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Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

University of Victoria

&#x7CBE;&#x5236;&#x7684;&#x8868;&#x9762;&#x7B49;&#x79BB;&#x5B50;&#x4F53;&#x5171;&#x632F;&#x6CD5;&#x88AB;&#x4E3A;&#x4E86;&#x8861;&#x91CF;&#x7684;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76;&#x591A;&#x80BD;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x5154;&#x5355;&#x514B;&#x9686;&#x6297;&#x4F53; (RabMAbs)&#x3002;RabMAbs &#x4F18;&#x5316;&#x7684;&#x91CF;&#x88AB;&#x4FD8;&#x5230;&#x4F20;&#x611F;&#x5668;&#x82AF;&#x7247;&#x4ECE;&#x6742;&#x4EA4;&#x7624;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57F9;&#x517B;&#x4E0A;&#x6E05;&#x6DB2;&#x4ECE;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x8DDF;&#x514D;&#x8D39;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#x5177;&#x6709;&#x7EA6;&#x675F;&#x529B;&#x3002;&#x8FD9;&#x5141;&#x8BB8;&#x4E0E;&#x5355;&#x4E00;&#x6297;&#x539F;&#x7684;&#x80BD;&#x5355;&#x4EF7;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x6D4B;&#x91CF;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F4D;&#x70B9;&#x4E0A;&#x7684;&#x6297;&#x4F53;&#x4E0E;&#x4EB2;&#x548C;&#x5E38;&#x6570;&#x7684;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x65E0;&#x5E76;&#x53D1;&#x75C7;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x8003;&#x8651;&#x4F5C;&#x51FA;&#x4E86;&#x8D21;&#x732E;&#x3002;&#x80BD;&#x7ED3;&#x5408;&#x53CD;&#x5E94;&#x4E86;&#x89C4;&#x8303;&#x5316;&#x6297;&#x4F53;&#x5B58;&#x5728;&#x4E8E;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x6837;&#x672C;&#x91CF;&#x548C;&#x7B80;&#x5355;&#x7684;&#x4E92;&#x52A8;&#x6A21;&#x578B;&#x9002;&#x5408;&#x4E8E;&#x6240;&#x6709;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x7B54;&#x590D;&#x540C;&#x65F6;&#x3002;&#x5176;&#x7ED3;&#x679C;&#x662F;&#xFF0C;&#x65E0;&#x6CD5;&#x786E;&#x5B9A;&#x5728;&#x76F8;&#x540C;&#x7684;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x6297;&#x4F53;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x901F;&#x7387;&#x5E38;&#x6570; ka &#x548C;&#x79D1;&#x5A01;&#x7279;&#x7B2C;&#x7EB3;&#x5C14;&#x53CA;&#x4EB2;&#x548C;&#x5E38;&#x6570; KD &#xFF08;kd/ka&#xFF09;&#x3002;&#x66F4;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x6D89;&#x53CA;&#x591A;&#x80BD;&#x6297;&#x539F;&#x6D53;&#x5EA6;&#x8FDB;&#x884C;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x5355;&#x6D53;&#x5EA6;&#x6D4B;&#x91CF;&#x7ED3;&#x679C;&#x7684;&#x53EF;&#x9760;&#x6027;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x7ED3;&#x5408;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x3001; &#x6D3B;&#x52A8;&#x548C;&#x6D53;&#x5EA6;&#x6570;&#x636E;&#xFF0C;&#x6267;&#x884C;&#x542B;&#x6709;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x4E0A;&#x6E05;&#x6392;&#x540D;&#xFF0C;&#x5141;&#x8BB8;&#x9009;&#x62E9;&#x9AD8;&#x8D28;&#x91CF; RabMAbs &#x7528;&#x4E8E;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x4E2D;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#x3002;

Anti-peptide &#x6297;&#x4F53;&#x7B5B;&#x67E5;&#xFF1A; &#x9AD8;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x5355;&#x514B;&#x9686;&#x8BD5;&#x5242;&#x7531;&#x7CBE;&#x5236;&#x7684;&#x8868;&#x9762;&#x7B49;&#x79BB;&#x5B50;&#x4F53;&#x5171;&#x632F;&#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x9009;&#x62E9;&#x3002;

A refined surface plasmon resonance method was developed to measure the kinetics of peptide binding to rabbit monoclonal antibodies (RabMAbs). Optimized amounts of RabMAbs were captured onto sensor chips from hybridoma supernatants followed by binding of free peptides from solution. This allowed kinetic measurement of monovalent interactions of peptides with single antigen binding sites on the antibodies and determination of affinity constants without complications contributed by avidity considerations. Peptide-binding responses were normalized for the amount of antibody present in each sample and a simple interaction model was fit to all of the binding responses simultaneously. As a result, the kinetic rate constants ka and kd, and the affinity constant KD (kd/ka), could be determined for each antibody interaction under identical conditions. Higher-resolution studies involving multiple concentrations of peptide antigens were performed to validate the reliability of single-concentration measurements. By combining data on affinity, activity and concentration, ranking of the antibody-containing supernatants was performed, allowing selection of high quality RabMAbs for binding of peptides in solution.

Anti-peptide antibody screening: selection of high affinity monoclonal reagents by a refined surface plasmon resonance technique.

Une m&eacute;thode de r&eacute;sonance plasmonique de surface raffin&eacute;e a &eacute;t&eacute; d&eacute;velopp&eacute;e pour mesurer la cin&eacute;tique de la liaison peptidique d&#39;anticorps monoclonaux de lapin (RabMAbs). Quantit&eacute;s optimis&eacute;es de RabMAbs ont &eacute;t&eacute; captur&eacute;es sur les copeaux de capteur des surnageants d&#39;hybridome suivies par la liaison des peptides libres de solution. Cela a permis &agrave; mesure cin&eacute;tique des interactions monovalentes de peptides avec antig&egrave;ne unique des sites de liaison sur les anticorps et la d&eacute;termination des constantes d&#39;affinit&eacute; sans complications a contribu&eacute; par des consid&eacute;rations de l&#39;avidit&eacute;. Liaison peptidique r&eacute;ponses ont &eacute;t&eacute; normalis&eacute;es pour le montant d&#39;anticorps pr&eacute;sent dans chaque &eacute;chantillon et un mod&egrave;le d&#39;interaction simple &eacute;tait apte &agrave; toutes les r&eacute;ponses de la liaison en m&ecirc;me temps. En cons&eacute;quence, le ka de constantes cin&eacute;tiques et kd et le KD constante d&#39;affinit&eacute; (kd/ka), pourraient &ecirc;tre d&eacute;termin&eacute; pour chaque interaction de l&#39;anticorps dans des conditions identiques. Haute r&eacute;solution &eacute;tudes impliquant plusieurs concentrations d&#39;antig&egrave;nes peptidiques effectu&eacute;es pour valider la fiabilit&eacute; des mesures de concentration unique. En combinant les donn&eacute;es sur l&#39;affinit&eacute;, l&#39;activit&eacute; et concentration, classement des surnageants contenant des anticorps a &eacute;t&eacute; effectu&eacute;, permettant la s&eacute;lection de haute qualit&eacute; RabMAbs pour la liaison des peptides en solution.

D&eacute;pistage des anticorps anti-peptide : s&eacute;lection des r&eacute;actifs monoclonaux haute affinit&eacute; par une technique de r&eacute;sonance plasmonique de surface raffin&eacute;e.

Eine raffinierte Oberfl&auml;chen-Plasmon-Resonanz-Methode wurde entwickelt, um die Kinetik der Peptid-Bindung an Kaninchen monoklonale Antik&ouml;rper (RabMAbs) zu messen. Optimierte Mengen an RabMAbs wurden auf Sensor-Chips von Hybridoma Supernatants anschlie&szlig;ender Bindung von freien Peptiden aus L&ouml;sung gefangen genommen. Dies erlaubt kinetische Messung der monovalenten Interaktionen von Peptiden mit einzelnen Antigen Bindungsstellen auf den Antik&ouml;rpern und Bestimmung der Affinit&auml;t Konstanten ohne Komplikationen durch die Avidit&auml;t &Uuml;berlegungen beigetragen. Peptid-Bindung Antworten wurden f&uuml;r den Antik&ouml;rper in jeder Probe normalisiert und eine einfache Interaktionsmodell wurde gleichzeitig f&uuml;r alle verbindliche Antworten passen. Infolgedessen konnte der kinetischen Rate Konstanten ka und kd und der Affinit&auml;t Konstante KD (kd/ka), f&uuml;r jede Antik&ouml;rper Interaktion unter identischen Bedingungen ermittelt werden. H&ouml;here Aufl&ouml;sung-Studien, die mit mehreren Konzentrationen von Peptidantigene wurden durchgef&uuml;hrt, um die Zuverl&auml;ssigkeit der Einzel-Konzentrationsmessungen zu validieren. Durch die Kombination von Daten f&uuml;r Affinit&auml;t, Bewegung und Konzentration, wurde Ranking der Antik&ouml;rper-haltigen Supernatants durchgef&uuml;hrt, so dass Auswahl hochwertiger RabMAbs f&uuml;r die Bindung von Peptiden in L&ouml;sung.

Anti-Peptide Antik&ouml;rper-Screening: Auswahl der hohe Affinit&auml;t monoklonalen Reagenzien durch eine raffinierte Oberfl&auml;chen-Plasmon-Resonanz-Technik.

Un metodo di risonanza plasmonica di superficie raffinata &egrave; stato sviluppato per misurare la cinetica del legame del peptide di anticorpi monoclonali di coniglio (RabMAbs). Quantit&agrave; ottimizzata di RabMAbs sono stati catturati sul chip sensore da supernatanti ibridoma, seguiti da un legame di peptidi gratis soluzione. Questo ha permesso cinetica misura delle interazioni monovalente di peptidi con singolo antigene siti di legame sulla determinazione delle costanti di affinit&agrave; e anticorpi senza complicazioni inviate da considerazioni di avidit&agrave;. Peptide-associazione risposte sono state normalizzate per la quantit&agrave; di anticorpi presenti in ogni campione e un modello di interazione semplici era adatto a tutte le risposte di associazione simultaneamente. Di conseguenza, il tasso cinetica costanti ka e kd e il KD costante di affinit&agrave; (kd/ka), potrebbe essere determinata per ogni interazione anticorpo in condizioni identiche. Per convalidare l&#39;attendibilit&agrave; delle misure della concentrazione singola sono stati eseguiti studi ad alta risoluzione che coinvolgono molteplici concentrazioni di antigeni peptidici. Combinando i dati sull&#39;affinit&agrave;, attivit&agrave; e concentrazione, classifica dei supernatanti contenente anticorpo &egrave; stata eseguita, consente la selezione di alta qualit&agrave; RabMAbs per l&#39;associazione di peptidi in soluzione.

Lo screening anticorpale anti-peptide: selezione di una tecnica di risonanza plasmonica di superficie raffinata i reagenti monoclonali ad alta affinit&agrave;.

&#x6D17;&#x7DF4;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x8868;&#x9762;&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30E2;&#x30F3;&#x5171;&#x9CF4;&#x6CD5;&#x306F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x30A6;&#x30B5;&#x30AE; &#x30E2;&#x30CE;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30CA;&#x30EB;&#x6297;&#x4F53; (RabMAbs) &#x306E;&#x52D5;&#x614B;&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x958B;&#x767A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x91CF; RabMAbs &#x7121;&#x6599;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x304B;&#x3089;&#x7D9A;&#x3044;&#x3066;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C9;&#x30FC;&#x30DE;&#x57F9;&#x990A;&#x4E0A;&#x6E05;&#x304B;&#x3089;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC; &#x30C1;&#x30C3;&#x30D7;&#x4E0A;&#x306B;&#x6355;&#x7372;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x521D;&#x611F;&#x67D3;&#x306E;&#x8003;&#x616E;&#x4E8B;&#x9805;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8CA2;&#x732E;&#x3057;&#x3066;&#x5408;&#x4F75;&#x75C7;&#x306A;&#x304F;&#x6297;&#x4F53;&#x3068;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x5B9A;&#x6570;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x5358;&#x4E00;&#x6297;&#x539F;&#x3068;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E; 1 &#x4FA1;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x901F;&#x5EA6;&#x8AD6;&#x7684;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3092;&#x8A31;&#x53EF;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x53CD;&#x5FDC;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x5404;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x3067;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x91CF;&#x306B;&#x6B63;&#x898F;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3001;&#x5358;&#x7D14;&#x306A;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB; &#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306E;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306B;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x53CE;&#x307E;&#x308B;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;&#x5316;&#x5B66;&#x53CD;&#x5FDC;&#x901F;&#x5EA6;&#x5B9A;&#x6570; ka &#x3068; kd &#x3068;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x5B9A;&#x6570; KD (kd/ka)&#x3001;&#x5404;&#x6297;&#x4F53;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3068;&#x540C;&#x3058;&#x6761;&#x4EF6;&#x306E;&#x4E0B;&#x3067;&#x7279;&#x5B9A;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5358;&#x4E00;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x306E;&#x4FE1;&#x983C;&#x6027;&#x3092;&#x691C;&#x8A3C;&#x3059;&#x308B;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x6297;&#x539F;&#x306E;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x9AD8;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x306E;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3092;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x3001;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3001;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x3001;&#x6297;&#x4F53;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x6E05;&#x306E;&#x30E9;&#x30F3;&#x30AD;&#x30F3;&#x30B0;&#x9AD8;&#x54C1;&#x8CEA; RabMAbs &#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9; &#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3092;&#x8A31;&#x53EF;&#x3059;&#x308B;&#x8853;&#x3092;&#x884C;&#x3063;&#x305F;.

&#x6297;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;: &#x6D17;&#x7DF4;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x8868;&#x9762;&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30E2;&#x30F3;&#x5171;&#x9CF4;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x9AD8;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x6297;&#x4F53;&#x8A66;&#x85AC;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x3002;

&#xC138;&#xB828; &#xB41C; &#xD45C;&#xBA74; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4;&#xBAAC; &#xACF5;&#xBA85; &#xBC29;&#xBC95; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD1A0;&#xB07C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD074;&#xB860; &#xD56D; &#xCCB4; (RabMAbs)&#xC758; &#xC18D;&#xB3C4; &#xCE21;&#xC815; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. RabMAbs &#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xB41C; &#xC591;&#xC758; hybridoma supernatants &#xC194;&#xB8E8;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBB34;&#xB8CC; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xB4A4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC13C;&#xC11C; &#xCE69;&#xC5D0; &#xCCB4;&#xD3EC; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC695;&#xB9DD;&#xC744; &#xACE0;&#xB824; &#xD558; &#xC5EC; &#xAE30;&#xC5EC; &#xD558;&#xB294; &#xD569;&#xBCD1;&#xC99D; &#xC5C6;&#xC774; &#xC6B4;&#xB3D9; &#xCE21;&#xC815; &#xC5EC;&#xB7EC;&#xCC28;&#xB840; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD56D; &#xC6D0; &#xD56D; &#xCCB4; &#xBC0F; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC0C1;&#xC218;&#xC758; &#xACB0;&#xC815;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xD5C8;&#xC6A9;. &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC751;&#xB2F5; &#xD588;&#xB2E4; &#xAC01; &#xC0D8;&#xD50C;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC758; &#xC591;&#xC744; &#xC815;&#xC0C1;&#xD654; &#xD558; &#xACE0; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xBAA8;&#xB378; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC751;&#xB2F5; &#xBAA8;&#xB450;&#xC5D0; &#xAC8C; &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xC801;&#xD569; &#xD558;&#xB2E4;. &#xADF8; &#xACB0;&#xACFC;, &#xC6B4;&#xB3D9; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC0C1;&#xC218; ka&#xC640; kd, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC0C1;&#xC218; KD (kd/&#xCE74;), &#xB3D9;&#xC77C; &#xC870;&#xAC74; &#xD558;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC01; &#xD56D; &#xCCB4; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xACB0;&#xC815; &#xBABB;&#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB192;&#xC740; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xB18D;&#xB3C4;&#xC758; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xD56D; &#xC6D0; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB18D;&#xB3C4; &#xCE21;&#xC815;&#xC758; &#xC2E0;&#xB8B0;&#xC131;&#xC744; &#xD655;&#xC778; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC218;&#xD589; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC120;&#xD638;&#xB3C4;, &#xD65C;&#xB3D9; &#xBC0F; &#xB18D;&#xB3C4; &#xB300; &#xD55C; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB97C; &#xACB0;&#xD569; &#xD558; &#xC5EC; &#xD56D; &#xCCB4;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; supernatants&#xC758; &#xC21C;&#xC704; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xACE0;&#xD488;&#xC9C8; RabMAbs &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; &#xC218;&#xD589; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Anti-peptide &#xD56D; &#xCCB4; &#xAC80;&#xC0AC;: &#xC138;&#xB828; &#xB41C; &#xD45C;&#xBA74; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4;&#xBAAC; &#xACF5;&#xBA85; &#xAE30;&#xC220;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD074;&#xB85C; &#xB110; &#xC2DC; &#xC57D;&#xC758; &#xC120;&#xD0DD;.

Se desarroll&oacute; un m&eacute;todo de resonancia de plasmones refinado para medir la cin&eacute;tica de uni&oacute;n de p&eacute;ptido a anticuerpos monoclonales de conejo (RabMAbs). Cantidades optimizadas de RabMAbs fueron capturados en las virutas de sensor de sobrenadantes de hibridoma, seguidos por la Uni&oacute;n de p&eacute;ptidos libres de soluci&oacute;n. Esto permiti&oacute; a medida cin&eacute;tica de interacciones monovalentes de p&eacute;ptidos con solo ant&iacute;geno sitios de uni&oacute;n de anticuerpos y determinaci&oacute;n de constantes de afinidad sin complicaciones por consideraciones de avidez. Las respuestas de enlace de p&eacute;ptido se normalizaron por la cantidad de anticuerpo presente en cada muestra y un modelo de interacci&oacute;n simple se ajust&oacute; a todas las respuestas de enlace simult&aacute;neamente. Como resultado, la tasa cin&eacute;tico constantes ka y kd y el KD constante de afinidad (kd/ka), podr&iacute;an ser determinado para cada interacci&oacute;n del anticuerpo en condiciones id&eacute;nticas. Se realizaron estudios de alta resoluci&oacute;n con m&uacute;ltiples concentraciones de ant&iacute;genos del p&eacute;ptido para validar la confiabilidad de las mediciones de la concentraci&oacute;n solo. Mediante la combinaci&oacute;n de datos sobre la afinidad, la actividad y la concentraci&oacute;n, ranking de los sobrenadantes que contiene anticuerpos fue realizada, permite una selecci&oacute;n de alta calidad RabMAbs para Uni&oacute;n de p&eacute;ptidos en soluci&oacute;n.

Detecci&oacute;n de anticuerpos anti-Peptide: selecci&oacute;n de reactivos monoclonales de alta afinidad por una t&eacute;cnica de resonancia de plasmones refinado.

&#x4ECB;&#x7ECD;&#x4E86;&#x53EF;&#x6269;&#x5C55;&#x7504;&#x522B;&#x548C;&#x9009;&#x62E9;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x80BD;&#x5355;&#x514B;&#x9686;&#x6297;&#x4F53; &#xFF08;mAbs&#xFF09; &#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x82E5;&#x8981;&#x6807;&#x8BC6;&#x9AD8;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B; anti-peptide &#x5355;&#x514B;&#x9686;&#x6297;&#x4F53;&#x6742;&#x4EA4;&#x7624;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57F9;&#x517B;&#x4E0A;&#x6E05;&#x6DB2;&#x4E2D;&#x7684;&#xFF0C;&#x7531;&#x78C1;&#x6027;&#x4EB2;&#x548C;&#x73E0;&#x8DDF;&#x4ECE;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x80BD;&#x6355;&#x83B7;&#x6297;&#x4F53;&#x3002;&#x5B9A;&#x65F6;&#x6E05;&#x6D17;&#x6B65;&#x9AA4;&#x540E;&#xFF0C;&#x5269;&#x4F59;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x591A;&#x80BD;&#x88AB;&#x6D17;&#x8131;&#x4ECE;&#x73E0;&#x548C;&#x57FA;&#x8D28;&#x8F85;&#x52A9;&#x6FC0;&#x5149;&#x89E3;&#x5438;&#x7535;&#x79BB;/&#x98DE;&#x884C;&#x65F6;&#x95F4; (&#x8FDB;&#x884C;&#x8D28;&#x8C31; TOF) &#x8D28;&#x8C31; (MS) &#x68C0;&#x6D4B;&#x5230;&#x3002;&#x8FD9;&#x5141;&#x8BB8;&#x5355;&#x4E00;&#x6297;&#x539F;&#x80BD;&#x7684;&#x5355;&#x4EF7;&#x4EA4;&#x4E92;&#x6D4B;&#x91CF;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7AD9;&#x70B9;&#x4E0A;&#x7684;&#x6297;&#x4F53;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x53CD;&#x6620;&#x51FA;&#x6297;&#x4F53;&#x4EB2;&#x548C;&#x800C;&#x4E0D;&#x662F;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x3002;&#x6297;&#x4F53;&#xFF0C;&#x80FD;&#x591F;&#x4ECE;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x9636;&#x6BB5;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x76EE;&#x6807;&#x80BD;&#x548C;&#x4FDD;&#x7559;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x81F3;&#x5C11; 10 &#x5206;&#x949F;&#x6D17;&#x65F6;&#x786E;&#x5B9A;&#x4E86;&#x53D6;&#x5F97;&#x9002;&#x5F53;&#x7684; m/z &#x80BD; MS &#x8BAF;&#x53F7;&#x7684;&#x5F3A;&#x5EA6;&#x3002;&#x8FD9;&#x6D17;&#x4E00;&#x6B21;&#x53CD;&#x6620;&#x4E86;&#x51E0;&#x4E2A;&#x5F53;&#x524D;&#x514D;&#x75AB;-&#x8D28;&#x8C31;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x4F7F;&#x7528;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x6700;&#x5C0F;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#x5206;&#x79BB;&#x65F6;&#x95F4;&#x3002;&#x6297;&#x4F53;&#x80BD;&#x5177;&#x6709;&#x7EA6;&#x675F;&#x529B;&#x7684;&#x8868;&#x9762;&#x7B49;&#x79BB;&#x5B50;&#x4F53;&#x5171;&#x632F; (SPR) &#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x5206;&#x6790;&#x8868;&#x660E;&#x9009;&#x5B9A;&#x7684;&#x6297;&#x4F53;&#x9AD8;&#x4EB2;&#x548C;&#x6027;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x548C;&#x6700;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x8FC7;&#x4F4E;&#x7684;&#x79BB;&#x89E3;&#x5E38;&#x6570;&#x3002;&#x6B64;&#x65B9;&#x6CD5;&#x79F0;&#x4E3A;&#x8FDB;&#x884C;&#x8D28;&#x8C31;&#x7B5B;&#x9009; &#xFF08;MiSCREEN&#xFF09;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x4F7F;&#x8FC5;&#x901F;&#x7504;&#x522B;&#x548C;&#x9009;&#x62E9;&#x9AD8;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B; anti-peptide &#x6297;&#x4F53;&#xFF0C;&#x53EF;&#x7528;&#x4E8E;&#x5404;&#x79CD;&#x514D;&#x75AB;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EC4;&#x5B66;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x6F14;&#x793A;&#x4E2D;&#x514D;&#x75AB;-&#x8D28;&#x8C31;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x5176;&#x529F;&#x80FD;&#x5B9E;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x9009;&#x5B9A;&#x3001; &#x7EAF;&#x51C0; RabMAbs &#x4E30;&#x5BCC;&#x81EA;&#x7136; &#xFF08;&#x80F0;&#x9176;&#xFF09; &#x80BD;&#x7684;&#x6D88;&#x5316;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x8840;&#x6D46;&#x3002;

&#x9A6C;&#x5C14;&#x8FEA;&#x7B5B;&#x9009; &#xFF08;MiSCREEN&#xFF09;&#xFF1A; &#x9009;&#x62E9; anti-peptide &#x5355;&#x514B;&#x9686;&#x6297;&#x4F53;&#x514D;&#x75AB;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EC4;&#x5B66;&#x4E2D;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

A scalable method for screening and selection of peptide-specific monoclonal antibodies (mAbs) is described. To identify high affinity anti-peptide mAbs in hybridoma supernatants, antibodies were captured by magnetic affinity beads followed by binding of specific peptides from solution. After timed washing steps, the remaining bound peptides were eluted from the beads and detected by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS). This allowed measurement of monovalent interactions of peptides with single antigen binding sites on the antibodies, thus reflecting antibody affinity rather than avidity. Antibodies that were able to bind target peptides from solution phase and retain them during washing for a minimum of 10 min were identified by the strength of the appropriate m/z peptide MS signals obtained. This wash time reflects the minimum peptide dissociation time required for use of these antibodies in several current immuno-mass spectrometry assays. Kinetic analysis of antibody-peptide binding by surface plasmon resonance (SPR) showed that the selected antibodies were of high affinity and, most importantly, had low dissociation constants. This method, called MALDI immunoscreening (MiSCREEN), thus enables rapid screening and selection of high affinity anti-peptide antibodies that are useful for a variety of immunoproteomics applications. To demonstrate their functional utility in immuno-mass spectrometry assays, we used the selected, purified RabMAbs to enrich natural (tryptic) peptides from digested human plasma.

MALDI immunoscreening (MiSCREEN): a method for selection of anti-peptide monoclonal antibodies for use in immunoproteomics.

On d&eacute;crit une m&eacute;thode &eacute;volutive pour la pr&eacute;s&eacute;lection et de s&eacute;lection de peptide sp&eacute;cifique des anticorps monoclonaux (ACM). Pour identifier le mAbs anti-peptide haute affinit&eacute; dans les surnageants de l&#39;hybridome, anticorps ont &eacute;t&eacute; captur&eacute;s par des billes magn&eacute;tiques d&#39;affinit&eacute; suivies par la liaison des peptides sp&eacute;cifiques de la solution. Une fois termin&eacute; les &eacute;tapes de lavage, les peptides li&eacute;s restants ont &eacute;t&eacute; &eacute;lu&eacute;es de perles et d&eacute;tect&eacute;s par spectrom&eacute;trie de d&eacute;sorption-ionisation laser assist&eacute;e par matrice temps de vol (MALDI-TOF) masse (MS). Cela a permis &agrave; mesure des interactions monovalentes de peptides avec antig&egrave;ne unique des sites de liaison sur les anticorps, refl&eacute;tant ainsi l&#39;affinit&eacute; de l&#39;anticorps plut&ocirc;t que d&#39;avidit&eacute;. Les anticorps qui ont pu lier des peptides de la cible de la phase de solution et de les maintenir pendant le lavage pendant au moins 10 min ont &eacute;t&eacute; identifi&eacute;s par la force des signaux appropri&eacute;s m/z peptide MS obtenus. Cette dur&eacute;e de lavage refl&egrave;te le temps de dissociation peptide minimales requis pour l&#39;utilisation de ces anticorps dans plusieurs essais d&#39;immuno-spectrom&eacute;trie de masse actuelle. Analyse cin&eacute;tique de liaison anticorps-peptide par r&eacute;sonance plasmonique de surface (SPR) a montr&eacute; que les anticorps s&eacute;lectionn&eacute;s &eacute;taient de haute affinit&eacute; et, surtout, constantes de dissociation faible. Cette m&eacute;thode, appel&eacute;e MALDI immunocriblage (MiSCREEN), permet ainsi de d&eacute;pistage rapide et la s&eacute;lection des anticorps anti-peptide de haute affinit&eacute; qui sont utiles pour une vari&eacute;t&eacute; d&#39;applications d&#39;immunoproteomics. Afin de d&eacute;montrer leur utilit&eacute; fonctionnelle dans les dosages immuno-spectrom&eacute;trie de masse, nous avons utilis&eacute; le RabMAbs s&eacute;lectionn&eacute;, purifi&eacute;e pour enrichir des peptides naturels (tryptiques) du plasma humain dig&eacute;r&eacute;e.

MALDI immunocriblage (MiSCREEN): une m&eacute;thode de s&eacute;lection d&#39;anticorps monoclonaux anti-peptide devant servir &agrave; immunoproteomics.

Eine skalierbare Methode f&uuml;r Screening und Auswahl von Peptid-spezifischen monoklonalen Antik&ouml;rpern (mAbs) wird beschrieben. Um hohe Affinit&auml;t anti-peptide mAbs in Hybridoma Supernatants zu identifizieren, wurden Antik&ouml;rper durch magnetische Affinit&auml;t Perlen mit anschlie&szlig;ender Bindung von spezifischen Peptiden aus L&ouml;sung erfasst. Nach zeitlich Waschschritte, wurden die verbleibenden gebundene Peptide aus den Perlen eluiert und von Matrix-unterst&uuml;tzte Laser-Desorption/Ionisation-Time-of-Flight (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) erkannt. Dies erlaubt Messung von monovalenten Interaktionen von Peptiden mit einzelnen Antigen Bindungsstellen auf die Antik&ouml;rper, Antik&ouml;rper-Affinit&auml;t anstatt Avidit&auml;t was. Antik&ouml;rper, die konnten Ziel Peptide Phase-L&ouml;sung zu binden und binden sie beim Waschen f&uuml;r ein Minimum von 10 min wurden durch die St&auml;rke der entsprechenden m/Z Peptid MS Signale erhalten identifiziert. Diesmal waschen spiegelt den minimalen Peptid Dissoziation Zeitaufwand f&uuml;r die Verwendung dieser Antik&ouml;rper bei mehrere aktuelle Massenspektrometrie-Immuno-Assays. Kinetische Analyse der Antik&ouml;rper-Peptid-Bindung von Surface Plasmon Resonance (SPR) zeigte, dass die markierten Antik&ouml;rper der hohe Affinit&auml;t waren und, am wichtigsten, geringe Dissoziation-Konstanten. Diese Methode mit dem Namen MALDI-Immunoscreening (MiSCREEN), kann somit schnell-Screening und Auswahl der hohe Affinit&auml;t anti-peptide Antik&ouml;rper, die f&uuml;r eine Vielzahl von Immunoproteomics Anwendungen n&uuml;tzlich sind. Um ihren funktionalen Nutzen bei Massenspektrometrie-Immuno-Assays zu demonstrieren, haben wir die ausgew&auml;hlten, gereinigtes RabMAbs verwendet, nat&uuml;rliche (tryptic) Peptide aus verdauten Blutplasma zu bereichern.

MALDI-Immunoscreening (MiSCREEN): eine Methode f&uuml;r die Auswahl der anti-peptide monoklonale Antik&ouml;rper f&uuml;r den Einsatz in Immunoproteomics.

Viene descritto un metodo scalabile per lo screening e selezione dei peptidi specifici anticorpi monoclonali (mAbs). Per identificare i mAbs anti-peptide ad alta affinit&agrave; in supernatanti ibridoma, anticorpi furono catturati dalle affinit&agrave; magnetica perline seguite dal legame dei peptidi specifici dalla soluzione. Dopo temporizzato passaggi di lavaggio, i peptidi associati restanti erano eluiti dalle perline e rilevati dalla spettrometria di massa (MALDI-TOF) tempo di volo del desorbimento/ionizzazione di matrix-assisted laser (MS). Questo ha permesso a misura delle interazioni monovalente di peptidi con singolo antigene siti di legame su anticorpi, riflettendo cos&igrave; affinit&agrave; dell&#39;anticorpo anzich&eacute; avidit&agrave;. Dalla forza dei segnali del peptide MS appropriato m/z ottenuti sono stati identificati anticorpi che sono stati in grado di legare peptidi destinazione dalla fase di soluzione e mantenerle durante il lavaggio per un minimo di 10 min. Questo tempo di lavaggio riflette il tempo di dissociazione del peptide minime richiesto per l&#39;impiego di questi anticorpi in diversi dosaggi di immuno-mass spectrometry corrente. Analisi cinetica di legame dell&#39;anticorpo-peptide di risonanza plasmonica di superficie (SPR) hanno dimostrato che gli anticorpi selezionati erano di alta affinit&agrave; e, soprattutto, ha avuto costanti di dissociazione basso. Questo metodo, chiamato MALDI immunoscreening (MiSCREEN), permette quindi di screening rapido e selezione degli anticorpi anti-peptide ad alta affinit&agrave; che sono utili per una variet&agrave; di applicazioni immunoproteomics. Per dimostrare la loro utilit&agrave; funzionale nelle analisi immuno-mass spectrometry, abbiamo utilizzato la RabMAbs selezionata, purificato per arricchire i peptidi naturali (triptico) da plasma umano digerito.

MALDI immunoscreening (MiSCREEN): un metodo per la selezione di anticorpi monoclonali anti-peptide per l&#39;utilizzo in immunoproteomics.

&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x9078;&#x5B9A;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x30E2;&#x30CE;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30CA;&#x30EB;&#x6297;&#x4F53; (Mab) &#x306E;&#x30B9;&#x30B1;&#x30FC;&#x30E9;&#x30D6;&#x30EB;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C9;&#x30FC;&#x30DE;&#x57F9;&#x990A;&#x4E0A;&#x6E05;&#x4E2D;&#x306B;&#x9AD8;&#x3044;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x6297;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9; Mab &#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x6297;&#x4F53;&#x306F;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x304B;&#x3089;&#x7D9A;&#x3044;&#x3066;&#x78C1;&#x6C17;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3; &#x30D3;&#x30FC;&#x30BA;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6355;&#x7372;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6D17;&#x6D44;&#x624B;&#x9806;&#x304C;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x30A2;&#x30A6;&#x30C8;&#x3057;&#x305F;&#x5F8C;&#x3001;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x6B8B;&#x308A;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x304B;&#x3089;&#x30D3;&#x30FC;&#x30BA;&#x3092;&#x6EB6;&#x51FA;&#x3057;&#x3001;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x652F;&#x63F4;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B6;&#x30FC;&#x8131;&#x96E2;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x5316;&#x98DB;&#x884C;&#x6642;&#x9593; &#xFF08;MALDI-TOF&#xFF09; &#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308B; (MS) &#x304C;&#x691C;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x3053;&#x3046;&#x3057;&#x3066;&#x521D;&#x611F;&#x67D3;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x53CD;&#x6620;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x5358;&#x4E00;&#x6297;&#x539F;&#x3068;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E; 1 &#x4FA1;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3092;&#x8A31;&#x53EF;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3; &#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30BA;&#x304B;&#x3089;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8; &#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3057;&#x3001;10 &#x5206;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x306E;&#x6D17;&#x6D44;&#x4E2D;&#x306B;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x3092;&#x4FDD;&#x6301;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x305F;&#x6297;&#x4F53;&#x53D6;&#x5F97;&#x9069;&#x5207;&#x306A; m/z &#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9; MS &#x4FE1;&#x53F7;&#x306E;&#x5F37;&#x3055;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8B58;&#x5225;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x6D17;&#x6D44;&#x6642;&#x9593;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x73FE;&#x5728;&#x514D;&#x75AB;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x8A66;&#x91D1;&#x306E;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x5229;&#x7528;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x6700;&#x5C0F;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x89E3;&#x96E2;&#x6642;&#x9593;&#x304C;&#x53CD;&#x6620;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x901F;&#x5EA6;&#x8AD6;&#x7684;&#x89E3;&#x6790;&#x306E;&#x8868;&#x9762;&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30E2;&#x30F3;&#x5171;&#x9CF4; (SPR) &#x3092;&#x9078;&#x629E;&#x3057;&#x305F;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x304C;&#x9AD8;&#x304F;&#x6700;&#x3082;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x306F;&#x3001;&#x4F4E;&#x89E3;&#x96E2;&#x5B9A;&#x6570;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3001;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x6297;&#x4F53;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x3002;MALDI &#x691C;&#x7D22; (MiSCREEN) &#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x308B;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x6025;&#x901F;&#x306A;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x306E;&#x5404;&#x7A2E; immunoproteomics &#x7528;&#x9014;&#x306B;&#x4FBF;&#x5229;&#x3067;&#x3059;&#x9AD8;&#x3044;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x6297;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x514D;&#x75AB;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3067;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x30E6;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30EA;&#x30C6;&#x30A3;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x6D88;&#x5316;&#x3072;&#x3068;&#x8840;&#x6F3F;&#x304B;&#x3089;&#x81EA;&#x7136; (&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30F3;) &#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x8C4A;&#x304B;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x306B;&#x9078;&#x629E;&#x3057;&#x305F;&#x3001;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3055;&#x308C;&#x305F; RabMAbs &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

MALDI &#x691C;&#x7D22; (MiSCREEN): immunoproteomics &#x3067;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x6297;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x3002;

&#xC2EC;&#xC0AC; &#xBC0F; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xAD00;&#xB828; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD074;&#xB860; &#xD56D; &#xCCB4; (mAbs)&#xC758; &#xC120;&#xD0DD;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD655;&#xC7A5; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Hybridoma supernatants&#xC5D0; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; anti-peptide Mabs&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xD56D; &#xCCB4; &#xC790;&#xAE30; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xBE44;&#xC988; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD2B9;&#xC815; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xB4A4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCEA1;&#xCC98;&#xB41C;. &#xC138;&#xCC99; &#xB2E8;&#xACC4;&#xB97C; &#xCD08;&#xACFC;, &#xB098;&#xBA38;&#xC9C0; &#xBC14;&#xC6B4;&#xB4DC; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xBE44;&#xC988;&#xC5D0;&#xC11C; eluted &#xB418;&#xC5C8;&#xACE0; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4; &#xBCF4;&#xC870; &#xB808;&#xC774;&#xC800; &#xD0C8; &#xCC29;/&#xC774;&#xC628;&#xD654; &#xBE44;&#xD589; &#xC2DC;&#xAC04; (TOF MALDI) &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; (MS)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xAC10;&#xC9C0;. &#xC774; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xC695;&#xB9DD; &#xBCF4;&#xB2E4;&#xB294; &#xD56D; &#xCCB4; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xBC18;&#xC601; &#xD558;&#xB294; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xC5EC;&#xB7EC;&#xCC28;&#xB840; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD56D; &#xC6D0; &#xCE21;&#xC815; &#xD5C8;&#xC6A9;. &#xC194;&#xB8E8;&#xC158; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xC0C1; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB97C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0; &#xC138;&#xCC99; &#xCD5C;&#xC18C; 10 &#xBD84; &#xB3D9;&#xC548; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC744; &#xC720;&#xC9C0;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xD56D; &#xCCB4; &#xD68D;&#xB4DD; &#xC801;&#xC808; &#xD55C; m/z &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; MS &#xC2E0;&#xD638;&#xC758; &#xAC15;&#xB3C4; &#xC758;&#xD574; &#xD655;&#xC778; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC138;&#xCC99; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xD604;&#xC7AC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC774; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xCD5C;&#xC18C; &#xD3A9;&#xD0C0;&#xC774;&#xB4DC; &#xBD84;&#xB9AC; &#xC2DC;&#xAC04;&#xC744; &#xBC18;&#xC601; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD45C;&#xBA74; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4;&#xBAAC; &#xACF5;&#xBA85; (SPR)&#xB294; &#xC120;&#xD0DD; &#xB41C; &#xD56D; &#xCCB4; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4;&#xC758; &#xD588;&#xB2E4; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0;, &#xAC00;&#xC7A5; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC83;&#xC740;, &#xB0AE;&#xC740; &#xBD84;&#xB9AC; &#xC0C1;&#xC218;&#xB97C; &#xD588;&#xB2E4; &#xD558; &#xC5EC; &#xD56D; &#xCCB4; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC758; &#xC6B4;&#xB3D9; &#xBD84;&#xC11D;. MALDI immunoscreening (MiSCREEN) &#xC774;&#xB77C;&#xB294;&#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xC2E0;&#xC18D;&#xD55C; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xBC0F; &#xC720;&#xC6A9;&#xD55C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; immunoproteomics &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; anti-peptide &#xD56D; &#xCCB4;&#xC758; &#xC120;&#xD0DD;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC720;&#xD2F8;&#xB9AC;&#xD2F0;&#xB97C; &#xC124;&#xBA85; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC18C;&#xD654; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC790;&#xC5F0; (tryptic) &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB97C; &#xD48D;&#xBD80; &#xD558; &#xAC8C; &#xC120;&#xD0DD;&#xD55C;, &#xC21C;&#xD654; Rabmabs&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

MALDI immunoscreening (MiSCREEN): immunoproteomics&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; anti-peptide &#xB2E8;&#xC77C; &#xD074;&#xB860; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC758; &#xC120;&#xD0DD; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;.

Se describe un m&eacute;todo escalable para la detecci&oacute;n y selecci&oacute;n de p&eacute;ptidos espec&iacute;ficos los anticuerpos monoclonales (mAbs). Para identificar mAbs anti-peptide alta afinidad en sobrenadantes de hibridoma, anticuerpos fueron capturados por afinidad magn&eacute;tica granos seguidos por la Uni&oacute;n de p&eacute;ptidos espec&iacute;ficos de soluci&oacute;n. Despu&eacute;s de tiempo de pasos de lavado, los p&eacute;ptidos enlazados restantes fueron eluidos de los granos y detectados por espectrometr&iacute;a de masas (MALDI-TOF) tiempo de vuelo (MS) de l&aacute;ser asistida por matriz desorci&oacute;n/ionizaci&oacute;n. Esto permiti&oacute; a medida de las interacciones monovalentes de p&eacute;ptidos con solo ant&iacute;geno sitios de uni&oacute;n de los anticuerpos, reflejando as&iacute; la afinidad del anticuerpo en lugar de avidez. Se identificaron anticuerpos que se unen a p&eacute;ptidos de destino de la fase de soluci&oacute;n y retenerlos durante el lavado durante un m&iacute;nimo de 10 minutos por la fuerza de las se&ntilde;ales de p&eacute;ptido MS apropiado m/z obtenidas. Este tiempo de lavado refleja el tiempo de la disociaci&oacute;n de p&eacute;ptido m&iacute;nimos requerido para el uso de estos anticuerpos en diversos estudios actuales de la inmuno-espectrometr&iacute;a de masas. An&aacute;lisis cin&eacute;tico de uni&oacute;n del anticuerpo-p&eacute;ptido por resonancia de plasm&oacute;n superficial (SPR) mostraron que los anticuerpos seleccionados fueron de alta afinidad y, lo m&aacute;s importante, ten&iacute;an constantes de disociaci&oacute;n bajo. Este m&eacute;todo, llamado MALDI immunoscreening (MiSCREEN), as&iacute; permite la r&aacute;pida detecci&oacute;n y selecci&oacute;n de anticuerpos anti-peptide de alta afinidad que son &uacute;tiles para una variedad de aplicaciones de immunoproteomics. Para demostrar su utilidad funcional en ensayos de inmuno-espectrometr&iacute;a de masas, utilizamos el RabMAbs seleccionado, purificada para enriquecer p&eacute;ptidos (tr&iacute;pticos) naturales de plasma humano digerido.

MALDI immunoscreening (MiSCREEN): un m&eacute;todo para la selecci&oacute;n de anti-peptide anticuerpos monoclonales para el uso en immunoproteomics.

&#x7A33;&#x5B9A;&#x540C;&#x4F4D;&#x7D20;&#x6807;&#x51C6;&#x5E76;&#x901A;&#x8FC7; antipeptide &#x6297;&#x4F53; (SISCAPA) &#x592B;&#x5987;&#x4EB2;&#x548C;&#x5BCC;&#x96C6;&#x7684;&#x80BD;&#x4E0E;&#x7A33;&#x5B9A;&#x540C;&#x4F4D;&#x7D20;&#x7A00;&#x91CA;&#x548C;&#x68C0;&#x6D4B;&#x6355;&#x83B7;&#x591A;&#x53CD;&#x5E94;&#x76D1;&#x6D4B;&#x8D28;&#x8C31;&#x63D0;&#x4F9B;&#x5176;&#x5404;&#x81EA;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x80BD;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4EE3;&#x5B55;&#x6BCD;&#x4EB2;&#x7684;&#x5B9A;&#x91CF;&#x6D4B;&#x91CF;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x62A5;&#x544A;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4E86;&#x53EF;&#x884C;&#x6027;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x786E;&#x5B9A;&#x9002;&#x5408;&#x505A; SISCAPA &#x68C0;&#x6D4B;&#x6297;&#x4F53;&#x751F;&#x4EA7;&#x7684;&#x6210;&#x529F;&#x7387;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x544A;&#x77E5;&#x5927;&#x578B;&#x68C0;&#x6D4B;&#x53D1;&#x5C55;&#x6218;&#x7565;&#x3002;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x6D41;&#x8BBE;&#x8BA1;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5305;&#x62EC;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E94;&#x4E2A; proteotypic &#x80BD;&#x86CB;&#x767D;&#x5355;&#x76EE;&#x6807;&#x88AB;&#x7528;&#x6765;&#x8FDB;&#x884C;&#x514D;&#x75AB;&#x63A5;&#x79CD;&#xFF0C;&#x4E2A;&#x522B;&#x5154;&#x591A;&#x91CD;&#x514D;&#x75AB;&#x7B56;&#x7565;&#x3002;&#x603B;&#x5171;&#x6709; 403 proteotypic &#x80F0;&#x9176;&#x80BD;&#x4EE3;&#x8868; 89 &#x86CB;&#x767D;&#x6307;&#x6807;&#x88AB;&#x7528;&#x4F5C;&#x6297;&#x539F;&#x3002;Antipeptide &#x6297;&#x4F53;&#x9176;&#x8054;&#x514D;&#x75AB;&#x5438;&#x9644;&#x6CD5;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x6CD5;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x548C; 220 antipeptide &#x6297;&#x4F53;&#x8868;&#x793A; 89 &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x88AB;&#x9009;&#x4E3A;&#x4EB2;&#x548C;&#x7EAF;&#x5316;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x662F;&#x5BF9;&#x5176;&#x6027;&#x80FD; SISCAPA &#x591A;&#x53CD;&#x5E94;&#x76D1;&#x6D4B;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x4F7F;&#x7528;&#x80F0;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x6D88;&#x5316;&#x4EBA;&#x8840;&#x6D46;&#x77E9;&#x9635;&#x4E2D;&#x3002;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x534A;&#x6570;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x662F;&#x80FD;&#x591F;&#x68C0;&#x6D4B;&#x76EE;&#x6807;&#x80BD;&#x6D53;&#x5EA6;&#x5C0F;&#x4E8E; 0.5 fmol/&mu;l &#x4E2D;&#x8840;&#x6D46;&#x86CB;&#x767D;&#x6D53;&#x5EA6;&#x5C0F;&#x4E8E; 100 ng/ml &#x7684;&#x5BF9;&#x5E94;&#x3002;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x4E94;&#x80BD;&#x6297;&#x539F;&#x7684;&#x6218;&#x7565;&#x662F;&#x6210;&#x529F;&#x5730;&#x5728;&#x6B64;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#x751F;&#x6210;&#x5DE5;&#x4F5C; 100%&#x7684;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x542B;&#x91CF;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;&#x5355;&#x4E2A;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x5236;&#x5B9A;&#x6570;&#x4EE5;&#x767E;&#x8BA1;&#x7684;&#x6BCF;&#x5E74;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x548C;&#x5141;&#x8BB8; SISCAPA &#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x6210;&#x672C;&#x6548;&#x76CA;&#x9AD8;&#x4EE3;&#x7684;&#x89C4;&#x5212;&#x662F;&#x53EF;&#x884C;&#x7684;&#x3002;

&#x4F7F;&#x7528;&#x80BD;&#x4EB2;&#x548C;&#x57FA;&#x4E8E;&#x8D28;&#x8C31;&#x7684;&#x5927;&#x89C4;&#x6A21;&#x5B9A;&#x91CF;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EC4;&#x5B66;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x53D1;&#x5C55;&#x7684;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x3002;

Stable isotope standards and capture by antipeptide antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by multiple reaction monitoring mass spectrometry to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. In this report, we describe a feasibility study to determine the success rate for production of suitable antibodies for SISCAPA assays in order to inform strategies for large-scale assay development. A workflow was designed that included a multiplex immunization strategy in which up to five proteotypic peptides from a single protein target were used to immunize individual rabbits. A total of 403 proteotypic tryptic peptides representing 89 protein targets were used as immunogens. Antipeptide antibody titers were measured by ELISA and 220 antipeptide antibodies representing 89 proteins were chosen for affinity purification. These antibodies were characterized with respect to their performance in SISCAPA-multiple reaction monitoring assays using trypsin-digested human plasma matrix. More than half of the assays generated were capable of detecting the target peptide at concentrations of less than 0.5 fmol/Î¼l in human plasma, corresponding to protein concentrations of less than 100 ng/ml. The strategy of multiplexing five peptide immunogens was successful in generating a working assay for 100% of the targeted proteins in this evaluation study. These results indicate it is feasible for a single laboratory to develop hundreds of assays per year and allow planning for cost-effective generation of SISCAPA assays.

Evaluation of large scale quantitative proteomic assay development using peptide affinity-based mass spectrometry.

Normes des isotopes stables et la capture par des anticorps antipeptides (SISCAPA) d&#x26;#39;enrichissement d&#x26;#39;affinit&#xE9; couples de peptides avec la dilution des isotopes stables et la d&#xE9;tection par spectrom&#xE9;trie de masse de r&#xE9;action multiples surveillance pour fournir une mesure quantitative de peptides en tant que substituts pour leurs prot&#xE9;ines respectives. Dans ce rapport, nous d&#xE9;crivons une &#xE9;tude de faisabilit&#xE9; afin de d&#xE9;terminer le taux de r&#xE9;ussite pour la production d&#x26;#39;anticorps appropri&#xE9;s pour les dosages SISCAPA afin d&#x26;#39;informer les strat&#xE9;gies de d&#xE9;veloppement test &#xE0; grande &#xE9;chelle. Un flux de travail a &#xE9;t&#xE9; con&#xE7;u comprenant une strat&#xE9;gie d&#x26;#39;immunisation multiplexage dans lequel jusqu&#x26;#39;&#xE0; cinq peptides prot&#xE9;otypiques d&#x26;#39;une cible unique prot&#xE9;ine ont &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9;s pour immuniser des lapins individuels. Un total de 403 prot&#xE9;otypiques peptides tryptiques repr&#xE9;sentant 89 cibles prot&#xE9;iques ont &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9;s comme immunog&#xE8;nes. Les titres d&#x26;#39;anticorps ont &#xE9;t&#xE9; antipeptide mesur&#xE9;e par ELISA et 220 anticorps antipeptides repr&#xE9;sentant 89 prot&#xE9;ines ont &#xE9;t&#xE9; choisis pour la purification par affinit&#xE9;. Ces anticorps ont &#xE9;t&#xE9; caract&#xE9;ris&#xE9;s &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;gard de leur performance dans SISCAPA-multiples tests de contr&#xF4;le de la r&#xE9;action en utilisant la trypsine-plasma humain dig&#xE9;r&#xE9; la matrice. Plus de la moiti&#xE9; des dosages g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9;s sont capables de d&#xE9;tecter le peptide cible &#xE0; des concentrations inf&#xE9;rieures &#xE0; 0,5 fmol / pi dans le plasma humain, qui correspond &#xE0; la concentration de prot&#xE9;ines de moins de 100 ng / ml. La strat&#xE9;gie de multiplexage cinq immunog&#xE8;nes peptidiques a r&#xE9;ussi &#xE0; g&#xE9;n&#xE9;rer un test de travail pour 100% des prot&#xE9;ines cibl&#xE9;es dans cette &#xE9;tude d&#x26;#39;&#xE9;valuation. Ces r&#xE9;sultats indiquent qu&#x26;#39;il est possible pour un seul laboratoire &#xE0; d&#xE9;velopper des centaines de tests par an et permettre la planification de rapport co&#xFB;t-efficacit&#xE9; des tests de g&#xE9;n&#xE9;ration SISCAPA.

Evaluation de d&#xE9;veloppement &#xE0; grande &#xE9;chelle quantitative Assay prot&#xE9;omique utilisant la spectrom&#xE9;trie de masse peptide d&#x26;#39;affinit&#xE9; &#xE0; base de

Stabile Isotop Normen und Erfassen von antipeptide Antik&ouml;rpern (SISCAPA) Paare Affinit&auml;t Anreicherung von Peptiden mit stabilen Isotope Dilution und Erkennung durch mehrere Reaktion &Uuml;berwachung Massenspektrometrie um quantitative Messung von Peptiden als Ersatzzeichen f&uuml;r ihre jeweiligen Proteine zu bieten. In diesem Bericht beschreiben wir eine Machbarkeitsstudie, um die Erfolgsrate f&uuml;r die Produktion von passenden Antik&ouml;rpern f&uuml;r SISCAPA Assays zu ermitteln, um Strategien f&uuml;r eine gro&szlig; angelegte Assayentwicklung zu informieren. Ein Workflow wurde entworfen, die eine multiplex Immunisierung-Strategie enthalten, in der bis zu f&uuml;nf Proteotypic Peptide aus ein einzelnes Protein-Ziel verwendet wurden, um einzelne Kaninchen zu immunisieren. Insgesamt 403 Proteotypic tryptic Peptide, 89 Protein Ziele darstellt, wurden als Immunogenen verwendet. Antipeptide Antik&ouml;rper-Titer gemessen wurden von ELISA und 220 antipeptide Antik&ouml;rper, die 89 Proteine wurden f&uuml;r Affinit&auml;tsreinigung ausgew&auml;hlt. Diese Antik&ouml;rper wurden in Bezug auf ihre Leistung im SISCAPA-Multiple Reaktion &Uuml;berwachung Assays mit Trypsin verdaut Blutplasma Matrix charakterisiert. Mehr als die H&auml;lfte der generierten Tests waren Aufsp&uuml;ren von das Ziel-Peptid bei Konzentrationen von weniger als 0,5 Fmol/&mu;l in menschlichem Plasma Protein-Konzentrationen von weniger als 100 ng/ml entspricht. Die Strategie der Multiplexen f&uuml;nf Peptid Immunogenen war erfolgreich eine arbeiten-Assay f&uuml;r 100 % der gezielten Proteine in diese Evaluationsstudie zu generieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass es f&uuml;r ein einzelnes Labor entwickeln Hunderte Proben pro Jahr und erm&ouml;glichen eine Planung f&uuml;r kosteng&uuml;nstige Generation SISCAPA Assays durchf&uuml;hrbar ist.

Bewertung der gro&szlig; angelegte quantitative Proteomic-Assay-Entwicklung mit Peptid Affinit&auml;t-basierte Massenspektrometrie.

Stabile agli standard dell&#39;isotopo e catturare dall&#39;arricchimento di affinit&agrave; coppie anticorpi antipeptide (SISCAPA) di peptidi con diluizione isotopica stabile e rilevamento di reazione pi&ugrave; monitoraggio spettrometria di massa per fornire una misura quantitativa di peptidi come surrogati per loro rispettive proteine. In questo rapporto, descriviamo un studio di fattibilit&agrave; per determinare il tasso di successo per la produzione di anticorpi adatti per SISCAPA dosaggi al fine di informare le strategie per lo sviluppo di test su larga scala. Un flusso di lavoro &egrave; stato progettato che comprendeva una strategia di immunizzazione multiplex in cui fino a cinque proteotypic peptidi da un singola proteina bersaglio sono stati utilizzati per immunizzare i conigli individuali. Un totale di 403 proteotypic triptico peptidi che rappresenta 89 destinazioni della proteina sono stati utilizzati come immunogeni. Antipeptide anticorpali sono stati misurati con ELISA e 220 anticorpi antipeptide che rappresentano le 89 proteine sono stati scelti per la purificazione di affinit&agrave;. Questi anticorpi sono stati caratterizzati rispetto alla loro performance nella reazione SISCAPA-multiplo monitoraggio analisi utilizzando la matrice di plasma umano digerite tripsina. Pi&ugrave; della met&agrave; dei saggi generati sono stati in grado di rilevare il peptide di destinazione in concentrazioni inferiori a 0,5 fmol/&mu;l a nel plasma umano, corrispondente a concentrazioni di proteina di meno di 100 ng/ml. La strategia di multiplazione cinque peptide immunogeni riusciva a generare un dosaggio di lavoro per il 100% delle proteine mirati in questo studio di valutazione. Questi risultati indicano che &egrave; fattibile per un unico laboratorio sviluppare centinaia di analisi all&#39;anno e consentire la pianificazione per la generazione di conveniente SISCAPA dosaggi.

Valutazione dello sviluppo di Analisi proteomic quantitativa su larga scala utilizzando la spettrometria di massa basata su affinit&agrave; del peptide.

&#x5B89;&#x5B9A;&#x540C;&#x4F4D;&#x4F53;&#x306E;&#x57FA;&#x6E96;&#x3068;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x4EE3;&#x7406;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x53CD;&#x5FDC;&#x30E2;&#x30CB;&#x30BF;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5B89;&#x5B9A;&#x540C;&#x4F4D;&#x4F53;&#x5E0C;&#x91C8;&#x3057;&#x3001;&#x691C;&#x51FA;&#x3057;&#x305F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x6297;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x6297;&#x4F53;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x6355;&#x6349;&#xFF08;SISCAPA&#xFF09;&#x30AB;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EB;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x6FC3;&#x7E2E;&#x3002;&#x672C;&#x7A3F;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x5927;&#x898F;&#x6A21;&#x306A;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x958B;&#x767A;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6226;&#x7565;&#x3092;&#x901A;&#x77E5;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;SISCAPA&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306B;&#x9069;&#x3057;&#x305F;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x7523;&#x751F;&#x306E;&#x6210;&#x529F;&#x7387;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x30B8;&#x30D3;&#x30EA;&#x30C6;&#x30A3;&#xB7;&#x30B9;&#x30BF;&#x30C7;&#x30A3;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30EF;&#x30FC;&#x30AF;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x6700;&#x5927;5 proteotypic&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x500B;&#x3005;&#x306E;&#x30A6;&#x30B5;&#x30AE;&#x3092;&#x514D;&#x75AB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x591A;&#x91CD;&#x514D;&#x75AB;&#x6226;&#x7565;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; 89&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x8868;&#x3059;403 proteotypic&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30F3;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x5408;&#x8A08;&#x304C;&#x514D;&#x75AB;&#x539F;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6297;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x6297;&#x4F53;&#x4FA1;&#x3092;ELISA&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3001;89&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x8868;&#x3059;220&#x6297;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x6297;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30FC;&#x7CBE;&#x88FD;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9078;&#x3070;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x6297;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30F3;&#x6D88;&#x5316;&#x3057;&#x305F;&#x30D2;&#x30C8;&#x8840;&#x6F3F;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;SISCAPA-&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EB;&#x30EA;&#x30A2;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x30E2;&#x30CB;&#x30BF;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306B;&#x304A;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x6027;&#x80FD;&#x306B;&#x95A2;&#x3057;&#x3066;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x534A;&#x5206;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x306F;100 ng / ml&#x4EE5;&#x4E0B;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x30D2;&#x30C8;&#x8840;&#x6F3F;&#x4E2D;&#x3067;0.5&#x672A;&#x6E80;fmol&#x306E;/&#x3BC;L&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3067;&#x6A19;&#x7684;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x591A;&#x91CD;&#x5316;5&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x514D;&#x75AB;&#x539F;&#x306E;&#x6226;&#x7565;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x8A55;&#x4FA1;&#x8A66;&#x9A13;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6A19;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;100&#xFF05;&#x306E;&#x4F5C;&#x696D;&#x5206;&#x6790;&#x306E;&#x751F;&#x6210;&#x306B;&#x6210;&#x529F;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x5BA4;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x5E74;&#x9593;&#x6570;&#x767E;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x3001;SISCAPA&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x8CBB;&#x7528;&#x5BFE;&#x52B9;&#x679C;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x4E16;&#x4EE3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8A08;&#x753B;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x5927;&#x898F;&#x6A21;&#x306E;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30AA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x958B;&#x767A;

&#xC548;&#xC815; &#xB3D9;&#xC704; &#xC6D0;&#xC18C; &#xD45C;&#xC900; &#xD558; &#xACE0; &#xAC01;&#xAC01; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xB300;&#xB9AC; &#xBAA8; &#xC54C;&#xC120;&#xC73C;&#xB85C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xC815;&#xB7C9;&#xC801; &#xCE21;&#xC815;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558;&#xB294; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xBC18;&#xC751;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC548;&#xC815; &#xB3D9;&#xC704; &#xC6D0;&#xC18C; &#xD76C;&#xC11D; &#xBC0F; &#xAC10;&#xC9C0;&#xC640; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; antipeptide &#xD56D; &#xCCB4; (SISCAPA) &#xCEE4;&#xD50C; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xB18D;&#xCD95; &#xD558; &#xC5EC; &#xCEA1;&#xCC98;&#xD558;&#xC2ED;&#xC2DC;&#xC624;. &#xC774; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB300;&#xADDC;&#xBAA8; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC804;&#xB7B5;&#xC744; &#xC54C;&#xB9AC;&#xAE30; &#xC704;&#xD574;&#xC11C;&#xB294; SISCAPA &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC801;&#xD569; &#xD55C; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC758; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC131;&#xACF5;&#xB960;&#xC744; &#xACB0;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xD0C0;&#xB2F9;&#xC131; &#xC870;&#xC0AC; &#xAE30;&#xC220;. &#xC6CC;&#xD06C;&#xD50C;&#xB85C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB300;&#xC0C1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xD1A0;&#xB07C; &#xBA74;&#xC5ED;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB41C; 5 proteotypic &#xCD5C;&#xB300; &#xBA40;&#xD2F0;&#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; &#xBA74;&#xC5ED; &#xC804;&#xB7B5;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC124;&#xACC4; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD3A9; &#xD2F0; 403 proteotypic tryptic &#xB4DC; 89 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBAA9;&#xD45C;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xCD1D; immunogens&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. Antipeptide &#xD56D; &#xCCB4; titers ELISA&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCE21;&#xC815; &#xD558; &#xACE0; 89 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; 220 antipeptide &#xD56D; &#xCCB4; &#xCE5C; &#xD654;&#xB825; &#xC815;&#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC120;&#xC815; &#xB410;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD56D; &#xCCB4; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xD2B8;&#xB9BD; &#xC2E0; &#xC18C;&#xD654; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; SISCAPA-&#xB2E4;&#xC911; &#xBC18;&#xC751;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC790;&#xC2E0;&#xC758; &#xC2E4;&#xC801;&#xC5D0; &#xAD00;&#xD558;&#xC5EC; &#xD2B9;&#xC9D5; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC0DD;&#xC131; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC758; &#xC808;&#xBC18; &#xC774;&#xC0C1;&#xC774; &#xBBF8;&#xB9CC; 0.5 fmol/&mu; l&#xC758; &#xB18D;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xC0C1; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB18D;&#xB3C4;&#xAC00; 100 ng/ml&#xC5D0; &#xD574;&#xB2F9; &#xD558;&#xB294; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8;&#xC5D0; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC774; &#xAC00;&#xB2A5; &#xD588;&#xB2E4;. 5 &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; immunogens &#xBA40;&#xD2F0;&#xD50C;&#xB809;&#xC2F1;&#xC758; &#xC804;&#xB7B5; &#xD3C9;&#xAC00; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xB300;&#xC0C1;&#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; 100%&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC791;&#xC5C5; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC0DD;&#xC131;&#xC5D0; &#xC131;&#xACF5; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774; &#xACB0;&#xACFC; &#xC218;&#xBC31; &#xB144; &#xB2F9; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xBC0F; SISCAPA &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC758; &#xBE44;&#xC6A9; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xC0DD;&#xC131;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xACC4;&#xD68D;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC2E4;&#xD604; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xAE30;&#xBC18;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB300;&#xADDC;&#xBAA8; &#xC591;&#xC801; proteomic &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC758; &#xD3C9;&#xAC00;.

Las normas de is&#xF3;topos estables y la captura de anticuerpos antip&#xE9;ptido (SISCAPA) enriquecimiento de las parejas de afinidad de los p&#xE9;ptidos con una diluci&#xF3;n de is&#xF3;topos estables y la detecci&#xF3;n por espectrometr&#xED;a de masas de reacci&#xF3;n m&#xFA;ltiple de control para proporcionar una medici&#xF3;n cuantitativa de los p&#xE9;ptidos como sustitutos de sus respectivas prote&#xED;nas. En este reporte se describe un estudio de factibilidad para determinar la tasa de &#xE9;xito para la producci&#xF3;n de anticuerpos adecuados para los ensayos de SISCAPA con el fin de informar a las estrategias para el desarrollo de ensayos a gran escala. Un flujo de trabajo fue dise&#xF1;ado que incluye una estrategia de inmunizaci&#xF3;n multiplex en el que hasta cinco p&#xE9;ptidos proteotypic de una sola prote&#xED;na diana se utiliza para inmunizar conejos individuales. Un total de 403 p&#xE9;ptidos tr&#xED;pticos proteotypic que representan 89 dianas proteicas fueron utilizados como inmun&#xF3;genos. Los t&#xED;tulos de anticuerpos antip&#xE9;ptido se midieron por ELISA y 220 anticuerpos antip&#xE9;ptido que representan 89 prote&#xED;nas fueron elegidos para la purificaci&#xF3;n de afinidad. Estos anticuerpos se caracterizaron con respecto a su rendimiento en SISCAPA-m&#xFA;ltiples ensayos de reacci&#xF3;n de seguimiento utilizando tripsina digerido humano matriz de plasma. M&#xE1;s de la mitad de los ensayos generados fueron capaces de detectar el p&#xE9;ptido diana a concentraciones de menos de 0,5 fmol / l en el plasma humano, correspondiente a las concentraciones de prote&#xED;na de menos de 100 ng / ml. La estrategia de multiplexaci&#xF3;n cinco inmun&#xF3;genos pept&#xED;dicos tuvo &#xE9;xito en la generaci&#xF3;n de un ensayo de trabajo para el 100% de las prote&#xED;nas espec&#xED;ficas en este estudio de evaluaci&#xF3;n. Estos resultados indican que es factible para un solo laboratorio para desarrollar cientos de ensayos por a&#xF1;o y permitir la planificaci&#xF3;n para que sea rentable la generaci&#xF3;n de ensayos SISCAPA.

Evaluaci&#xF3;n de las inversiones a gran escala ensayo cuantitativo de Prote&#xF3;mica Con p&#xE9;ptido de afinidad basada en la espectrometr&#xED;a de masas

&#x65E0;&#x6CD5;&#x91CF;&#x5316;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x548C;&#x5177;&#x6709;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x9AD8;&#x3001; &#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x548C;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x662F;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x5FD7;&#x7269;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x74F6;&#x9888;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4EE5;&#x524D;&#x8868;&#x660E;&#x514D;&#x75AB;&#x4EB2;&#x548C;&#x5BCC;&#x96C6;&#x4F7F;&#x7528; anti-peptide &#x6297;&#x4F53; (SISCAPA) &#x8026;&#x5408;&#x5230; MRM MS &#x4EA7;&#x751F;&#x514D;&#x75AB; MRM &#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x8FDB;&#x884C;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x6765;&#x91CF;&#x5316;&#x8840;&#x6D46;&#x4E2D;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x5177;&#x6709;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x9AD8;&#x3001; &#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x3001; &#x548C;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x4E4B;&#x95F4;&#x6027;&#x80FD;&#x7684;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B21;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x8BC4;&#x4F30;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528; (8-plex) &#x514D;&#x75AB; MRM MS &#x4E09;&#x4E2A;&#x72EC;&#x7ACB;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x4E2D;&#x3002;&#x5728;&#x8BC4;&#x4F30;&#x4E86;&#x5BF9;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x7684;&#x7B80;&#x5386;&#x3001; LOD&#x3001; LOQ &#x548C;&#x6062;&#x590D;&#x5904;&#x7406;&#x548C;&#x5206;&#x6790;&#x7684;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x6B65;&#x9AA4;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x8FDB;&#x884C;&#x5206;&#x9636;&#x6BB5;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;&#x68C0;&#x6D4B;&#x9650;&#x662F;&#x8840;&#x6D46;&#x7684;&#x5904;&#x4E8E;&#x6216;&#x4F4E;&#x4E8E; 1 ng/mL &#x4E3A; 30 uL &#x6D4B;&#x5B9A;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x3002;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x53EF;&#x91CD;&#x590D;&#x6027;&#x662F;&#x53EF;&#x4EE5;&#x63A5;&#x53D7;&#x7684;&#x6838;&#x67E5;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x4E2D;&#x4F4D;&#x6570;&#x5185;-&#x548C;&#x8DE8;-laboratory LOQ &#x7684; 11%&#x4EE5;&#x4E0A;&#x7684; CVs &#x548C; &lt; 14%&#xFF0C;&#x5206;&#x522B;&#x4E3A;&#x6574;&#x4E2A;&#x514D;&#x75AB;-MRM-&#x8D28;&#x8C31;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x9176;&#x6D88;&#x5316;&#x7684;&#x8840;&#x6D46;&#x3002;&#x80F0;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x6D88;&#x5316;&#x548C;&#x5176;&#x6240;&#x9700;&#x6837;&#x54C1;&#x5904;&#x7406;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x53D8;&#x5316;&#x6700;&#x5927;&#x7684;&#x8D21;&#x732E;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x6D88;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x51CF;&#x5C11;&#x6062;&#x590D;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x591A;&#x80BD;&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x7A33;&#x5B9A;&#x540C;&#x4F4D;&#x7D20;&#x6807;&#x8BB0;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5185;&#x90E8;&#x6807;&#x51C6;&#x4E3A;&#x7A33;&#x5B9A;&#x540C;&#x4F4D;&#x7D20;&#x6807;&#x8BB0;&#x591A;&#x80BD;&#x51E0;&#x4E4E;&#x5360;&#x5728;&#x6D88;&#x5316;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x7684;&#x635F;&#x5931;&#x52A0;&#x500D;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x4E3A;&#x6B64;&#x540C;&#x65F6;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x63D0;&#x9AD8; 5%&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x7684;&#x514D;&#x75AB;-MRM-&#x8D28;&#x8C31;&#x8DE8;&#x72EC;&#x7ACB;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x53EF;&#x91CD;&#x73B0;&#xFF0C;&#x5E76;&#x6709;&#x6F5C;&#x529B;&#x5E94;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x91C7;&#x7528;&#x7684;&#x77E9;&#x9635;&#x4E00;&#x6837;&#x590D;&#x6742;&#x8840;&#x6D46;&#x4E2D;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x542B;&#x91CF;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x3002;

&#x98DF;&#x54C1;&#x836F;&#x54C1;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x7684;&#x81EA;&#x52A8;&#x5316;&#xFF0C;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x591A;&#x80BD;&#x514D;&#x75AB;&#x4EB2;&#x548C;&#x5BCC;&#x96C6;&#x8026;&#x5408;&#x5230;&#x591A;&#x4E2A;&#x53CD;&#x5E94;&#x76D1;&#x6D4B;&#x8D28;&#x8C31;&#x91CF;&#x5316;&#x8840;&#x6D46;&#x4E2D;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;

The inability to quantify large numbers of proteins in tissues and biofluids with high precision, sensitivity and throughput is a major bottleneck in biomarker studies. We previously demonstrated that coupling immunoaffinity enrichment using anti-peptide antibodies (SISCAPA) to MRM-MS produces immuno-MRM assays that can be multiplexed to quantify proteins in plasma with high sensitivity, specificity, and precision. Here we report the first systematic evaluation of the inter-laboratory performance of multiplexed (8-plex) immuno-MRM-MS in three independent labs. A staged study was carried out in which the effect of each processing and analysis step on assay CV, LOD, LOQ and recovery was evaluated. Limits of detection were at or below 1 ng/mL for the assayed proteins in 30 uL of plasma. Assay reproducibility was acceptable for verification studies, with median intra- and inter-laboratory CVs above the LOQ of 11% and <14%, respectively, for the entire immuno-MRM-MS assay process, including enzymatic digestion of plasma. Trypsin digestion and its requisite sample handling contributed the most to assay variability and reduced the recovery of target peptides from digested proteins. Using a stable isotope labeled protein as an internal standard instead of stable isotope labeled peptides to account for losses in the digestion process nearly doubled assay accuracy for this while improving assay precision 5%. Our results demonstrate that multiplexed immuno-MRM-MS can be made reproducible across independent laboratories and has the potential to be adopted widely for assaying proteins in matrices as complex as plasma.

Inter-laboratory evaluation of automated, multiplexed peptide immunoaffinity enrichment coupled to multiple reaction monitoring mass spectrometry for quantifying proteins in plasma.

L&#x26;#39;incapacit&#xE9; de quantifier un grand nombre de prot&#xE9;ines dans les tissus et biofluides avec une grande pr&#xE9;cision, la sensibilit&#xE9; et le d&#xE9;bit est un obstacle majeur dans les &#xE9;tudes de biomarqueurs. Nous avons d&#xE9;j&#xE0; d&#xE9;montr&#xE9; que le couplage d&#x26;#39;enrichissement d&#x26;#39;immunoaffinit&#xE9; utilisant des anticorps anti-peptide (SISCAPA) pour MRM-MS produit immuno-essais de GRM qui peuvent &#xEA;tre multiplex&#xE9;s pour quantifier les prot&#xE9;ines dans le plasma avec une grande sensibilit&#xE9;, la sp&#xE9;cificit&#xE9; et de pr&#xE9;cision. Nous rapportons ici la premi&#xE8;re &#xE9;valuation syst&#xE9;matique de la performance inter-laboratoires des multiplex (8-plex) immuno-MRM-MS dans trois laboratoires ind&#xE9;pendants. Une &#xE9;tude mise en sc&#xE8;ne a &#xE9;t&#xE9; r&#xE9;alis&#xE9;e dans lequel l&#x26;#39;effet de chaque traitement et l&#x26;#39;analyse &#xE9;tape sur le dosage CV, LOD, LOQ et la r&#xE9;cup&#xE9;ration a &#xE9;t&#xE9; &#xE9;valu&#xE9;e. Les limites de d&#xE9;tection &#xE9;taient &#xE9;gaux ou inf&#xE9;rieurs &#xE0; 1 ng / mL pour les prot&#xE9;ines dos&#xE9;es dans 30 uL de plasma. Reproductibilit&#xE9; du test &#xE9;tait acceptable pour les &#xE9;tudes de v&#xE9;rification, avec une m&#xE9;diane CV intra-et inter-laboratoire-dessus de la limite de quantification de 11% et &#x26;lt;14%, respectivement, pour le processus de dosage immuno-MRM-MS entier, y compris la digestion enzymatique du plasma. Digestion par la trypsine et sa manipulation de l&#x26;#39;&#xE9;chantillon requise contribu&#xE9; la variabilit&#xE9; test le plus &#xE0; la r&#xE9;cup&#xE9;ration et r&#xE9;duit de peptides cibles &#xE0; partir de prot&#xE9;ines dig&#xE9;r&#xE9;es. En utilisant une prot&#xE9;ine isotopes stables &#xE9;tiquet&#xE9;s comme une norme interne au lieu de peptides isotopes stables &#xE9;tiquet&#xE9;s pour tenir compte des pertes dans le processus de digestion a presque doubl&#xE9; la pr&#xE9;cision de dosage de ce tout en am&#xE9;liorant la pr&#xE9;cision du dosage de 5%. Nos r&#xE9;sultats d&#xE9;montrent que multiplex&#xE9;e immuno-MRM-MS peut &#xEA;tre fait reproductible dans des laboratoires ind&#xE9;pendants et a le potentiel pour &#xEA;tre largement adopt&#xE9;es pour le dosage de prot&#xE9;ines dans des matrices aussi complexe que le plasma.

Inter-laboratoires d&#x26;#39;&#xE9;valuation de la automatis&#xE9;, multiplex&#xE9;e enrichissement immunoaffinit&#xE9; Peptide coupl&#xE9;e &#xE0; la spectrom&#xE9;trie de masse de r&#xE9;action multiple de surveillance pour les prot&#xE9;ines dans le plasma Quantification

Die Unf&auml;higkeit, zahlreicher Proteine im Gewebe und hinter mit hoher Pr&auml;zision, Sensibilit&auml;t und Durchsatz zu quantifizieren ist ein gro&szlig;es Hindernis in Biomarker-Studien. Wir zuvor nachweislich Immunoaffinity Anreicherung mit anti-peptide Antik&ouml;rpern (SISCAPA) zu MRM-MS Kopplung Immuno-MRM Proben produziert, die zur Quantifizierung der Proteine im Plasma mit hoher Sensitivit&auml;t, Spezifit&auml;t und Genauigkeit Multiplexing werden k&ouml;nnen. Hier berichten wir, dass die erste systematische Bewertung der labor&uuml;bergreifende Leistung (8-Plex) Immuno-MRM-MS in drei unabh&auml;ngige Labore Multiplexing. Eine inszenierte Studie wurde durchgef&uuml;hrt, in denen die Wirkung der einzelnen Schritte der Verarbeitung und Analyse auf Probe CV, LOD, LOQ und Recovery ausgewertet wurde. Nachweisgrenzen waren bei oder unter 1 ng/mL f&uuml;r die analysiert Proteine in 30 uL von Plasma. Assay Reproduzierbarkeit war akzeptabel f&uuml;r &Uuml;berpr&uuml;fung Studien, mit medianen Intra - und inter - laboratory CVs oberhalb der LOQ von 11 % und &lt; 14 %, jeweils f&uuml;r den gesamten Immuno-MRM-MS-Assay-Prozess, einschlie&szlig;lich enzymatische Verdauung von Plasma. Trypsin-Verdauung und den Umgang damit erforderliche Beispiel trugen die meisten um die Variabilit&auml;t Brutversuch und die Wiederherstellung der Ziel-Peptide von verdaute Proteine verringert. Mit ein stabiles Isotop Protein als ein internes Standards statt Stabiles Isotop beschriftete Peptide f&uuml;r Verluste im Verdauungproze&szlig; fast Konto Assay Genauigkeit daf&uuml;r verdoppelt, gleichzeitiger Verbesserung der Assay-Pr&auml;zision 5 % gekennzeichnet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Multiplex Immuno-MRM-MS in unabh&auml;ngigen Labors reproduzierbare gemacht werden kann und das Potenzial hat, die weit angenommen werden, f&uuml;r die Pr&uuml;fung der Proteine in Matrizen so komplex wie Plasma.

Labor&uuml;bergreifende Bewertung der automatisiert, Multiplex-Peptid Immunoaffinity Bereicherung an mehreren Reaktion &Uuml;berwachung zur Quantifizierung der Proteine im Plasma-Massenspektrometrie gekoppelt ist.

L&#39;impossibilit&agrave; di quantificare un gran numero di proteine nei tessuti e ha con alta precisione, la sensibilit&agrave; e la velocit&agrave; effettiva &egrave; un collo di bottiglia importante negli studi di biomarker. Abbiamo precedentemente dimostrato che giunto arricchimento immunoaffinity usando gli anticorpi anti-peptide (SISCAPA) a MRM-MS produce saggi immuno-MRM che possono essere multiplexati per quantificare le proteine nel plasma con alta sensibilit&agrave;, specificit&agrave; e precisione. Riportiamo che la prima valutazione sistematica delle prestazioni interlaboratorio multiplexed (8-plex) immuno-MRM-MS in tre laboratori indipendenti. &Egrave; stato condotto uno studio in scena in cui &egrave; stato valutato l&#39;effetto di ogni fase di elaborazione e analisi su analisi CV, LOD e LOQ recupero. Limiti di rilevamento sono stati pari o inferiore a 1 ng/mL per le proteine dosate in 30 uL di plasma. Riproducibilit&agrave; del test &egrave; stato accettabile per verifica studi, con mediana intra - e inter - laboratorio CVs sopra il LOQ del 11% e &lt; 14%, rispettivamente, per il processo intero saggio immuno-MRM-MS, compresa la digestione enzimatica del plasma. Digestione della tripsina e la sua gestione campione necessarie pi&ugrave; per analisi di variabilit&agrave; contribuito e ridotto il recupero dei peptidi di destinazione da proteine digerite. Utilizzando un isotopo stabile etichettato proteine come standard interno invece di un isotopo stabile etichettato peptidi per tenere conto delle perdite nel processo di digestione quasi raddoppiato il dosaggio precisione per questo migliorando la precisione di dosaggio 5%. I nostri risultati dimostrano che multiplex immuno-MRM-MS possono essere resi riproducibili attraverso laboratori indipendenti e ha il potenziale per essere adottato ampiamente per dosaggio proteine in matrici complesse come plasma.

Valutazione interlaboratorio di automatizzato, multiplexed arricchimento immunoaffinity peptide accoppiato alla reazione pi&ugrave; monitoraggio spettrometria di massa per quantificare le proteine nel plasma.

&#x9AD8;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x3001;&#x611F;&#x5EA6;&#x3068;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x7D44;&#x7E54;&#x3084;&#x751F;&#x4F53;&#x6DB2;&#x4E2D;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x591A;&#x6570;&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x306A;&#x3044;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x7814;&#x7A76;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x4E3B;&#x306A;&#x30DC;&#x30C8;&#x30EB;&#x30CD;&#x30C3;&#x30AF;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x4EE5;&#x524D;MRM-MS&#x306B;&#x6297;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x6297;&#x4F53;&#xFF08;SISCAPA&#xFF09;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30A4;&#x30E0;&#x30CE;&#x6FC3;&#x7E2E;&#x3092;&#x30AB;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x9AD8;&#x611F;&#x5EA6;&#x200B;&#x200B;&#x3001;&#x7279;&#x7570;&#x5EA6;&#x3001;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x306E;&#x8840;&#x6F3F;&#x4E2D;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x591A;&#x91CD;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x514D;&#x75AB;MRM&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x6211;&#x3005;&#x306F;3&#x3064;&#x306E;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3057;&#x305F;&#x30E9;&#x30DC;&#x3067;&#x306E;&#x591A;&#x91CD;&#x5316;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x5BA4;&#x9593;&#x306E;&#x30D1;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30DE;&#x30F3;&#x30B9;&#xFF08;8&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#xFF09;&#x514D;&#x75AB;MRM-MS&#x306E;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x4F53;&#x7CFB;&#x7684;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x6BB5;&#x968E;&#x7684;&#x306A;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;CV&#x3001;LOD&#x3001;LOQ&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30EA;&#x30AB;&#x30D0;&#x30EA;&#x306E;&#x5404;&#x51E6;&#x7406;&#x3068;&#x5206;&#x6790;&#x306E;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x304C;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3067;&#x884C;&#x308F;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x691C;&#x51FA;&#x9650;&#x754C;&#x306F;&#x8840;&#x6F3F;30&#x3BC;l&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3067;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;1 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mL&#x306E;&#x4EE5;&#x4E0B;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x518D;&#x73FE;&#x6027;&#x306F;&#x3001;&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30DE;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x6D88;&#x5316;&#x3092;&#x542B;&#x3081;&#x3066;&#x3001;&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x514D;&#x75AB;MRM-MS&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x3001;11&#xFF05;&#x306E;LOQ&#x3068;&#x26;lt;14&#xFF05;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x306E;&#x4E2D;&#x592E;&#x5024;&#x5185;&#x3068;&#x7814;&#x7A76;&#x5BA4;&#x9593;&#x3067;&#x306E;CVS&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x691C;&#x8A3C;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x53D7;&#x3051;&#x5165;&#x308C;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30F3;&#x6D88;&#x5316;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306E;&#x51E6;&#x7406;&#x306F;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x3070;&#x3089;&#x3064;&#x304D;&#x3092;&#x62E0;&#x51FA;&#x3057;&#x3001;&#x6D88;&#x5316;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x304B;&#x3089;&#x6A19;&#x7684;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x56DE;&#x53CE;&#x7387;&#x3092;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x3002;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x3092;5&#xFF05;&#x5411;&#x4E0A;&#x3055;&#x305B;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x4EE3;&#x308F;&#x308A;&#x306B;&#x6D88;&#x5316;&#x904E;&#x7A0B;&#x3067;&#x306E;&#x640D;&#x5931;&#x3092;&#x8003;&#x616E;&#x3057;&#x3066;&#x5B89;&#x5B9A;&#x540C;&#x4F4D;&#x4F53;&#x6A19;&#x8B58;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x5185;&#x90E8;&#x6A19;&#x6E96;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x5B89;&#x5B9A;&#x540C;&#x4F4D;&#x4F53;&#x6A19;&#x8B58;&#x3057;&#x305F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x307B;&#x307C;&#x3053;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x3092;&#x500D;&#x5897;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x514D;&#x75AB;MRM-MS&#x306F;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3057;&#x305F;&#x7814;&#x7A76;&#x6240;&#x3092;&#x6E21;&#x3063;&#x3066;&#x518D;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x591A;&#x91CD;&#x5316;&#x3084;&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30DE;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x4E2D;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5E83;&#x304F;&#x63A1;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x79D8;&#x3081;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x81EA;&#x52D5;&#x5316;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x5BA4;&#x9593;&#x306E;&#x8A55;&#x4FA1;&#x306F;&#x3001;&#x8840;&#x6F3F;&#x4E2D;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EB;&#x30EA;&#x30A2;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x30E2;&#x30CB;&#x30BF;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x30A4;&#x30E0;&#x30CE;&#x6FC3;&#x7E2E;&#x3092;&#x591A;&#x91CD;&#x5316;

&#xC870;&#xC9C1; &#xBC0F; &#xB192;&#xC740; &#xC815;&#xBC00;&#xB3C4;, &#xBBFC;&#xAC10;&#xB3C4;&#xC640; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; biofluids&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xB9CE;&#xC740; &#xC218;&#xB97C; &#xACC4;&#xB7C9; &#xD558;&#xB294; &#xBB34; &#xB2A5;&#xB825; biomarker &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC758; &#xC8FC;&#xC694; &#xBCD1;&#xBAA9; &#xC9C0;&#xC810;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xB192;&#xC740; &#xAC10;&#xB3C4;, &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC815;&#xBC00; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8;&#xC5D0; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xCC99;&#xB3C4;&#xB97C; &#xB2E4;&#xC911;&#xD654; &#xB420; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; MRM &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC0DD;&#xC0B0; immunoaffinity &#xB18D;&#xCD95; anti-peptide &#xD56D; &#xCCB4; (SISCAPA)&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; MRM MS&#xC5D0; &#xCEE4;&#xD50C;&#xB9C1; &#xC2DC;&#xC5F0; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC758; inter-laboratory &#xC131;&#xB2A5;&#xC758; &#xCCAB; &#xBC88;&#xC9F8; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC778; &#xD3C9;&#xAC00; &#xB2E4;&#xC911;&#xD654; (8-&#xD50C;&#xB809;&#xC2A4;) &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;-MRM-MS 3 &#xAC1C;&#xC758; &#xB3C5;&#xB9BD;&#xC801;&#xC778; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC54C;&#xB824;&#xB4DC;&#xB9BD;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xACC4;&#xC801;&#xB41C; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC774;&#xB825;&#xC11C;, LOD, LOQ&#xC640; &#xBCF5;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xAC01; &#xCC98;&#xB9AC; &#xBC0F; &#xBD84;&#xC11D; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC758; &#xC601;&#xD5A5; &#xD3C9;&#xAC00; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2E4;&#xC2DC; &#xB410;&#xB2E4;. &#xAC80;&#xCD9C; &#xD55C;&#xACC4;&#xB294; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8;&#xC758; 30 ul&#xC5D0;&#xC11C; assayed &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; 1 ng/mL &#xC774;&#xD558;&#xB85C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC7AC;&#xD604;&#xC131; &#xAC80;&#xC99D; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC640; &#xC911;&#xAC04; &#xB0B4;&#xBD80;-&#xBC0F; &#xB610;&#xB294;-laboratory 11 %loq &#xC704;&#xC758; Cvs&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xD588;&#xB2E4; &#xACE0; &lt; 14%, &#xAC01;&#xAC01;, &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8;&#xC758; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC18C;&#xD654;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC5EC; &#xC804;&#xCCB4; &#xBA74;&#xC5ED; MRM MS &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C;. &#xD2B8;&#xB9BD; &#xC2E0; &#xC18C;&#xD654;&#xC640; &#xD544;&#xC218; &#xC0D8;&#xD50C; &#xCC98;&#xB9AC; &#xC2DC;&#xD5D8;&#xC758; &#xBCC0;&#xD654;&#xC5D0; &#xAC00;&#xC7A5; &#xAE30;&#xC5EC; &#xD558; &#xACE0; &#xC18C;&#xD654; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xC0C1; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xBCF5;&#xAD6C;&#xB97C; &#xAC10;&#xC18C;. &#xC548;&#xC815; &#xB3D9;&#xC704; &#xC6D0;&#xC18C;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC70;&#xC758; &#xC18C;&#xD654; &#xACFC;&#xC815;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC190;&#xC2E4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xACC4;&#xC815; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xB77C;&#xB294; &#xC548;&#xC815; &#xB3D9;&#xC704; &#xC6D0;&#xC18C; &#xB300;&#xC2E0; &#xB0B4;&#xBD80; &#xD45C;&#xC900; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC815;&#xBC00; 5% &#xAC1C;&#xC120; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548;&#xC774; &#xB300; &#xD55C; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC815;&#xD655;&#xB3C4; &#xB450; &#xBC30;&#xB85C; &#xC11C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBD84;&#xB958;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xB2E4;&#xC911;&#xD654; immuno MRM MS &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; &#xC7AC;&#xD604;&#xD560; &#xC218; &#xB3C5;&#xB9BD;&#xC801;&#xC778; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4; &#xC2DC; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8;&#xB85C; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xC704;&#xD574; &#xB110;&#xB9AC; &#xCC44;&#xD0DD; &#xB420; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xC788;&#xB2E4;.

Inter-laboratory &#xD3C9;&#xAC00;&#xC758; &#xC790;&#xB3D9;&#xD654;, &#xC5EC;&#xB7EC; &#xBC18;&#xC751;&#xC5D0; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4;&#xB9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xCE21;&#xC815;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1;&#xC744; &#xACB0;&#xD569; &#xD558; &#xC5EC; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; immunoaffinity &#xB18D;&#xCD95; &#xBA40;&#xD2F0;&#xD50C;&#xB809;&#xC2A4;.

La incapacidad de cuantificar un gran n&#xFA;mero de prote&#xED;nas en los tejidos y biofluidos con alta precisi&#xF3;n, la sensibilidad y el rendimiento es un cuello de botella importante en los estudios de biomarcadores. Hemos demostrado previamente que el enriquecimiento de acoplamiento de inmunoafinidad con anticuerpos anti-p&#xE9;ptido (SISCAPA) a MRM-EM produce inmuno-GRM ensayos que pueden ser multiplexados para cuantificar las prote&#xED;nas en el plasma con alta sensibilidad, especificidad y precisi&#xF3;n. Aqu&#xED; se presenta la primera evaluaci&#xF3;n sistem&#xE1;tica del desempe&#xF1;o entre laboratorios de multiplexado (8-plex) inmuno-MRM-MS en tres laboratorios independientes. Un estudio se llev&#xF3; a cabo por etapas en las que el efecto de cada paso de procesamiento y an&#xE1;lisis de ensayo de CV, LD, LC y se evalu&#xF3; la recuperaci&#xF3;n. Los l&#xED;mites de detecci&#xF3;n son iguales o por debajo de 1 ng / ml para las prote&#xED;nas ensayadas en 30 uL de plasma. Reproducibilidad del ensayo era aceptable para los estudios de verificaci&#xF3;n, con una mediana de CV intra-e inter-laboratorio sobre el l&#xED;mite de cuantificaci&#xF3;n del 11% y% &#x26;lt;14, respectivamente, para el proceso de ensayo de toda la inmuno-MRM-MS, incluyendo la digesti&#xF3;n enzim&#xE1;tica de plasma. Digesti&#xF3;n con tripsina y su manejo de la muestra necesaria contribuido la variabilidad del ensayo m&#xE1;s a reducirse y la recuperaci&#xF3;n de los p&#xE9;ptidos de las prote&#xED;nas diana digeridos. Usando una prote&#xED;na is&#xF3;topo estable etiquetada como un patr&#xF3;n interno en lugar de los p&#xE9;ptidos de is&#xF3;topos estables etiquetados para dar cuenta de las p&#xE9;rdidas en el proceso de digesti&#xF3;n duplicado exactitud del an&#xE1;lisis de este tiempo que mejora la precisi&#xF3;n del ensayo 5%. Nuestros resultados demuestran que multiplexada inmuno-MRM-MS se pueden hacer reproducibles entre laboratorios independientes y tiene el potencial de ser adoptado ampliamente para ensayar las prote&#xED;nas en matrices tan complejo como el plasma.

Entre laboratorios de evaluaci&#xF3;n de los sistemas automatizados, multiplexado de enriquecimiento de inmunoafinidad p&#xE9;ptido acoplado a espectrometr&#xED;a de masas de reacci&#xF3;n m&#xFA;ltiple de Monitoreo para la cuantificaci&#xF3;n de prote&#xED;nas en el plasma

Matthew E. Pope

Department of Biochemistry and Microbiology

University of Victoria

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Matthew E. Pope

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Department of Biochemistry and Microbiology

University of Victoria

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Department of Biochemistry and Microbiology