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Uploaded: 2009-02-03T10:20:09
Description: Skeletal muscle regeneration is a dynamic process driven by adult muscle stem cells and their progeny. Mostly quiescent at a steady state, adult muscle ...

RevelaciÃ³n

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identification and analysis of myogenic progenitors in vivo during acute skeletal muscle injury by high-dimensional single-cell mass cytometry

Skeletal muscle constitutes the largest tissue by mass in the body and regulates multiple functions, from eyesight to respiration, from posture to movement, as well as metabolism1. Therefore, maintaining skeletal muscle integrity and function is critical to health. Skeletal muscle tissue, which consists of tightly packed bundles of multinucleated myofibers surrounded by a complex network of nerves and blood vessels, exhibits remarkable regenerative potential1,2.
The main drivers of skeletal muscle regeneration are adult muscle stem cells (MuSCs). Also known as satellite cells, due to their unique anatomical location adjacent to the plasma membrane of the myofiber and beneath the basal lamina, they were first identified in 19613. MuSCs express a unique molecular marker, the transcription factor paired box 7 (Pax7)4. Mostly quiescent in healthy adults, they become activated upon muscle injury and proliferate to give rise to progeny that will (i) differentiate into fusion-competent muscle cells that will form new myofibers to repair muscle damage or (ii) self-renew to replenish the stem cell pool5.
At the cellular and molecular level, the process of regeneration is quite dynamic and involves cell-state transitions, characterized by the coordinated expression of key myogenic transcription factors, also known as myogenic regulatory factors (MRFs)6,7. Prior in vivo developmental studies, lineage tracing experiments, and cell culture work using myoblasts&#160;have shown that sequential expression of these transcription factors drives myogenesis, with myogenic factor 5 (Myf5) being expressed upon activation, myogenic differentiation 1 (MyoD1) expression marking commitment to the myogenic program, and myogenin (MyoG) expression marking differentiation8,9,10,11,12,13,14. Despite this knowledge and the discovery of cell surface markers to purify MuSCs, strategies and tools to identify and isolate discrete populations along the myogenic differentiation path and resolve a myogenic progression in vivo have been lacking15,16,17,18.
Here, we present a novel method, based on recently published research, which enables the identification of stem and progenitor cells in skeletal muscle and the analysis of their cellular, molecular, and proliferation dynamics in the context of acute muscle injury19. This approach relies on single-cell mass cytometry (also known as Cytometry by Time of Flight [CyTOF]) to simultaneously detect key cell surface markers (&#945;7&#160;integrin, CD9, CD44, CD98, and CD104), intracellular myogenic transcription factors (Pax7, Myf5, MyoD, and MyoG) and a nucleoside analog (5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine, IdU), to monitor cells in S phase19,20,21,22,23. Moreover, the protocol presents a strategy based on the detection of two cell surface markers, CD9 and CD104, to purify these cell populations by fluorescence-activated cell sorting (FACS), therefore enabling future in-depth studies of their function in the context of injury and muscle diseases. While primary myoblasts have been extensively used in the past to study the late stages of myogenic differentiation in vitro, it is not known whether they recapitulate the molecular state of muscle progenitor cells found in vivo24,25,26,27,28,29,30. The production of myoblasts is laborious and time-consuming, and the molecular state of this primary culture changes rapidly upon passaging31. Hence, freshly isolated myogenic progenitors purified with this method will provide a more physiological system to study myogenesis and the effect of genetic or pharmacological manipulations ex-vivo.
The protocol presented here can be applied to address a variety of research questions, for example, to study the dynamics of the myogenic compartment in vivo in animal models of muscle diseases, in response to acute genetic manipulations or upon pharmacological interventions, therefore deepening our understanding of muscle stem cell dysfunction in different biological contexts and facilitating the development of novel therapeutic interventions.

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    Este es el tÃ­tulo

El ensayo de migraciÃ³n de neutrÃ³filos transuroepithelial permite la evaluaciÃ³n cuantitativa de la migraciÃ³n de PMN humanos a travÃ©s de la vejiga cultivadas capas de cÃ©lulas epiteliales en respuesta a varios estÃ­mulos (Figura 1B). Mientras que el protocolo es sencillo, hay un nÃºmero de variables que pueden influir en la migraciÃ³n de PMN y por consiguiente afectar a la reproducibilidad de este ensayo. Se deberÃ­an tomar medidas, mientras que la preparaciÃ³n de los soportes permeables y el PMN para reducir la variabilidad entre repeticiones tÃ©cnica y biolÃ³gica. Por ejemplo, sÃ³lo permeable que contiene apoya suficientemente confluentes 5637 capas de cÃ©lulas deben ser utilizados en un experimento. La confluencia de las cÃ©lulas 5637 se evaluÃ³ mediante un ensayo funcional que mide la impermeabilidad a los lÃ­quidos. Si el medio aÃ±adido a los equilibra depÃ³sito superior de todo el soporte permeable, a continuaciÃ³n, las cÃ©lulas 5637 no son lo suficientemente confluentes para llevar a cabo el experimento. Si se mantiene el volumen en el depÃ³sito superior,a continuaciÃ³n, el soporte permeable se puede utilizar para evaluar la migraciÃ³n de PMN. Hemos medido la resistencia elÃ©ctrica transepitelial en este sistema, que se eleva ligeramente sobre la confluencia de las cÃ©lulas, si se elige este mÃ©todo, se debe tener cuidado de no contaminar la configuraciÃ³n de otra manera estÃ©ril. La confluencia de las cÃ©lulas 5637 7 dÃ­as despuÃ©s de la siembra puede ser influenciada por mÃºltiples factores, incluyendo el nÃºmero de pases de las cÃ©lulas y el nÃºmero de cÃ©lulas sembradas en el soporte permeable. AdemÃ¡s, la cantidad de tiempo que las cÃ©lulas 5637 se incuban en el soporte permeable en la posiciÃ³n invertida durante la siembra no debe exceder de 16 h (Figura 1A). Para la reproducibilidad Ã³ptima, el protocolo debe ser estrictamente respetada. Por Ãºltimo, apoya permeable que contiene capas de cÃ©lulas confluentes 5637 se deben usar dentro de 1-2 dÃ­as, y las membranas de los soportes no debe tocarse, ya sea durante el crecimiento de las cÃ©lulas del 5637 o durante el ensayo de migraciÃ³n de neutrÃ³filos transuroepithelial. AdemÃ¡s de las cÃ©lulas 5637, la variabilidad tambiÃ©n se puede introducir durante la preparaciÃ³n de PMN. Utilizando el protocolo detallado anteriormente para aislar los PMN, 1 ml de sangre humana tÃ­picamente rendimientos de alrededor de 10 6 PMN, aunque este nÃºmero varÃ­a de individuo a individuo. Una vez que se conoce el rendimiento tÃ­pica de la sangre de un donante individual, el protocolo de aislamiento se puede escalar hacia arriba o hacia abajo en consecuencia. PMN a partir de individuos saludables o enferma debe ser evitado, y diferentes donantes PMN se debe utilizar para repeticiones biolÃ³gica para asegurar que los resultados observados son reproducibles. PMN debe ser manejado con cuidado y estÃ©ril para evitar la activaciÃ³n durante el aislamiento. Por Ãºltimo, la oportunidad de los procedimientos experimentales es crucial, como PMN no sobreviven durante largos periodos de tiempo una vez que se extraen del cuerpo. Utilizamos PMN dentro de 1 hora de completar el procedimiento de aislamiento. Teniendo en cuenta estas consideraciones, al menos 3 repeticiones tÃ©cnica debe incluirse en cada rÃ©plica biolÃ³gica. El nÃºmero de PMN en el depÃ³sito inferior despuÃ©s de 1 hora se muestra en la Figura 2 normalizado a 10 6 PMN de entrada. Alternativamente, los nÃºmeros de PMN se pueden comparar con un control interno despuÃ©s de la normalizaciÃ³n a la entrada de PMN, que puede reducir la variaciÃ³n entre repeticiones biolÃ³gica. La adhesiÃ³n al protocolo descrito anteriormente, con atenciÃ³n al detalle permite la enumeraciÃ³n de la migraciÃ³n de PMN en respuesta a estÃ­mulos, incluyendo bacterias (Figura 2A) y sustancias quimiotÃ¡cticas (Figura 2B). <img src="/files/ftp_upload/50919/50919fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:hires="/img/sprite.png?v=68"> Figura 1. Esquema del diseÃ±o experimental. (A) 5637 cÃ©lulas epiteliales de vejiga se sembraron sobre soportes permeables invertidas, los soportes se enderezaron en una placa de 24 pocillos, y las cÃ©lulas se cultivan hasta la confluencia. (B) Permeable suppuertos que contienen cÃ©lulas confluentes 5637 se invierten y se infectaron con E. coli en el lado apical de las capas epiteliales. Alternativamente, quimioatrayentes pueden ser colocados en el depÃ³sito inferior. Los soportes permeables se enderezaron en una placa de baja uniÃ³n, y PMN humanos reciÃ©n aislados se aplican al depÃ³sito superior (que representa el lado basolateral de las capas epiteliales). PMN migran a travÃ©s del epitelio y se enumeran desde el depÃ³sito inferior utilizando un hemocitÃ³metro. <img src="/files/ftp_upload/50919/50919fig2.jpg" alt="La figura 2" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50919/50919fig2highres.jpg"> Figura 2. PMN migran a travÃ©s de epitelios de la vejiga en respuesta a diversos estÃ­mulos. (A) La infecciÃ³n con E. no patÃ³geno coli cepa MG1655, MG1655 muertas por calor (HKMG) o UPEC mutante UTI89 ybcL :: cat provoca la migraciÃ³n de PMN significativamente mÃ¡s que mock infecciÃ³n o la infecciÃ³n con la cepa de tipo salvaje UPEC UTI89, aislar una cistitis (*, P &lt;0,001). (B) La adiciÃ³n de fMLF (100 nM) o IL-8 (100 ng / ml) a los resultados depÃ³sito inferior en la migraciÃ³n de PMN significativamente mÃ¡s que el tratamiento simulado (*, P &lt;0,001). Los datos representan la media y desviaciÃ³n estÃ¡ndar de al menos 3 rÃ©plicas biolÃ³gicas. Se determinaron diferencias estadÃ­sticamente significativas con la prueba de la t de Student para datos independientes una.

entidades introducidos aquÃ­ Grados: Micro: Î¼ ampersand: &amp; marca: PRUEBAS âˆ‚ Î£ Î© â‰ˆ Î³ Î³Î´ Î³Î´ Î³Î´ prueba

Skeletal muscle regeneration is a dynamic process driven by adult muscle stem cells and their progeny. Mostly quiescent at a steady state, adult muscle ...