Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Trinity College Dublin 

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The lipidic cubic mesophase has been used to crystallize important membrane proteins for high-resolution structure determination. To date, however, no integral membrane enzymes have yielded to this method, the in meso. For a crystal structure to be meaningful the target protein must be functional. Using the in meso method with a membrane enzyme requires that the protein is active in the mesophase that grows crystals. Because the cubic phase is sticky and viscous and is bicontinuous topologically, quantitatively assessing enzyme activity in meso is a challenge. Here, we describe a procedure for characterizing the catalytic properties of the integral membrane enzyme, diacylglycerol kinase, reconstituted into the bilayer of the lipidic cubic phase. The kinase activity of this elusive crystallographic target was monitored spectrophotometrically using a coupled assay in a high-throughput, 96-well plate format. In meso, the enzyme exhibits classic Michaelis-Menten kinetics and works with a range of lipid substrates. The fact that the enzyme and its lipid substrate and product remain confined to the porous mesophase while its water-soluble substrate and product are free to partition into the aqueous bathing solution suggests a general and convenient approach for characterizing membrane enzymes that function with lipids in a membrane-like environment. The distinctive rheology of the cubic phase means that a procedural step to physically separate substrate from product is not needed. Because of its open, bicontinuous nature, the cubic phase offers the added benefit that the protein is accessible for assay from both sides of the membrane.

Lipid cubic phase as a membrane mimetic for integral membrane protein enzymes.

La m&eacute;sophase cube lipidique a servi &agrave; cristalliser les prot&eacute;ines membranaires importantes pour la d&eacute;termination de la structure &agrave; haute r&eacute;solution. A ce jour, cependant, sans enzymes membranaires intrins&egrave;ques ont donn&eacute; &agrave; cette m&eacute;thode, en m&eacute;so. Pour une structure cristalline &ecirc;tre significatif, la prot&eacute;ine cible doit &ecirc;tre fonctionnelle. &Agrave; l&#39;aide de la m&eacute;so en m&eacute;thode avec une enzyme de la membrane requiert que la prot&eacute;ine est active dans la m&eacute;sophase qui pousse les cristaux. Parce que la phase cubique est collant et visqueux et bicontinues topologiquement, &eacute;valuer quantitativement l&#39;activit&eacute; enzymatique en m&eacute;so est un d&eacute;fi. Ici, nous d&eacute;crivons une proc&eacute;dure permettant de caract&eacute;riser les propri&eacute;t&eacute;s catalytiques de l&#39;enzyme membranaire int&eacute;gr&eacute;, kinase de diacylglycerol, reconstitu&eacute;e dans la bicouche de la phase cubique lipidique. L&#39;activit&eacute; de la kinase de cet objectif difficile &agrave; atteindre cristallographique a &eacute;t&eacute; suivie par spectrophotom&eacute;trie par dosage coupl&eacute; dans un format haut d&eacute;bit plaque 96 puits. En m&eacute;so, l&#39;enzyme a une cin&eacute;tique de Michaelis-Menten classique et travaille avec une gamme de substrats lipidiques. Le fait que l&#39;enzyme et son substrat lipidique et produit restent confin&eacute;es &agrave; la m&eacute;sophase poreuse alors que son substrat soluble dans l&#39;eau et le produit sont libres de partition dans la solution aqueuse de baignade, sugg&egrave;re une approche g&eacute;n&eacute;rale et pratique pour caract&eacute;riser les enzymes membranaires qui fonctionnent avec des lipides dans un environnement de type membrane. La rh&eacute;ologie distinctive de la phase cubique signifie qu&#39;une &eacute;tape proc&eacute;durale au substrat physiquement s&eacute;par&eacute;e du produit n&#39;est pas n&eacute;cessaire. En raison de son ouverture, la nature bicontinues, la phase cubique offre l&#39;avantage suppl&eacute;mentaire que la prot&eacute;ine est accessible pour l&#39;analyse des deux c&ocirc;t&eacute;s de la membrane.

Phase cubique de lipides comme membrane mim&eacute;tique d&#39;enzymes de prot&eacute;ines membranaires intrins&egrave;ques.

Die lipidischen kubische Mesophase ist verwendet worden, wichtige Membranproteine f&uuml;r hochaufl&ouml;sende Struktur Bestimmung herauszukristallisieren. Bis heute haben jedoch keine integrale Membrane Enzyme dieser Methode, die in Meso gef&uuml;hrt. Zielprotein muss funktionsf&auml;hig sein, f&uuml;r eine Kristallstruktur sinnvoll zu sein. Mithilfe der in Meso erfordert-Methode mit einer Membran-Enzym, dass das Protein in der Mesophase aktiv ist, die Kristalle w&auml;chst. Weil die kubische Phase klebrig und z&auml;hfl&uuml;ssig ist und Bicontinuous topologisch, ist quantitativ beurteilen Enzymaktivit&auml;t in Meso eine Herausforderung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Charakterisierung der katalytischen Eigenschaftendes des integralen Membrane Enzyms, Diacylglycerol Kinase, stellte in der Bilayer der lipidischen kubische Phase. Die Kinase-Aktivit&auml;t dieses schwer fassbare kristallographische Ziel war abstoppen mit einem gekoppelten Assay in einem hohen Durchsatz, 96-Well-Plattenformat &uuml;berwacht. In Meso das Enzym zeigt klassische Michaelis-Menten-Kinetik und arbeitet mit einer Reihe von Lipid-Substraten. Die Tatsache, die das Enzym und Lipid-Substrat und Produkt auf der por&ouml;sen Mesophase beschr&auml;nkt, bleiben w&auml;hrend wasserl&ouml;sliches Substrat und Produkt frei in der w&auml;ssrigen Baden-L&ouml;sung aufgeteilt sind schl&auml;gt einen allgemeinen und praktischen Ansatz zur Charakterisierung von Membran-Enzyme, die mit Lipiden in einem Membran-&auml;hnliche Umgebung funktionieren. Die unverwechselbare Rheologie der kubische Phase bedeutet, dass ein Verfahrensschritt auf physisch getrennten Substrat aus Produkt nicht ben&ouml;tigt wird. Wegen seiner offenen, Bicontinuous Natur, bietet die kubische Phase den zus&auml;tzlichen Vorteil, dass das Protein Assay von beiden Seiten der Membran ist.

Lipid kubische Phase als mimetische Membran f&uuml;r integrale Membrane Protein-Enzyme.

Il mesophase lipidico cubi &egrave; stato usato per cristallizzare le proteine di membrana importante per la determinazione della struttura ad alta risoluzione. Ad oggi, tuttavia, nessun enzimi integrali di membrana hanno portato a questo metodo, il meso in. Per una struttura di cristallo essere significativo, la proteina bersaglio deve essere funzionale. Utilizzando il meso in metodo con un enzima di membrana richiede che la proteina &egrave; attiva nella mesophase che cresce cristalli. Poich&eacute; la fase cubica &egrave; appiccicoso e viscoso e bicontinuous topologicamente, valutare quantitativamente l&#39;attivit&agrave; dell&#39;enzima in meso &egrave; una sfida. Qui, descriviamo una procedura per caratterizzare le propriet&agrave; catalitiche dell&#39;enzima integrale di membrana, diacilglicerolo chinasi, ricostituito nel doppio strato della fase lipidica cubica. L&#39;attivit&agrave; della chinasi di questo target sfuggente cristallografico &egrave; stata monitorata spettrofotometricamente utilizzando un dosaggio accoppiato in un formato di piastra di alto-rendimento, 96-well. In meso, l&#39;enzima esibisce classico cinetica di Michaelis-Menten e funziona con una vasta gamma di substrati lipidici. Il fatto che l&#39;enzima e il substrato lipidico e prodotto rimangono confinati per la mesophase poroso mentre il suo substrato solubile in acqua e prodotto sono liberi di partizionare in soluzione acquosa balneazione suggerisce un approccio generale e conveniente per caratterizzare gli enzimi di membrana che funzionano con i lipidi in un ambiente simile a membrana. La reologia caratteristica della fase cubica significa che non &egrave; necessario un passaggio procedura al substrato fisicamente separata dal prodotto. A causa della sua aperta, bicontinuous natura, la fase cubica offre l&#39;ulteriore vantaggio che la proteina &egrave; accessibile per l&#39;analisi da entrambi i lati della membrana.

Cubi fase lipidica come una membrana mimetica per gli enzimi della proteina integrale di membrana.

&#x8102;&#x8CEA;&#x30AD;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D3;&#x30C3;&#x30AF; &#x30E1;&#x30BD;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30BA;&#x9AD8;&#x5206;&#x89E3;&#x80FD;&#x69CB;&#x9020;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x65E5;&#x4ED8;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x7A4D;&#x5206;&#x819C;&#x9175;&#x7D20;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306B;&#x306F;&#x3001;in &#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x751F;&#x307E;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x306A;&#x3044;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020;&#x304C;&#x610F;&#x5473;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306F;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30E1;&#x30BD;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x819C;&#x9175;&#x7D20;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x7D50;&#x6676;&#x6210;&#x9577;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30E1;&#x30BD;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30BA; &#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x30AD;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D3;&#x30C3;&#x30AF;&#x76F8;&#x306F;&#x7C98;&#x7740;&#x6027;&#x3068;&#x7C98;&#x6027;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x53CC;&#x9023;&#x7D9A;&#x4F4D;&#x76F8;&#x7684;&#x3067;&#x3059;&#x306E;&#x3067;&#x3001;&#x30E1;&#x30BE;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x6D3B;&#x6027;&#x306E;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x8A55;&#x4FA1;&#x304C;&#x8AB2;&#x984C;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x7A4D;&#x5206;&#x819C;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x3001;&#x30B8;&#x30A2;&#x30B7;&#x30EB;&#x30B0;&#x30EA;&#x30BB;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x3001;2p142 &#x8102;&#x8CEA;&#x7ACB;&#x65B9;&#x76F8;&#x306E;&#x4E8C;&#x91CD;&#x819C;&#x306B;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;&#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x6027;&#x8CEA;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3065;&#x3051;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x624B;&#x9806;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x3068;&#x3089;&#x3048;&#x3069;&#x3053;&#x308D;&#x306E;&#x306A;&#x3044;&#x7D50;&#x6676;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x4F5C;&#x696D;&#x30AA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30E9;&#x30E0;&#x7D50;&#x5408;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x3001;96 &#x30A6;&#x30A7;&#x30EB;&#x306E;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x5F62;&#x5F0F;&#x3067;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x76E3;&#x8996;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30E1;&#x30BE;&#x3001;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;&#x53E4;&#x5178;&#x7684;&#x306A;&#x30DF;&#x30AB;&#x30A8;&#x30EA;&#x30B9;-&#x30E1;&#x30F3;&#x30C6;&#x30F3;&#x578B;&#x52D5;&#x614B;&#x5C55;&#x793A;&#x3057;&#x3001;&#x8102;&#x8CEA;&#x57FA;&#x677F;&#x306E;&#x7BC4;&#x56F2;&#x3067;&#x52D5;&#x4F5C;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x306E;&#x6C34;&#x6EB6;&#x6027;&#x57FA;&#x6750;&#x3068;&#x88FD;&#x54C1;&#x306F;&#x6C34;&#x6027;&#x5165;&#x6D74;&#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x4F5C;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x7121;&#x6599;&#x3067;&#x3059;&#x304C;&#x9175;&#x7D20;&#x3068;&#x8102;&#x8CEA;&#x57FA;&#x677F;&#x88FD;&#x54C1;&#x591A;&#x5B54;&#x8CEA;&#x30E1;&#x30BD;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30BA;&#x306B;&#x7559;&#x307E;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x4E8B;&#x5B9F;&#x3068;&#x8102;&#x8CEA;&#x819C;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x74B0;&#x5883;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x819C;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x3067;&#x4FBF;&#x5229;&#x306A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30AD;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D3;&#x30C3;&#x30AF;&#x76F8;&#x306E;&#x7279;&#x5FB4;&#x7684;&#x306A;&#x30EC;&#x30AA;&#x30ED;&#x30B8;&#x30FC;&#x624B;&#x7D9A;&#x304D;&#x578B;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x3059;&#x308B;&#x7269;&#x7406;&#x7684;&#x306B;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3057;&#x305F;&#x57FA;&#x677F;&#x88FD;&#x54C1;&#x304B;&#x3089;&#x306F;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x3044;&#x610F;&#x5473;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x306E;&#x958B;&#x304F;&#x305F;&#x3081;&#x53CC;&#x9023;&#x7D9A;&#x81EA;&#x7136;&#x306E;&#x30AD;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D3;&#x30C3;&#x30AF;&#x76F8;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x304C;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30B9;&#x819C;&#x306E;&#x4E21;&#x5074;&#x304B;&#x3089;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306E;&#x52A0;&#x3048;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x5229;&#x70B9;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

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Lipidic &#xD050;&#xBE45; mesophase &#xACE0;&#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xAD6C;&#xC870; &#xACB0;&#xC815;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xD654;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xC9C0;&#xAE08;&#xAE4C;&#xC9C0;,, &#xC544;&#xB2C8; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xB9C9; &#xD6A8;&#xC18C;&#xAC00; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBBF8;&#xC2DC;&#xC801; &#xAD74;&#xBCF5; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC758;&#xBBF8; &#xC788;&#xB294; &#xACB0;&#xC815; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB300;&#xC0C1; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC791;&#xB3D9; &#xD574;&#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC2DC;&#xB0B4; &#xBBF8;&#xC2DC;&#xC801;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB9C9; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0;&#xC815; &#xC131;&#xC7A5; mesophase&#xC5D0;&#xC11C; &#xD65C;&#xC131;&#xC774; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC785;&#xBC29; &#xC704;&#xC0C1; &#xC810;&#xC131; &#xB048; &#xC801; &#xC774;&#xBA70; &#xC704;&#xC0C1;&#xC801; bicontinuous&#xC740; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xBBF8;&#xC2DC;&#xC801;&#xC5D0; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC591;&#xC801; &#xD3C9;&#xAC00; &#xB3C4;&#xC804; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC; &#xD2B9;&#xC131;&#xD654; &#xACC4;&#xC5F4; &#xB9C9; &#xD6A8;&#xC18C;, diacylglycerol kinase, lipidic &#xC785;&#xBC29; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC758; bilayer&#xB85C; &#xC7AC;&#xAD6C;&#xC131;&#xC758; &#xCD09;&#xB9E4; &#xC18D;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC808;&#xCC28;&#xB97C; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xAE30;&#xBB18;&#xD55C; crystallographic &#xB300;&#xC0C1;&#xC758; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; &#xD65C;&#xB3D9; spectrophotometrically &#xACB0;&#xD569; &#xB41C; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9;, 96-&#xC798; &#xD50C;&#xB808;&#xC774;&#xD2B8; &#xD615;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBBF8;&#xC2DC;&#xC801;, &#xD6A8;&#xC18C; &#xD074;&#xB798;&#xC2DD; Michaelis Menten &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860;&#xC744; &#xC804;&#xC2DC; &#xD558; &#xACE0; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xAE30;&#xD310; &#xC791;&#xB3D9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC218;&#xC6A9; &#xC131; &#xAE30;&#xD310; &#xBC0F; &#xC81C;&#xD488; &#xBB34;&#xB8CC; &#xC218;&#xC131; &#xC785;&#xC695; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158;&#xC73C;&#xB85C; &#xBD84;&#xD560; &#xD558;&#xB294; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC640; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xAE30;&#xD310; &#xBC0F; &#xC81C;&#xD488; &#xC720;&#xC9C0; &#xB2E4;&#xACF5;&#xC131; mesophase&#xC5D0; &#xAD6D;&#xD55C; &#xB41C; &#xC0AC;&#xC2E4; &#xB9C9; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xB9C9; &#xAC19;&#xC740; &#xD658;&#xACBD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD568;&#xAED8; &#xC791;&#xB3D9; &#xD558;&#xB294; &#xD2B9;&#xC131;&#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC77C;&#xBC18; &#xBC0F; &#xD3B8;&#xB9AC;&#xD55C; &#xC811;&#xADFC;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC785;&#xBC29; &#xC704;&#xC0C1;&#xC758; &#xB3C5;&#xD2B9;&#xD55C; &#xB808; &#xC62C;&#xB85C; &#xC9C0; &#xC81C;&#xD488;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBB3C;&#xB9AC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCC4;&#xB3C4; &#xAE30;&#xD310;&#xC5D0; &#xC808;&#xCC28; &#xB2E8;&#xACC4;&#xAC00; &#xD544;&#xC694; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;&#xC744; &#xC758;&#xBBF8; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Bicontinuous &#xC790;&#xC5F0;&#xC758; &#xC5F4;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xC785;&#xBC29; &#xC704;&#xC0C1; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC740; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xB300; &#xD55C; &#xB9C9;&#xC758; &#xC591;&#xCABD; &#xBAA8;&#xB450;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC561;&#xC138;&#xC2A4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xCD94;&#xAC00; &#xD61C;&#xD0DD;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC9C0;&#xC9C8; &#xB9C9; &#xBAA8;&#xBC29;&#xC73C;&#xB85C; &#xC815;&#xC218; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC785;&#xBC29; &#xB2E8;&#xACC4;.

La mesofase c&uacute;bico lip&iacute;dica se ha utilizado para cristalizar prote&iacute;nas de membrana importante para la determinaci&oacute;n de la estructura de alta resoluci&oacute;n. Hasta la fecha, sin embargo, no enzimas de membrana integral han rendido a este m&eacute;todo, el meso en. Para que una estructura cristalina sea significativo, la prote&iacute;na diana debe ser funcional. Usando el meso en m&eacute;todo con una enzima de membrana requiere que la prote&iacute;na es activa en la mesofase que crece cristales. Porque la fase c&uacute;bica es pegajoso y viscoso y bicontinuas topol&oacute;gico, evaluar cuantitativamente la actividad enzim&aacute;tica en meso es un desaf&iacute;o. Aqu&iacute;, describimos un procedimiento para la caracterizaci&oacute;n de las propiedades catal&iacute;ticas de la enzima de membrana integral, diacilglicerol quinasa, reconstituido en la bicapa de la fase lip&iacute;dica de c&uacute;bica. La actividad de la quinasa de este escurridizo objetivo cristalogr&aacute;fico supervisaron espectrofotom&eacute;tricamente usando un an&aacute;lisis acoplado en un formato de alto rendimiento, 96 pocillos de la placa. En meso, la enzima exhibe cl&aacute;sico cin&eacute;tica de Michaelis-Menten y trabaja con una gama de sustratos de l&iacute;pidos. El hecho de que la enzima y su sustrato l&iacute;pidos y producto permanecen confinados a las mesofases poroso mientras su sustrato soluble en agua y productos son libres de partici&oacute;n en la soluci&oacute;n acuosa ba&ntilde;arse sugiere un enfoque general y conveniente para la caracterizaci&oacute;n de las enzimas de la membrana que funcionan con l&iacute;pidos en un entorno de membrana. La reolog&iacute;a distintiva de la fase c&uacute;bica significa que no es necesario un paso procesal al substrato f&iacute;sicamente separado del producto. Debido a su abierto, natural de bicontinuas, la fase c&uacute;bica ofrece la ventaja de que la prote&iacute;na es accesible para ensayo de ambos lados de la membrana.

Fase c&uacute;bica lip&iacute;dica como membrana mim&eacute;tica de enzimas de prote&iacute;na integral de la membrana.

&#x8FC4;&#x4ECA;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x7ACB;&#x65B9;&#x4E2D;&#x95F4;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6240;&#x8FDB;&#x884C;&#x7684; crystallogenesis &#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x9ED8;&#x8BA4;&#x8102;&#x8D28;&#x662F; monoolein&#x3002;&#x6709;&#x6CA1;&#x6709;&#x597D;&#x7684;&#x7406;&#x7531;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x4E3A;&#x4EC0;&#x4E48;&#x8FD9; 18 &#x78B3;&#xFF0C;&#x72EC;&#x8054;&#x4F53;&#x9971;&#x548C; monoacylglycerol &#x5E94;&#x8BE5;&#x662F;&#x9996;&#x9009;&#x7684;&#x8102;&#x8D28;&#x6240;&#x6709;&#x76EE;&#x6807;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;&#x540E;&#x8005;&#x662F;&#x6765;&#x81EA;&#x5177;&#x6709;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x5C5E;&#x6027;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5305;&#x62EC;&#x758F;&#x6C34;&#x539A;&#x5EA6;&#x3001; &#x5185;&#x5728;&#x66F2;&#x7387;&#x3001; &#x6A2A;&#x5411;&#x538B;&#x529B;&#x5256;&#x9762;&#x3001; &#x8102;&#x80AA;&#x3001; &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x5986;&#xFF0C;&#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x975E;&#x5BF9;&#x79F0;&#x6027;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x819C;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x6570;&#x7EC4;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4F3C;&#x4E4E;&#x5408;&#x7406;&#x7B5B;&#x67E5;&#x7ED3;&#x6676;&#x6027;&#x80FD;&#x7684;&#x57FA;&#x7840;&#x521B;&#x5EFA;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x4E2D;&#x95F4;&#x76F8;&#x7684;&#x8102;&#x8D28;&#x7684;&#x8EAB;&#x4EFD;&#x5C06;&#x662F;&#x503C;&#x5F97;&#x3002;&#x4E3A;&#x6B64;&#xFF0C;monoacylglycerols &#x4E0E;&#x4E0D;&#x540C;&#x9170;&#x57FA;&#x94FE;&#x7279;&#x6027;&#xFF0C;&#x5982;&#x957F;&#x5EA6;&#x548C;&#x70EF;&#x70C3;&#x503A;&#x5238;&#x7684;&#x7ACB;&#x573A;&#xFF0C;&#x5FC5;&#x987B;&#x53EF;&#x7528;&#x3002;&#x5728;&#x4F5C;&#x8005;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x6EE1;&#x8DB3;&#x8FD9;&#x79CD;&#x9700;&#x8981;&#x8102;&#x8D28;&#x7684;&#x5408;&#x6210;&#x548C;&#x7EAF;&#x5316;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x3002;&#x5728;&#x4E0E;&#x5916;&#x819C;&#x7CD6;&#x8F6C;&#x8FD0;&#x86CB;&#x767D; OprB&#xFF0C;&#x76EE;&#x524D;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC1;&#x660E;&#x8BE5;&#x5B9E;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x7684;&#x4E3B;&#x673A;&#x8840;&#x8102;&#x7B5B;&#x67E5;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x751F;&#x6210;&#x6676;&#x4F53;&#x884D;&#x5C04;&#x8D28;&#x91CF;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x624B;&#x6BB5;&#x3002;&#x4E3B;&#x673A;&#x8840;&#x8102;&#x7B5B;&#x67E5;&#x5F88;&#x53EF;&#x80FD;&#x662F;&#x57FA;&#x4E8E;&#x4E2D;&#x95F4;&#x76F8;&#x7684;&#x7ED3;&#x6676;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x901A;&#x5E38;&#x5F88;&#x6709;&#x7528;&#x7684;&#x6218;&#x7565;&#x3002;

&#x5728;&#x6CB9;&#x8102;&#x9AD8;&#x80FD;&#x7684;&#x7ED3;&#x6676;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;&#x4E00;&#x4E2A;&#x4E3B;&#x673A;&#x8102;&#x8D28;&#x5C4F;&#x5E55;&#x3002;

The default lipid for the bulk of the crystallogenesis studies performed to date using the cubic mesophase method is monoolein. There is no good reason however, why this 18-carbon, cis-monounsaturated monoacylglycerol should be the preferred lipid for all target membrane proteins. The latter come from an array of biomembrane types with varying properties that include hydrophobic thickness, intrinsic curvature, lateral pressure profile, lipid and protein makeup, and compositional asymmetry. Thus, it seems reasonable that screening for crystallizability based on the identity of the lipid creating the hosting mesophase would be worthwhile. For this, monoacylglycerols with differing acyl chain characteristics, such as length and olefinic bond position, must be available. A lipid synthesis and purification program is in place in the author's laboratory to serve this need. In the current study with the outer membrane sugar transporter, OprB, we demonstrate the utility of host lipid screening as a means for generating diffraction-quality crystals. Host lipid screening is likely to prove a generally useful strategy for mesophase-based crystallization of membrane proteins.

Crystallizing Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. A Host Lipid Screen.

Les lipides par d&eacute;faut pour la majeure partie des &eacute;tudes effectu&eacute;es &agrave; ce jour en utilisant la m&eacute;thode de la m&eacute;sophase cubes crystallogenesis est monool&eacute;ine. Il n&#39;y a aucune raison pourquoi ce 18 carbones, cis-monoinsatur&eacute;s monoacylglyc&eacute;rol devrait toutefois lipide pr&eacute;f&eacute;r&eacute; pour tous les cibles des prot&eacute;ines membranaires. Ces derniers proviennent d&#39;un tableau de types de biomembrane avec diff&eacute;rentes propri&eacute;t&eacute;s qui incluent l&#39;&eacute;paisseur hydrophobe, courbure intrins&egrave;que, le profil de pression lat&eacute;rale, maquillage de lipides et de prot&eacute;ines et asym&eacute;trie de composition. Il semble donc raisonnable que le d&eacute;pistage des crystallizability bas&eacute; sur l&#39;identit&eacute; du lipide cr&eacute;ant la m&eacute;sophase h&eacute;bergement serait utile. Pour ce faire, monoacylglyc&eacute;rols avec diff&eacute;rentes caract&eacute;ristiques de cha&icirc;ne acyl, tels que la longueur et la position de la liaison ol&eacute;finique, doit &ecirc;tre disponible. Un programme de synth&egrave;se et purification des lipides est en place dans le laboratoire de l&#39;auteur pour r&eacute;pondre &agrave; ce besoin. Dans la pr&eacute;sente &eacute;tude aupr&egrave;s du transporteur de sucre de la membrane externe, OprB, nous d&eacute;montrent l&#39;utilit&eacute; de lipides h&ocirc;te comme un moyen pour g&eacute;n&eacute;rer des cristaux par diffraction-qualit&eacute; de d&eacute;pistage. D&eacute;pistage lipidique h&ocirc;te est susceptible de se r&eacute;v&eacute;ler une strat&eacute;gie ax&eacute;e sur la m&eacute;sophase la cristallisation des prot&eacute;ines membranaires est g&eacute;n&eacute;ralement utile.

Cristallisation des prot&eacute;ines membranaires, les m&eacute;sophases lipidiques. Un &eacute;cran de lipides h&ocirc;te.

Die Standard-Lipid f&uuml;r den Gro&szlig;teil der Crystallogenesis Studien zum Datum, der kubische Mesophase Methode ist Monoolein. Es gibt keinen Grund, warum dieser 18-Kohlenstoff, Cis-unges&auml;ttigte Monoacylglycerol sollte jedoch die bevorzugte Lipid f&uuml;r alle Membranproteine abzielen. Letztere kommen aus einem Array von Biomembrane-Typen mit unterschiedlichen Eigenschaften, die hydrophoben Dicke, intrinsischen Kr&uuml;mmung, seitliche Druckprofil, Lipid und Protein Make-up und kompositorischen Asymmetrie enthalten. Daher scheint es sinnvoll, dass Screening f&uuml;r Crystallizability auf Basis der Identit&auml;t von der Lipid erstellen hosting Mesophase lohnen w&uuml;rde. Hierzu m&uuml;ssen die Kohlenhydrate mit unterschiedlichen Acil Kette Merkmale, z. B. L&auml;nge und Position der olefinische Bond, verf&uuml;gbar sein. Eine Lipid-Synthese und Reinigung-Programm ist an Stelle des Autors Labor, dieses Bed&uuml;rfnis zu dienen. In der aktuellen Studie mit der Au&szlig;enmembran Zucker Transporter, OprB, zeigen wir die N&uuml;tzlichkeit des Host-Lipid-screening als ein Mittel zur Erzeugung von Beugung hochwertige Kristalle. Host-Lipid-Screening ist eine allgemein n&uuml;tzliche Strategie f&uuml;r Mesophase-basierte Kristallisation von Membranproteinen sich erweisen.

Kristallisieren Membranproteinen in lipidischen Mesophasen. Ein Host-Lipid-Bildschirm.

I lipidi predefinita per la maggior parte degli studi crystallogenesis eseguita per data utilizzando il metodo mesophase cubico sono monoolein. Non non c&#39;&egrave; nessuna buona ragione perch&eacute; questo 18-carbonio, cis-monoinsaturi monoacilglicerolo dovrebbe tuttavia essere il preferito dei lipidi per tutti i target di proteine di membrana. Quest&#39;ultimo proviene da una matrice di tipi di biomembrane con diverse propriet&agrave; che includono spessore idrofobo, curvatura intrinseca, profilo laterale pressione, trucco dei lipidi e delle proteine e asimmetria compositiva. Cos&igrave;, sembra ragionevole che lo screening per crystallizability basato sull&#39;identit&agrave; dei lipidi creando il mesophase hosting varrebbe la pena. Per questo, monoacylglycerols con differenti caratteristiche di catena acil, come lunghezza e posizione bond olefinici, deve essere disponibile. Un programma di sintesi e purificazione dei lipidi &egrave; posto nel laboratorio dell&#39;autore per servire questa necessit&agrave;. Nello studio corrente con il trasportatore di membrana esterna dello zucchero, OprB, ci dimostrano l&#39;utilit&agrave; del lipido di host di screening come un mezzo per generare cristalli di diffrazione-qualit&agrave;. Screening lipidico host rischia di rivelarsi una strategia generalmente utile per cristallizzazione basata su mesophase delle proteine di membrana.

Cristallizzazione di proteine di membrana in Mesophases lipidico. Una schermata di lipidi Host.

&#x65E2;&#x5B9A;&#x8102;&#x8CEA;&#x30AD;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D3;&#x30C3;&#x30AF; &#x30E1;&#x30BD;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30BA; &#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x65E5;&#x4ED8;&#x306B;&#x5B9F;&#x884C; crystallogenesis &#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x5927;&#x534A;&#x306F;&#x30E2;&#x30CE;&#x30AA;&#x30EC;&#x30A4;&#x30F3;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x826F;&#x3044;&#x7406;&#x7531;&#x306F;&#x306A;&#x3044;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x3053;&#x306E; 18 &#x70AD;&#x7D20;&#x306A;&#x305C;&#x3001;&#x30B7;&#x30B9;&#x4E0D;&#x98FD;&#x548C;&#x30E2;&#x30CE;&#x30A2;&#x30B7;&#x30EB;&#x30B0;&#x30EA;&#x30BB;&#x6700;&#x5BC4;&#x308A;&#x306E;&#x8102;&#x8CEA;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5F8C;&#x8005;&#x306F;&#x3001;&#x758E;&#x6C34;&#x6027;&#x306E;&#x539A;&#x3055;&#x3001;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x307F;&#x66F2;&#x7387;, &#x5074;&#x5727;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;&#x3001;&#x8102;&#x8CEA;&#x3068;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x5316;&#x7CA7;&#x3068;&#x7D44;&#x6210;&#x306E;&#x975E;&#x5BFE;&#x79F0;&#x6027;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D1;&#x30C6;&#x30A3;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x751F;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x578B;&#x306E;&#x914D;&#x5217;&#x304B;&#x3089;&#x6765;&#x308B;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30BA;&#x306E;&#x4F5C;&#x6210;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E; id &#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066; crystallizability &#x306E;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x304C;&#x4FA1;&#x5024;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x5408;&#x7406;&#x7684;&#x306A;&#x3088;&#x3046;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x9577;&#x3055;&#x3068;&#x30AA;&#x30EC;&#x30D5;&#x30A3;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30A2;&#x30B7;&#x30EB;&#x9396;&#x7279;&#x6027;&#x3092;&#x3082;&#x3064;&#x30E2;&#x30CE;&#x30A2;&#x30B7;&#x30EB;&#x30B0;&#x30EA;&#x30BB;&#x5229;&#x7528;&#x3067;&#x304D;&#x306A;&#x3051;&#x308C;&#x3070;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x8102;&#x8CEA;&#x5408;&#x6210;&#x30FB;&#x7CBE;&#x88FD;&#x30D7;&#x30ED;&#x30B0;&#x30E9;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30CB;&#x30FC;&#x30BA;&#x306B;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x8457;&#x8005;&#x3089;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x5834;&#x6240;&#x3067;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x5916;&#x819C;&#x7CD6;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3001;OprB&#x3001;&#x73FE;&#x5728;&#x7814;&#x7A76;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x56DE;&#x6298;&#x54C1;&#x8CEA;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x624B;&#x6BB5;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x6709;&#x7528;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x8102;&#x8CEA;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x306F;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30BA; &#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306B;&#x6709;&#x7528;&#x306A;&#x6226;&#x7565;&#x3092;&#x8A3C;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

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&#xC785;&#xBC29; mesophase &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB0A0;&#xC9DC;&#xB97C; &#xC218;&#xD589; &#xD558;&#xB294; crystallogenesis &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC758; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC9C0;&#xC9C8;&#xC740; monoolein. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xC88B;&#xC740; &#xC774;&#xC720;&#xAC00; &#xC788;&#xB2E4;, &#xC65C;&#xC774; 18 &#xD0C4;&#xC18C;, cis-&#xBD88;&#xD3EC;&#xD654; monoacylglycerol &#xC120;&#xD638; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xC704;&#xD55C; &#xB418;&#xC5B4;&#xC57C; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xB300;&#xC0C1;. &#xD6C4;&#xC790;&#xB294; &#xC18C;&#xC218; &#xB450;&#xAED8;, &#xBCF8;&#xC9C8;&#xC801;&#xC778; &#xACE1;&#xB960;, &#xCE21;&#xBA74; &#xC555;&#xB825; &#xD504;&#xB85C;&#xD544;, &#xC9C0;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBA54;&#xC774;&#xD06C;&#xC5C5; &#xC791;&#xACE1; &#xBE44;&#xB300;&#xCE6D; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC18D;&#xC131;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4; biomembrane &#xD615;&#xC2DD;&#xC758; &#xBC30;&#xC5F4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC654;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xD638;&#xC2A4;&#xD305; mesophase &#xB9CC;&#xB4DC;&#xB294; &#xC9C0;&#xC9C8; id&#xB97C; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xD558;&#xB294; crystallizability&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC00;&#xCE58;&#xAC00; &#xC788;&#xC744; &#xAC83; &#xC774;&#xB77C;&#xACE0; &#xD569;&#xB9AC;&#xC801;&#xC778; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC778;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC704;&#xD574;, &#xAE38;&#xC774; olefinic &#xBCF8;&#xB4DC; &#xC704;&#xCE58; &#xAC19;&#xC740; &#xB2E4;&#xB978; acyl &#xCCB4;&#xC778; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4; monoacylglycerols &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC5B4;&#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC9C0;&#xC9C8; &#xD569;&#xC131; &#xBC0F; &#xC815;&#xC81C; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC740; &#xC791;&#xAC00; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC2E4;&#xC774; &#xD544;&#xC694;&#xB97C; &#xBD09;&#xC0AC; &#xD558;&#xB294; &#xC790;&#xB9AC;&#xC5D0;. &#xC678;&#xBD80; &#xB9C9; &#xC124;&#xD0D5; &#xC6B4;&#xC1A1;&#xC5C5; &#xC790;, OprB&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xD604;&#xC7AC; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xD68C;&#xC808; &#xD488;&#xC9C8; &#xACB0;&#xC815;&#xC744; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xC218;&#xB2E8;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC80;&#xC0AC;&#xC758; &#xC720;&#xD2F8;&#xB9AC;&#xD2F0;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xAC80;&#xC0AC;&#xB294; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xACB0;&#xC815; &#xD654; mesophase &#xAE30;&#xBC18;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC720;&#xC6A9;&#xD55C; &#xC804;&#xB7B5;&#xC744; &#xC99D;&#xBA85; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xB192;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Crystallizing Lipidic Mesophases&#xC5D0;&#xC11C; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;. &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xD654;&#xBA74;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

El l&iacute;pido por defecto para la mayor parte de los estudios de crystallogenesis realizados hasta la fecha utilizando el m&eacute;todo de mesofases c&uacute;bico es monoolein. No hay ninguna buena raz&oacute;n sin embargo, por qu&eacute; este 18 carbonos, cis-monoinsaturados Monoacilglicerol debe ser el l&iacute;pido preferido para todo destino prote&iacute;nas de membrana. Estos &uacute;ltimos provienen de una variedad de tipos de biomembrana con varias propiedades que incluyen espesor hidrof&oacute;bico, curvatura intr&iacute;nseca, perfil de presi&oacute;n lateral, maquillaje de l&iacute;pidos y prote&iacute;nas y asimetr&iacute;a compositiva. As&iacute; pues, parece razonable que proyecci&oacute;n para crystallizability basada en la identidad de los l&iacute;pidos creando la mesofase alojamiento valdr&iacute;a la pena. Para esto, monoacylglycerols con diferentes caracter&iacute;sticas de cadena acil, tales como la longitud y la posici&oacute;n de enlace olef&iacute;nicos, deben estar disponibles. Un programa de s&iacute;ntesis y purificaci&oacute;n de l&iacute;pidos est&aacute; colocado en el laboratorio del autor para servir esta necesidad. En el presente estudio con el transportador de membrana externa az&uacute;car, OprB, demostramos la utilidad de l&iacute;pidos de host como un medio para generar calidad difracci&oacute;n cristales de detecci&oacute;n. Proyecci&oacute;n de l&iacute;pidos del anfitri&oacute;n es probablemente una estrategia generalmente &uacute;til para basadas en la mesofase de cristalizaci&oacute;n de prote&iacute;nas de membrana.

Cristalizaci&oacute;n de prote&iacute;nas de membrana en mesofases lip&iacute;dica. Un Host de l&iacute;pidos.

&#x6676;&#x4F53;&#x7ED3;&#x6784;&#x7814;&#x7A76; &#xFF08;2&#xFF09; &beta;-&#x80BE;&#x4E0A;&#x817A;&#x7D20;&#x80FD;&#x53D7;&#x4F53;&#x6FC0;&#x52A8;&#x5242;&#x4E0E;&#x5B83;&#x540C;&#x6E90;&#x7684; G &#x86CB;&#x767D;&#x590D;&#x5408;&#x4F53;&#x6700;&#x8FD1;&#x521A;&#x521A;&#x5DF2;&#x786E;&#x5B9A;&#x3002;&#x73B0;&#x5728;&#x662F;&#x53EF;&#x80FD;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x79CD;&#x8303;&#x5F0F;&#x7684;&#x8DE8;&#x819C;&#x53D7;&#x4F53;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x6FC0;&#x52A8;&#x5242;&#x3001; &#x819C;&#xFF0C;&#x5728;&#x901A;&#x4FE1;&#x7684;&#x51B2;&#x52A8;&#x6216;&#x4FE1;&#x53F7;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x548C;&#x8BAE;&#x6848;&#x4E2D;&#x8BBE;&#x7F6E;&#x4E00;&#x7CFB;&#x5217; G &#x86CB;&#x767D;&#x5B9A;&#x5411;&#x80DE;&#x5185;&#x53CD;&#x5E94;&#x7684;&#x624B;&#x6BB5;&#x3002;&#x7ED3;&#x6784;&#x662F;&#x4F7F;&#x7528;&#x5728;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x5408;&#x7406;&#x7684;&#x8102;&#x7C7B;&#x4E2D;&#x95F4;&#x589E;&#x52A0;&#x4E86;&#x6240;&#x8C13;&#x7EC6;&#x89C2;&#x65B9;&#x6CD5;&#x4E2D;&#x7684;&#x4E09;&#x5143;&#x590D;&#x5408;&#x4F53;&#x7684;&#x6676;&#x4F53;&#x6765;&#x786E;&#x5B9A;&#x7684;&#x3002;&#x8BE5;&#x65B9;&#x6CD5;&#x88AB;&#x8BC1;&#x660E;&#x7279;&#x522B;&#x6709;&#x7528;&#x7684; G &#x86CB;&#x767D;&#x5076;&#x8054;&#x53D7;&#x4F53;&#x5B57;&#x6BB5;&#x5DF2;&#x5728;&#x8FC7;&#x53BB;&#x7684; 5 &#x5E74;&#x4E2D;&#x786E;&#x5B9A;&#x7684; 13 &#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x53D7;&#x4F53;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E2D;&#x3002;&#x9664;&#x4E86;&#x53D7;&#x4F53;&#xFF0C;&#x8BE5;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5DF2;&#x8BC1;&#x660E;&#x662F;&#x79CD;&#x7C7B;&#x7E41;&#x591A;&#x7684;&#x5305;&#x62EC;&#x7EC6;&#x83CC;&#x548C;&#x771F;&#x6838; rhodopsins&#xFF0C;&#x6355;&#x5149;&#x590D;&#x6742; II &#xFF08;LHII&#xFF09;&#x3001; &#x5149;&#x5408;&#x53CD;&#x5E94;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x3001; &#x7EC6;&#x80DE;&#x8272;&#x7D20;&#x6C27;&#x5316;&#x9176;&#x3001; &beta; &#x6876;&#x3001; &#x6362;&#x70ED;&#x5668;&#x548C;&#x79EF;&#x5206;&#x819C;&#x80BD;&#x7684;&#x4E00;&#x4F53;&#x5F0F;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7C7B;&#x975E;&#x5E38;&#x6709;&#x7528;&#x3002;&#x8FD9;&#x8BC1;&#x660E;&#x4E86;&#x591A;&#x529F;&#x80FD;&#x6027;&#x548C;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x8303;&#x56F4;&#xFF0C;&#x5E76;&#x652F;&#x6301;&#x8FD9;&#x6837;&#x7684;&#x89C2;&#x70B9;&#xFF0C;&#x5728;&#x7EC6;&#x89C2;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5E94;&#x5217;&#x5165;&#x4E25;&#x91CD;&#x819C;&#x7ED3;&#x6784;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x5BB6;&#x7684;&#x963F;&#x68EE;&#x7EB3;&#x3002;&#x5BF9;&#x4E8E;&#x8FD9;&#x79CD;&#x60C5;&#x51B5;&#x53D1;&#x751F;&#xFF0C;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x613F;&#x91C7;&#x53D6;&#x5B83;&#x539F;&#x56E0;&#xFF0C;&#x90E8;&#x5206;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x5904;&#x7406;&#x4E2D;&#x95F4;&#x7684;&#x6676;&#x4F53;&#x751F;&#x957F;&#x7684;&#x7C98;&#x6027;&#x3001; &#x7C98;&#x6027;&#x7ACB;&#x65B9;&#x76F8;&#x8054;&#x7CFB;&#x7684;&#x9884;&#x671F;&#x56F0;&#x96BE;&#x5FC5;&#x987B;&#x514B;&#x670D;&#x3002;&#x6709;&#x4E9B;&#x60F6;&#x6050;&#xFF0C;&#x4E5F;&#x67E5;&#x770B;&#x4E86;&#x6536;&#x83B7;&#x548C;&#x6536;&#x96C6;&#x4E0E;&#x4E2D;&#x95F4;&#x751F;&#x957F;&#x7684;&#x6676;&#x4F53;&#x884D;&#x5C04;&#x6570;&#x636E;&#x3002;&#x5B83;&#x627F;&#x8BA4;&#x8FD8;&#x6709;&#x4E0E;&#x6B64;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5173;&#x8054;&#x7684;&#x6311;&#x6218;&#x3002;&#x591A;&#x5E74;&#x6765;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x52AA;&#x529B;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5728;&#x5206;&#x5B50;&#x6C34;&#x5E73;&#x4E0A;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x65B9;&#x5F0F;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4F7F;&#x5176;&#x65B9;&#x4FBF;&#x7528;&#x6237;&#x3002;&#x4E3A;&#x8FBE;&#x5230;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x76EE;&#x7684;&#xFF0C;&#x4E3A;&#x7B5B;&#x9009;&#x5728;&#x624B;&#x52A8;&#x548C;&#x81EA;&#x52A8;&#x6A21;&#x5F0F;&#x7684;&#x9AD8;&#x6548;&#x7ED3;&#x6676;&#x7F16;&#x5236;&#x4E86;&#x7528;&#x4E8E;&#x5904;&#x7406;&#x5728;&#x5FAE;&#x5FAE;-&#x65B0;&#x578B;&#x7EB3;&#x5347;&#x7EA7;&#x6BDB;&#x7EC6;&#x7BA1;&#x5377;&#x7CFB;&#x5217;&#x4E2D;&#x95F4;&#x7684;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5DF2;&#x5B9E;&#x65BD;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x91CD;&#x7EC4;&#x5230;&#x4F5C;&#x4E3A; crystallogenesis &#x7684;&#x524D;&#x594F;&#x7ACB;&#x65B9;&#x9636;&#x6BB5;&#x7684;&#x53CC;&#x5C42;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x63D0;&#x4F9B;&#x65E0;&#x4E0E;&#x4F26;&#x6BD4;&#x7684;&#x5149;&#x5B66;&#x8D28;&#x91CF;&#x548C;&#x5BF9;&#x65B0;&#x751F;&#x6676;&#x4F53;&#x7684;&#x654F;&#x611F;&#x6027;&#x7684;&#x73BB;&#x7483;&#x7ED3;&#x6676;&#x677F;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x5EFA;&#x6210;&#x3002;&#x8102;&#x8D28;&#x548C;&#x6C89;&#x6DC0;&#x5C4F;&#x5E55;&#x88AB;&#x7528;&#x4E8E;&#x66F4;&#x5408;&#x7406;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765; crystallogenesis &#x65B9;&#x6CD5;&#x73B0;&#x5728;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5E94;&#x7528;&#x5230;&#x66F4;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7C7B;&#x578B;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x9879;&#x5DE5;&#x4F5C;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#xFF0C;&#x4EA7;&#x751F;&#x4E86;&#x5BF9;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x6458;&#x8981;&#x6982;&#x8FF0;&#x4E86;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5404;&#x79CD;&#x5404;&#x6837;&#x7684;&#x8FDB;&#x5C55;&#x3002;&#x8981;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x53D1;&#x5C55;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x5FC5;&#x987B;&#x514B;&#x670D;&#x7684;&#x6311;&#x6218;&#x548C;&#x524D;&#x666F;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x63CF;&#x8FF0;&#x3002;

&#x4F7F;&#x7528;&#x6676;&#x4F53;&#x5B66;&#x548C;&#x6CB9;&#x8102;&#x9AD8;&#x80FD;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7ED3;&#x6784;&#x6D4B;&#x5B9A;&#xFF1A; &#x6700;&#x65B0;&#x8FDB;&#x5C55;&#x548C;&#x6210;&#x529F;&#x3002;

The crystal structure of the Î²(2)-adrenergic receptor in complex with an agonist and its cognate G protein has just recently been determined. It is now possible to explore in molecular detail the means by which this paradigmatic transmembrane receptor binds agonist, communicates the impulse or signaling event across the membrane, and sets in motion a series of G protein-directed intracellular responses. The structure was determined using crystals of the ternary complex grown in a rationally designed lipidic mesophase by the so-called in meso method. The method is proving to be particularly useful in the G protein-coupled receptor field where the structures of 13 distinct receptor types have been determined in the past 5 years. In addition to receptors, the method has proven to be useful with a wide variety of integral membrane protein classes that include bacterial and eukaryotic rhodopsins, light-harvesting complex II (LHII), photosynthetic reaction centers, cytochrome oxidases, Î²-barrels, an exchanger, and an integral membrane peptide. This attests to the versatility and range of the method and supports the view that the in meso method should be included in the arsenal of the serious membrane structural biologist. For this to happen, however, the reluctance to adopt it attributable, in part, to the anticipated difficulties associated with handling the sticky, viscous cubic mesophase in which crystals grow must be overcome. Harvesting and collecting diffraction data with the mesophase-grown crystals are also viewed with some trepidation. It is acknowledged that there are challenges associated with the method. Over the years, we have endeavored to establish how the method works at a molecular level and to make it user-friendly. To these ends, tools for handling the mesophase in the pico- to nanoliter volume range have been developed for highly efficient crystallization screening in manual and robotic modes. Methods have been implemented for evaluating the functional activity of membrane proteins reconstituted into the bilayer of the cubic phase as a prelude to crystallogenesis. Glass crystallization plates that provide unparalleled optical quality and sensitivity to nascent crystals have been built. Lipid and precipitant screens have been designed for a more rational approach to crystallogenesis such that the method can now be applied to an even wider variety of membrane protein types. In this work, these assorted advances are outlined along with a summary of the membrane proteins that have yielded to the method. The prospects for and the challenges that must be overcome to further develop the method are described.

Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases: recent advances and successes.

La structure cristalline du (2) &beta;-adr&eacute;nergique dans complexe avec un agoniste et sa prot&eacute;ine G apparent&eacute; tout r&eacute;cemment a &eacute;t&eacute; d&eacute;termin&eacute;e. Il est maintenant possible d&#39;explorer en d&eacute;tail mol&eacute;culaire les moyens par lesquels ce r&eacute;cepteur transmembranaire paradigmatique lie agoniste, communique l&#39;impulsion ou l&#39;&eacute;v&eacute;nement signalisation &agrave; travers la membrane et met en mouvement une s&eacute;rie de r&eacute;ponses intracellulaires ax&eacute;s sur la prot&eacute;ine de G. La structure a &eacute;t&eacute; d&eacute;termin&eacute;e &agrave; l&#39;aide de cristaux du complexe ternaire cultiv&eacute; dans une m&eacute;sophase lipidique rationnellement con&ccedil;ue par la soi-disant m&eacute;thode m&eacute;so. La m&eacute;thode s&#39;av&egrave;re particuli&egrave;rement utile dans le domaine de r&eacute;cepteurs coupl&eacute;s aux prot&eacute;ines G o&ugrave; les structures de 13 types de r&eacute;cepteurs distincts ont &eacute;t&eacute; d&eacute;termin&eacute;es dans les 5 derni&egrave;res ann&eacute;es. En plus des r&eacute;cepteurs, c&#39;est la m&eacute;thode qui s&#39;est av&eacute;r&eacute; utile avec une grande vari&eacute;t&eacute; de classes de prot&eacute;ines membranaires intrins&egrave;ques qui incluent des bact&eacute;ries et des eucaryotes rhodopsines, lumi&egrave;re-r&eacute;colte complexe II (LHII), centres de r&eacute;action photosynth&eacute;tique, cytochrome oxydases, &beta;-barils, un &eacute;changeur et un peptide membranaire int&eacute;gr&eacute;. Cela t&eacute;moigne de la polyvalence et la port&eacute;e de la m&eacute;thode et appuie l&#39;opinion que l&#39;en m&eacute;so m&eacute;thode devrait &ecirc;tre inclus dans l&#39;arsenal du biologiste structurelles graves membrane. Pour ce faire, toutefois, la r&eacute;ticence &agrave; adopter attribuable, en partie, aux difficult&eacute;s pr&eacute;vues associ&eacute;es &agrave; la manipulation de la m&eacute;sophase cube collante et visqueuse dans lequel grandissent les cristaux doit &ecirc;tre surmont&eacute;e. R&eacute;colte et la collecte des donn&eacute;es de diffraction avec les cristaux cultiv&eacute;s m&eacute;sophase sont &eacute;galement per&ccedil;ues avec une certaine appr&eacute;hension. Il est reconnu qu&#39;il y a des d&eacute;fis associ&eacute;s &agrave; la m&eacute;thode. Au cours des ann&eacute;es, nous avons essay&eacute; d&#39;&eacute;tablir comment la m&eacute;thode fonctionne &agrave; un niveau mol&eacute;culaire et pour le rendre convivial. Pour atteindre ces objectifs, outils pour le traitement de la m&eacute;sophase &agrave; pico ou nanolitres plage de volume ont &eacute;t&eacute; d&eacute;velopp&eacute;s pour la cristallisation tr&egrave;s efficace de d&eacute;pistage dans les modes manuels et robotis&eacute;s. M&eacute;thodes ont &eacute;t&eacute; appliqu&eacute;es pour l&#39;&eacute;valuation de l&#39;activit&eacute; fonctionnelle des prot&eacute;ines membranaires reconstitu&eacute;e dans la bicouche de la phase cubique en pr&eacute;lude au crystallogenesis. Plaques de cristallisation de verre qui offrent une qualit&eacute; optique in&eacute;gal&eacute;e et sensibilit&eacute; aux cristaux naissante ont &eacute;t&eacute; construits. Lipides et pr&eacute;cipitant &eacute;crans ont &eacute;t&eacute; con&ccedil;us pour une approche plus rationnelle de crystallogenesis telle que la m&eacute;thode peut maintenant &ecirc;tre appliqu&eacute;e &agrave; une gamme encore plus large de types de prot&eacute;ines membranaires. Dans ce travail, ces avances assorties sont &eacute;nonc&eacute;es ainsi qu&#39;un r&eacute;sum&eacute; des prot&eacute;ines membranaires qui ont abouti &agrave; la m&eacute;thode. Les perspectives et les d&eacute;fis qui doivent &ecirc;tre surmont&eacute;s pour continuer &agrave; d&eacute;velopper la m&eacute;thode sont d&eacute;crites.

D&eacute;termination de structure des prot&eacute;ines membranaires &agrave; l&#39;aide de la cristallographie et m&eacute;sophases lipidiques : progr&egrave;s r&eacute;cents et succ&egrave;s.

Die Kristallstruktur von (2) &beta;-adrenerge Rezeptoren im Komplex mit ein Agonist und seine Verwandten G-Protein erst vor kurzem festgestellt wurde. Es ist jetzt m&ouml;glich, auf molekularer erkunden die Mittel mit denen dieser paradigmatischen Transmembran Rezeptor bindet Agonist, kommuniziert der Impuls oder Signalling-Ereignis durch die Membran und bringt in Bewegung ein Reihe von G-Protein-gesteuerte intrazellul&auml;re Antworten. Die Struktur wurde mit Kristallen des tern&auml;ren komplexes angebaut in einer rational gestalteten lipidischen Mesophase durch die sogenannte Meso-Methode ermittelt. Die Methode erweist sich als besonders n&uuml;tzlich im Feld G-Protein-gekoppelter Rezeptor sein, wo die Strukturen der 13 verschiedene Rezeptortypen in den letzten 5 Jahren bestimmt wurden. Neben Rezeptoren hat die Methode bew&auml;hrt, mit einer Vielzahl von integralen Membrane Protein Klassen n&uuml;tzlich sein, die bakterielle und eukaryotische Rhodopsin, Licht-ernten Komplex II (LHII), photosynthetischen Reaktion Zentren Cytochrom Oxidases, &beta;-Barrel, eine W&auml;rmetauscher und eine integrale Membrane-Peptid enthalten. Dies zeugt von der Vielseitigkeit und dem Bereich der Methode und unterst&uuml;tzt die Ansicht, dass die in Meso-Methode in das Arsenal der strukturellen Biologin schwere Membran aufgenommen werden sollten. Dazu muss das Widerstreben anzunehmen es zur&uuml;ckzuf&uuml;hren, jedoch teilweise auf die erwarteten Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Handhabung der klebrige, z&auml;hfl&uuml;ssige kubische Mesophase in denen Kristalle wachsen &uuml;berwunden werden. Ernte und Beugung Datenerhebung mit den Mesophase gewachsenen Kristalle werden auch mit einer gewissen Beklommenheit betrachtet. Es wird anerkannt, dass gibt es Herausforderungen, die der Methode zugeordnet. In den Jahren haben wir versucht, festzulegen, wie die Methode auf molekularer Ebene funktioniert und benutzerfreundlich zu gestalten. Zu diesem Zweck wurden Werkzeuge f&uuml;r den Umgang mit der Mesophase in der Pico-zu Nanoliter Volumenbereich f&uuml;r hocheffiziente Kristallisation screening im manuellen Modus und Roboter entwickelt. Methoden wurden f&uuml;r die Bewertung der funktionalen Aktivit&auml;t von Membranproteinen rekonstituiert in der Bilayer der kubische Phase als Auftakt zu Crystallogenesis umgesetzt. Kristallisation Glasplatten, die unvergleichliche optische Qualit&auml;t und Sensibilit&auml;t f&uuml;r entstehende Kristalle wurden gebaut. Lipid und Ausf&auml;llungen Bildschirme haben einen rationaleren Ansatz f&uuml;r Crystallogenesis so konzipiert, dass die Methode jetzt auf eine noch breitere Palette von Membran-Protein-Typen angewendet werden kann. In dieser Arbeit werden diese sortierten Fortschritte zusammen mit einer Zusammenfassung der Membranproteine beschrieben, die an die Methode ergeben haben. Die Perspektiven und Herausforderungen, die &uuml;berwunden werden m&uuml;ssen, um die Methode weiterzuentwickeln sind beschrieben.

Membran-Protein-Struktur-Bestimmung mit der Kristallographie und lipidischen Mesophasen: die j&uuml;ngsten Fortschritte und Erfolge.

La struttura di cristallo (2) con la &beta;-recettori adrenergici nel complesso con un agonista e sue cognata G proteina solo recentemente sono stato determinato. Ora &egrave; possibile esplorare in dettaglio molecolare i mezzi da cui questo recettore transmembrana paradigmatico associa agonista, comunica l&#39;impulso o segnalazione di eventi attraverso la membrana e mette in moto una serie di risposte intracellulare della proteina-regia di G. La struttura &egrave; stata determinata utilizzando cristalli del complesso ternario cresciuto in un mesophase lipidico razionalmente progettati dal cosiddetto metodo meso. Il metodo si sta rivelando particolarmente utile nel campo dei recettori accoppiati a proteine G dove le strutture di 13 tipi di recettori distinti sono state determinate in passato 5 anni. Oltre ai recettori, il metodo ha dimostrato di essere utile con un&#39;ampia variet&agrave; di classi di proteine integrali di membrana che includono rhodopsins batterici ed eucariotici, luce-raccolta complesso II (TEII), centri di reazione fotosintetici, citocromo ossidasi, &beta;-botti, uno scambiatore e un peptide integrali di membrana. Questo testimonia la versatilit&agrave; e la gamma del metodo e supporta la visualizzazione che la in meso metodo deve essere incluso nell&#39;arsenale del biologo strutturale serio membrana. A tal fine, tuttavia, la riluttanza ad adottarlo attribuibile, in parte, alle difficolt&agrave; atteso associato gestisce l&#39;appiccicoso e viscoso mesophase cubico in cui crescono cristalli deve essere superata. Raccolta e la raccolta dei dati di diffrazione con i cristalli coltivati mesophase sono visti anche con una certa trepidazione. &Egrave; riconosciuto che ci sono sfide associate al metodo. Nel corso degli anni, noi abbiamo tentato di stabilire come il metodo funziona a livello molecolare e per renderlo facile da usare. A tal fine, strumenti per la gestione del mesophase in pico-a range di volume nanolitro sono stati sviluppati per cristallizzazione altamente efficiente di screening in modalit&agrave; manuale e robotizzata. Metodi sono stati implementati per valutare l&#39;attivit&agrave; funzionale delle proteine di membrana ricostituito nel doppio strato della fase cubica come un preludio alla crystallogenesis. Lastre di vetro cristallizzazione che forniscono impareggiabile qualit&agrave; ottica e la sensibilit&agrave; ai cristalli nascenti sono state costruite. Lipidi e precipitante schermi sono stati progettati per un approccio pi&ugrave; razionale per crystallogenesis tale che il metodo ora pu&ograve; essere applicato ad una variet&agrave; ancora pi&ugrave; ampia di tipi di proteine di membrana. In questo lavoro, questi progressi assortiti sono delineati insieme ad una sintesi delle proteine di membrana che hanno ceduto al metodo. Vengono descritte le prospettive e le sfide che devono essere superate per sviluppare ulteriormente il metodo.

Determinazione della struttura della proteina membrana utilizzando la cristallografia e lipidico mesophases: recenti progressi e successi.

&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020; (2) &beta;-&#x30A2;&#x30C9;&#x30EC;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30A2;&#x30B4;&#x30CB;&#x30B9;&#x30C8;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x540C;&#x65CF;&#x306E; G &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3068;&#x306E;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306F;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3061;&#x3087;&#x3046;&#x3069;&#x6700;&#x8FD1;&#x3002;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x3068;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30D1;&#x30E9;&#x30C0;&#x30A4;&#x30E0;&#x306E;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x578B;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30A2;&#x30B4;&#x30CB;&#x30B9;&#x30C8;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x30A4;&#x30F3;&#x30D1;&#x30EB;&#x30B9;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0; &#x30A4;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C8;&#x306B;&#x819C;&#x3092;&#x8D8A;&#x3048;&#x3066;&#x901A;&#x4FE1;&#x3059;&#x308B;&#x3057;&#x3001;G &#x76E3;&#x7763;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306E;&#x30B7;&#x30EA;&#x30FC;&#x30BA;&#x3092;&#x958B;&#x59CB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x624B;&#x6BB5;&#x3092;&#x63A2;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x5408;&#x7406;&#x7684;&#x8A2D;&#x8A08;&#x8102;&#x8CEA;&#x30E1;&#x30BD;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30BA; &#x30E1;&#x30BD; &#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306E;&#x3044;&#x308F;&#x3086;&#x308B;&#x6210;&#x9577;&#x4E09;&#x5143;&#x932F;&#x4F53;&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x304C; 13 &#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30EC;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x578B;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x304C;&#x3001;&#x904E;&#x53BB;&#x306B;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x3066; G &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5171;&#x5F79;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x5206;&#x91CE;&#x3067;&#x7279;&#x306B;&#x6709;&#x7528;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x8A3C;&#x660E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B; 5 &#x5E74;&#x9593;&#x3002;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306B;&#x52A0;&#x3048;&#x3066;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x591A;&#x7A2E;&#x591A;&#x69D8;&#x306A;&#x96C6;&#x5149;&#x8907;&#x5408; II (LHII)&#x3001;&#x5149;&#x5408;&#x6210;&#x53CD;&#x5FDC;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x30C1;&#x30C8;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30C0;&#x30FC;&#x30BC;&#x3001;&beta; 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crystallogenesis &#x3088;&#x308A;&#x5408;&#x7406;&#x7684;&#x306A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x4F5C;&#x696D;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5404;&#x7A2E;&#x306E;&#x9032;&#x6B69;&#x306B;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x304C;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x6982;&#x8981;&#x3068;&#x5171;&#x306B;&#x6982;&#x8AAC;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x3092;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x958B;&#x767A;&#x3092;&#x514B;&#x670D;&#x3057;&#x306A;&#x3051;&#x308C;&#x3070;&#x306A;&#x3089;&#x306A;&#x3044;&#x8AB2;&#x984C;&#x3068;&#x5C55;&#x671B;&#x3092;&#x53C2;&#x7167;&#x3057;&#x3066;&#x304F;&#x3060;&#x3055;&#x3044;&#x3002;

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&Beta; (2)&#xC758; &#xACB0;&#xC815; &#xAD6C;&#xC870;-&#xC544;&#xB4DC;&#xB808;&#xB0A0;&#xB9B0; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xAE38; &#xD56D; &#xC81C;&#xC640; &#xADF8; &#xB3D9;&#xC871; G &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD5C;&#xADFC; &#xACB0;&#xC815; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC9C0;&#xAE08; &#xBD84;&#xC790; &#xC138;&#xBD80; &#xC0AC;&#xD56D;&#xC5D0;&#xB294;&#xC774; &#xC804;&#xD615;&#xC801;&#xC778; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xAE38; &#xD56D; &#xC81C;, &#xCDA9; &#xB3D9; &#xB610;&#xB294; &#xC2E0;&#xD638; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8;, &#xB9C9; &#xD1B5;&#xC2E0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0; &#xBAA8;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xC751;&#xB2F5; G &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAC10;&#xB3C5;&#xC758; &#xC2DC;&#xB9AC;&#xC988;&#xB97C; &#xC124;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xC218;&#xB2E8;&#xC744; &#xD0D0;&#xAD6C; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xC774; &#xAC00;&#xB2A5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAD6C;&#xC870;&#xB294; &#xC0BC;&#xD56D; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC18C;&#xC704; &#xBBF8;&#xC2DC;&#xC801; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD569;&#xB9AC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC124;&#xACC4; &#xB41C; lipidic mesophase &#xC7AC;&#xBC30;&#xC758; &#xACB0;&#xC815;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xACB0;&#xC815; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB294; &#xC9C0;&#xB09C; 5 &#xB144; &#xB3D9;&#xC548;&#xC5D0; &#xACB0;&#xC815; &#xB41C; 13 &#xACE0;&#xC720; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xD615;&#xC2DD;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870; G &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0;&#xD569; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xBD84;&#xC57C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD2B9;&#xD788; &#xC720;&#xC6A9; &#xD558; &#xC99D;&#xBA85; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC774;&#xC678;&#xC5D0; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC138;&#xADE0;&#xACFC; &#xC9C4; &#xD575; rhodopsins, &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; 2 &#xCC28; (LHII), &#xAD11;&#xD569;&#xC131; &#xBC18;&#xC751; &#xC13C;&#xD130;, &#xC2DC; &#xD1A0; &#xD06C;&#xB86C; oxidases, &beta;-&#xBC30;&#xB7F4;, &#xAD50;&#xD658;&#xAE30;&#xB97C; &#xBC0F; &#xC815;&#xC218; &#xB9C9; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xBE5B; &#xC218;&#xD655;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC815;&#xC218; &#xACC4;&#xC5F4; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD074;&#xB798;&#xC2A4;&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xB3C4;&#xC6C0;&#xC774; &#xB420; &#xC785;&#xC99D; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xB2E4;&#xC7AC; &#xB2E4;&#xB2A5; &#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xBC94;&#xC704;&#xB97C; &#xC99D;&#xBA85; &#xD558; &#xACE0; &#xBCF4;&#xAE30;&#xB97C; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xD558;&#xB294; &#xBBF8;&#xC2DC;&#xC801; &#xBC29;&#xBC95; &#xC2EC;&#xAC01;&#xD55C; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xAD6C;&#xC870; &#xC0DD;&#xBB3C;&#xD559;&#xC758; &#xBB34;&#xAE30;&#xACE0;&#xC5D0; &#xD3EC;&#xD568; &#xB418;&#xC5B4;&#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xC774;&#xB7F0; &#xC77C;&#xC774;,, &#xAE30;&#xC778;, &#xADF8;&#xAC83;&#xC744; &#xCC44;&#xD0DD; &#xC8FC;&#xC800; &#xBD80;&#xBD84;&#xC5D0; &#xC2A4;&#xD2F0;&#xCEE4;, &#xC810;&#xC131; &#xC785;&#xBC29; mesophase &#xACB0;&#xC815; &#xC131;&#xC7A5; &#xCC98;&#xB9AC;&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xC608;&#xC0C1;&#xB41C; &#xBB38;&#xC81C;&#xB97C; &#xADF9;&#xBCF5; &#xB418;&#xC5B4;&#xC57C;. &#xC218;&#xD655; &#xBC0F; mesophase &#xC131;&#xC7A5; &#xACB0;&#xC815; &#xD68C;&#xC808; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC218;&#xC9D1; &#xB610;&#xD55C; &#xC77C;&#xBD80; &#xC804;&#xC728;&#xACFC; &#xD568;&#xAED8; &#xBCFC; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; &#xD574;&#xB2F9; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xACFC;&#xC81C;&#xB294; &#xC2B9;&#xC778; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB144; &#xB3D9;&#xC548;, &#xC6B0;&#xB9AC; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xBD84;&#xC790; &#xC218;&#xC900;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5B4;&#xB5BB;&#xAC8C; &#xC124;&#xC815; &#xD558; &#xACE0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xAE30; &#xC26C;&#xC6B4; &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; endeavored &#xC788;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB05D; mesophase &#xD53C;&#xCF54;-nanoliter &#xBCFC;&#xB968; &#xBC94;&#xC704;&#xB97C; &#xCC98;&#xB9AC; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C; &#xC218;&#xB3D9; &#xBC0F; &#xB85C;&#xBD07; &#xBAA8;&#xB4DC;&#xC5D0; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xACB0;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Crystallogenesis &#xC804;&#xC8FC;&#xACE1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC785;&#xBC29; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC758; bilayer&#xB85C; &#xC7AC;&#xAD6C;&#xC131; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xAD6C;&#xD604; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC720;&#xB9AC; &#xACB0;&#xC815; &#xD654; &#xC811;&#xC2DC; &#xCD5C;&#xACE0;&#xC758; &#xAD11;&#xD559; &#xD488;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xCD08;&#xAE30; &#xACB0;&#xC815;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBBFC;&#xAC10;&#xB3C4; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xAC74;&#xC124; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC9C0;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xB0B4;&#xB824;&#xC9C4; &#xD654;&#xBA74; &#xBC29;&#xBC95; &#xC774;&#xC81C; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC885;&#xB958;&#xC758; &#xB354; &#xB113;&#xC740; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC801;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; crystallogenesis&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB354; &#xD569;&#xB9AC;&#xC801;&#xC778; &#xC811;&#xADFC;&#xC744; &#xC704;&#xD574; &#xC124;&#xACC4; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC791;&#xD488;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC9C4;&#xBCF4; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xC5D0; &#xB098;&#xC654;&#xACE0; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC694;&#xC57D;&#xACFC; &#xD568;&#xAED8; &#xC124;&#xBA85; &#xB418;&#xC5B4; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC804;&#xB9DD; &#xBC0F; &#xCD94;&#xAC00; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xADF9;&#xBCF5; &#xB418;&#xC5B4;&#xC57C; &#xD558;&#xB294; &#xACFC;&#xC81C;&#xC5D0; &#xB300;&#xD574;&#xC11C;&#xB294; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAD6C;&#xC870; &#xACB0;&#xC815; &#xACB0;&#xC815;&#xD559; &#xBC0F; lipidic mesophases&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;: &#xCD5C;&#xADFC; &#xBC1C;&#xC804; &#xD558; &#xACE0; &#xC131;&#xACF5;.

La estructura cristalina de la &beta; (2)-receptores adren&eacute;rgicos en complejo con un agonista y su prote&iacute;na G cognado recientemente ha sido determinada. Ahora es posible explorar en detalle molecular los medios por el cual este receptor transmembrana paradigm&aacute;tico une el agonista, comunica el impulso o la se&ntilde;alizaci&oacute;n del evento a trav&eacute;s de la membrana y pone en marcha una serie de respuestas intracelulares dirigidas prote&iacute;na de G. La estructura se determin&oacute; usando cristales del complejo ternario crecido en una mesofase lip&iacute;dica racionalmente dise&ntilde;ado por el supuesto m&eacute;todo de meso. El m&eacute;todo est&aacute; demostrando para ser particularmente &uacute;til en el campo del receptor acoplado a prote&iacute;nas G donde se han determinado las estructuras de 13 tipos de receptores diferentes en los &uacute;ltimos 5 a&ntilde;os. Adem&aacute;s de los receptores, el m&eacute;todo ha demostrado para ser &uacute;til en una amplia variedad de clases de prote&iacute;nas de membrana integral que incluyen bacterias y eucariotas rodopsinas, recolecci&oacute;n de luz complejo II (LHII), centros de reacci&oacute;n fotosint&eacute;tica, citocromo oxidasas, &beta;-barriles, un cambiador y un p&eacute;ptido de integral de la membrana. Esto da fe de la versatilidad y la gama del m&eacute;todo y apoya la visi&oacute;n que el en meso m&eacute;todo deber&iacute;a incluirse en el arsenal del bi&oacute;logo estructural de la membrana seria. Para que esto suceda, sin embargo, la reticencia a adoptarlo atribuible, en parte, a las dificultades anticipadas asociadas con el manejo de la mesofase c&uacute;bico pegajoso y viscoso en el cual crecen cristales debe ser superada. Cosecha y recolecci&oacute;n de datos de difracci&oacute;n con los cristales cultivados mesofases tambi&eacute;n son vistos con cierta inquietud. Se reconoce que existen problemas asociados con el m&eacute;todo. Con los a&ntilde;os, nos hemos esforzado para establecer c&oacute;mo el m&eacute;todo funciona a nivel molecular y para que sea f&aacute;cil de usar. Para estos fines, se han desarrollado herramientas para manejar las mesofases en el pico-rango de volumen de nanoliter de cristalizaci&oacute;n muy eficiente en los modos manual y rob&oacute;ticos. Se han implementado m&eacute;todos para evaluar la actividad funcional de las prote&iacute;nas de membrana reconstituido en la bicapa de la fase c&uacute;bica como preludio a la crystallogenesis. Placas de cristalizaci&oacute;n de cristal que proporcionan calidad &oacute;ptica y sensibilidad a la nacientes cristales han sido construidas. L&iacute;pidos y precipitado pantallas han sido dise&ntilde;adas para un enfoque m&aacute;s racional para crystallogenesis que el m&eacute;todo puede aplicarse ahora a una m&aacute;s amplia variedad de tipos de prote&iacute;nas de membrana. En este trabajo, se describen estos avances clasificados junto con un Resumen de las prote&iacute;nas de membrana que se han rendido al m&eacute;todo. Las perspectivas y los retos que deben ser superados para desarrollar el m&eacute;todo se describen.

Determinaci&oacute;n de estructura de prote&iacute;nas de membrana mediante cristalograf&iacute;a y mesofases lip&iacute;dica: avances recientes y &eacute;xitos.

Dianfan Li

Membrane Structural and Functional Biology Group,
Schools of Medicine and Biochemistry & Immunology,
Membrane Structural and Functional Biology Group, Schools of Medicine and Biochemistry & Immunology

Trinity College Dublin

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Dianfan Li

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Membrane Structural and Functional Biology Group,Schools of Medicine and Biochemistry & Immunology,Membrane Structural and Functional Biology Group, Schools of Medicine and Biochemistry & Immunology

Trinity College Dublin

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Membrane Structural and Functional Biology Group,
Schools of Medicine and Biochemistry & Immunology,
Membrane Structural and Functional Biology Group, Schools of Medicine and Biochemistry & Immunology