhrchen, um die Reaktion zu stoppen. Dann fügen Sie ein geeignetes Volumen der Enzymlösung in jedes Röhrchen, auch die leeren, so dass die endgültige Volumen der Enzymlösung in jedes Röhrchen wird 1 ml. Dies ist für den Extinktionswert des Enzyms selbst Rechnung und um sicherzustellen, dass das Endvolumen in jeder Röhre gleich ist getan. Inkubieren Sie die Lösungen bei 37 ° C für 30 Minuten. Während dieser 30-minütigen Inkubation, können Sie zum Einrichten Ihres Tyrosin Standardverdünnungen. Verwende 6 dram Fläschchen (dram Fläschchen mit Polypropylen-Röhrchen ersetzt werden), die leicht zu halten kann 8 mls. Um die sechs Fläschchen, fügen Sie die 1,1 mM Tyrosin Standard-Stammlösungen mit folgenden Volumina in ml: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Fügen Sie keine Tyrosin-Standard auf den Rohling. Niedrigere Standards können für unreine Proben, die wenig Farbe ändern Ertrag benötigt werden. Sobald die Tyrosin-Standardlösung zugesetzt worden ist, fügen Sie ein geeignetes Volumen des gereinigten Wassers in jedem der Standards, um die Lautstärke zu 2 ml zu bringen. </li><li> Nach der Inkubationszeit von 30 Minuten, Filter jede der Testlösungen und der Rohling mit einem 0,45 um Polyethersulfon Spritzenfilter. Filtration ist erforderlich, um unlösliche Bestandteile aus den Proben zu entfernen. <ol><li> Fügen Sie die Filtration 2 ml der Test-und Blindproben Filtrat bis 4 dram Fläschchen, dass mindestens 8 mls halten kann. Die gleiche Art von Flasche, in der die Standards hergestellt wurden genutzt werden kann. </li><li> Um alle Flaschen mit den Normen und Standards blank, fügen 5mls von Natriumcarbonat. Für beste Ergebnisse 1 ml Folin-Reagenz unmittelbar danach. </li><li> Add Natriumcarbonat zu einer pH-Abfall durch die Zugabe des Folin-Reagenz geschaffen zu regulieren. </li><li> Add Natriumcarbonat zu den Proben und test leer. Diese Lösungen trüb nach der Zugabe von Natriumcarbonat. Fügen Sie die Folin-Reagenz, das vor allem reagiert mit freiem Tyrosin. </li><li> Mischen Sie die DRAM-Fläschchen durch Schütteln und Inkubation bei 37 ° C für 30 Minuten. </li></ol> Nach dieser Inkubation, sollten Sie feststellen, dass die Standards eine Abstufung der Farbe korreliert mit der Menge an Tyrosin hinzugefügt haben, die höchsten Konzentrationen von Tyrosin erscheinen dunkelsten. Sie können auch feststellen, nennenswerte Farbveränderung in unseren Proben. 2mls dieser Lösungen sind durch ein 0,45 um Polyethersulfon Spritzenfilter in geeignete Küvetten. Nun, da der Test durchgeführt wird, können Sie mit dem Spektralfotometer Sie diese in unserem Extinktionswerte aufzunehmen. </li></ol> Messung der Absorption und Berechnung Enzymaktivität <ol><li> Die Absorption der Proben wird durch ein Spektralphotometer mit einer Wellenlänge von 660nm gemessen. Der Lichtweg ist 1cm gesetzt. Notieren Sie sich die Extinktionswerte für die Standards, Standard-blank, die verschiedenen Proben und testen leer. Sobald alle Daten gesammelt wurden, kann die Standardkurve erstellt werden. Um die Kurve zu erzeugen, Extinktionsdifferenz zwischen der Standard-und Standard-Rohling berechnet werden muss. Dies ist der Extinktionswert auf die Menge an Tyrosin in der Standard-Lösungen. Nach dieser einfachen Rechnung, erstellen Sie die Standard-Kurve mit einem Grafik-Programm, um die Änderung der Absorption von unseren Standards auf der Y-Achse gegen die Menge in Mikromol für jedes unserer 5-Norm auf der X-Achse zeichnen. <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> Volume von Tyrosin Standard- </th><th style="text-align:center"> uMoles Tyrosin </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,05 </td><td style="text-align:center"> 0,055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,10 </td><td style="text-align:center"> 0,111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,20 </td><td style="text-align:center"> 0,221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,40 </td><td style="text-align:center"> 0,442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,50 </td><td style="text-align:center"> 0,553 </td></tr></tbody></table></li><li> Nachdem die Daten eingegeben sind, erzeugen eine Reihe von Best-Fit und entsprechende Neigung Gleichung. Finden Sie die Änderung der Absorption in den Proben durch Berechnung der Differenz zwischen der Probe Absorption und der Absorption der Test leer. Einsetzen der Extinktionswert für eine der Proben in den Hang Gleichung ein und lösen in der Mikromol Tyrosin befreiten während dieser besonderen proteolytischen Reaktion führen. Um die Aktivität des Enzyms in Einheiten pro / ml, führen Sie die folgende Berechnung: (Umole Tyrosinäquivalent freigegeben) x (11) Einheiten / ml Enzym = __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = Gesamtvolumen (in Milliliter)-Assay 10 = Time of Assay (in Minuten) nach der Einheit Definition 1 = Volumen der Enzyme (in Milliliter) des Enzyms verwendet 2 = Volumen (ml) in kolorimetrischen Bestimmung verwendet Nehmen Sie die Anzahl der Mikromol Tyrosin-Äquivalente freigesetzt aus der Steigung Gleichung erhalten und vermehren es durch das Gesamtvolumen des Assays in mls, was in unserem Fall ist 11mls. Teilen Sie diesen Wert durch drei weitere Mengen: die Zeit des Tests, die wir für 10 Minuten lief, das Volumen des Enzyms im Assay verwendet, die variiert wurde (wir verwenden 1ml), das Volumen der Milliliter in kolorimetrischen Nachweis verwendet, der eventuell unterscheiden auf der Grundlage Ihrer Küvette. Wir haben 2 mls. </li><li> Mikromol Tyrosin durch die Zeit in Minuten liefert die Messung der Protease-Aktivität als &quot;Einheiten&quot; unterteilt. Wir können heben die Einheiten für Volumen-Messung in den Zähler und Nenner, so dass ein Messen von Enzymaktivität in Einheiten / ml. Um die Aktivität in einem festen Protease Probe in Enzym-Verdünnungsmittel verdünnt bestimmen, teilen wir unsere Tätigkeit in Einheiten / ml durch die Konzentration der festen in diesem Test ursprünglich in mg / ml. Verwendet, so dass uns mit der Aktivität in Bezug auf die Einheiten / mg . Einheiten / ml Enzym Units / mg Feststoff = _____________________ mg Feststoff / ml Enzym </li></ol>

<ol>
	<li>Anson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li><li>Folin, O., Ciocalteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Biol. Chem. 73, 627 (1929).</li></ol>

Wir haben gerade gezeigt, wie Sie Protease-Aktivität analysieren mit Hilfe von Sigma universelle Protease-Aktivität-Assay. Darüber hinaus ist dieser Test nützlich, um sicherzustellen, dass unsere Proteasen haben genau Aktivität bestimmt, bevor Sie sie erhalten für Ihre Experimente. Wie Sie gesehen haben, wenn Sie diese Prozedur, ist es von größter Wichtigkeit zu erinnern, um sowohl das Kasein und Tyrosin-Lösungen Wärme langsam und nicht zu kochen. Außerdem ist es wichtig, verschiedene Rohlinge für Ihre Ansprüche und für jede Probe, die Sie vorbereiten.

<table><tbody><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;amp; Ciocalteu&#039;s Phenol Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate, Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine, Free Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Protease Profiler Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Protease Fluorescent Detection Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate

Proteasen bauen Peptidbindungen. Im Labor ist es oft notwendig, um zu messen und / oder vergleichen Sie die Aktivität von Proteasen. Sigma ist nicht-spezifische Protease-Aktivität Test kann als ein standardisiertes Verfahren eingesetzt werden, um die Aktivität der Proteasen, die das, was wir während unserer Qualitätskontrolle zu tun ist zu bestimmen. In diesem Test wirkt Casein als Substrat. Wenn die Protease testen wir Casein verdaut, ist die Aminosäure Tyrosin befreit zusammen mit anderen Aminosäuren-und Peptid-Fragmente. Folin und Ciocalteus Phenol oder Folin-Reagenz in erster Linie reagiert mit freiem Tyrosin zu einer blau gefärbten Chromophor, die quantifizierbar und gemessen als OD-Wert auf dem Spektralphotometer ist zu produzieren. Je mehr Tyrosin, die aus Kasein freigesetzt wird, desto mehr Chromophore erzeugt und desto stärker ist die Aktivität der Protease. Extinktionswerte durch die Aktivität der Protease erzeugt werden, um eine Standardkurve, die durch Umsetzung von bekannten Mengen von Tyrosin mit dem FC-Reagenz auf Veränderungen in der Absorption mit der Menge an Tyrosin in Mikromol korrelieren erzeugt wird verglichen. Von der Standardkurve der Aktivität der Protease Proben können in Bezug auf die Einheiten, die über den Betrag in Mikromol Tyrosin-Äquivalente aus Kasein pro Minute freigesetzt bestimmt werden. Um diesen Artikel in Chinesisch, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">klicken Sie hier</a>

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Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteasen bauen Peptidbindungen. Im Labor ist es oft notwendig, um zu messen und / oder vergleichen Sie die Aktivität von Proteasen. Sigma ist nicht-spezifische Protease-Aktivität Test kann als ein standardisiertes Verfahren eingesetzt werden, um die Aktivität von Proteasen zu bestimmen.

Sigma Unspezifische Protease Activity Assay - Casein als Substrat

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

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Serie: Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Forschung

Biochemie

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Krebsforschung

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Ein Fluorogenic Peptid Spaltung Assay zum Bildschirm für die proteolytische Aktivität: Anwendungen für Coronavirus spike Protein-Aktivierung

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Die Nutzung der Protease Fluorescent Detection Kit für Protease-Aktivität zu bestimmen

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Biologie

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Immunologie und Infektion

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Concanavalin A-basierter Sedimentationsassay zur Messung der Substratbindung von Glucanphosphatasen

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Erkennung von Functional Matrix-Metalloproteinasen durch Zymographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to inflammation and various diseases including hypertension. Detection of IsoLG accumulation in tissues is crucial in shedding light on their involvement in the disease processes. However, measurement of IsoLGs in tissues is extremely difficult, and currently available tools, including mass spectrometry analysis, are laborious and extremely expensive. Here we describe a novel method for in situ detection of IsoLGs in tissues using alkaline phosphatase-conjugated D11 ScFv and a recombinant phage-display antibody produced in E. coli by immunofluorescent microscopy. Four controls were used for validating the staining: (1) staining with and without D11, (2) staining with bacterial periplasmic extract with the alkaline phosphatase linker, (3) irrelevant scFV antibody staining, and (4) competitive control with IsoLG prior to the staining. We demonstrate the effectiveness of the alkaline phosphatase-conjugated D11 in both human and mouse tissues with or without hypertension. This method will likely serve as an important tool to study the role of IsoLGs in a wide variety of disease processes.

This article provides a detailed methodology for the measurement of isolevuglandins in tissues by immunofluorescence using alkaline phosphatase-conjugated ScFv D11 antibody. Hypertension models in both mice and humans are used to explain the step-by-step procedures and fundamental principles associated with isolevuglandin measurement in tissue samples.

Direkter Nachweis von Isolevuglandinen in Geweben mittels eines D11 scFv-alkalischen Phosphatase-Fusionsproteins und Immunfluoreszenz

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

Sigma Unspezifische Protease Activity Assay - Casein als Substrat

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