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Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

State University of New York Upstate Medical University

&#x540C;&#x6E90;&#x91CD;&#x7EC4;&#x662F;&#x4E00;&#x4E2A;&#x4FDD;&#x5B88;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x8FC7;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x4E3B;&#x8981;&#x662F;&#x5DF2;&#x5F62;&#x6210;&#x7684;&#x53CC;&#x94FE; DNA &#x65AD;&#x88C2;&#x4FEE;&#x590D;&#x548C;&#x505C;&#x6EDE;&#x590D;&#x5236;&#x53C9;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x5728;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x4E2D;&#x7684;&#x91CD;&#x7EC4;&#x673A;&#x68B0;&#x662F;&#x751A;&#x5C11;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A;&#x9175;&#x6BCD;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53; nucleoid &#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;Mgm101&#xFF0C;&#x5173;&#x4E4E;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x4ECE;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x751F;&#x7269;&#x4F53;&#x5185;&#x666E;&#x904D;&#x5B58;&#x5728;&#x7684; Rad52 &#x578B;&#x91CD;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;Mgm101 &#x662F;&#x91CD;&#x590D;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x91CD;&#x7EC4;&#x548C;&#x6291;&#x5236;&#x4F53;&#x5185;&#x7684; mtDNA &#x788E;&#x7247;&#x6240;&#x5FC5;&#x9700;&#x7684;&#x3002;&#x5B83;&#x4F18;&#x5148;&#x5C06;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x5355;&#x94FE; DNA &#x548C;&#x50AC;&#x5316;&#x9000;&#x706B;&#x4E0E;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53; ssDNA &#x7ED1;&#x5B9A;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;Rim1 ssDNA precomplexed&#x3002;&#x900F;&#x5C04;&#x7535;&#x955C;&#x663E;&#x793A; Mgm101 &#x7A97;&#x4F53; &sim;14 &#x6298;&#x5BF9;&#x79F0;&#x6027;&#x548C;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x538B;&#x7F29;&#x87BA;&#x65CB;&#x4E1D;&#x5927;&#x5BE1;&#x805A;&#x73AF;&#x3002;&#x5F71;&#x54CD;&#x73AF;&#x5F62;&#x6210;&#x7684;&#x7279;&#x5B9A;&#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8;&#x964D;&#x4F4E;&#x4F53;&#x5916;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7A33;&#x5B9A;&#x6027;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6570;&#x636E;&#x8868;&#x660E;&#x73AF;&#x7ED3;&#x6784;&#x53EF;&#x63D0;&#x4F9B;&#x811A;&#x624B;&#x67B6;&#x9547;&#x5B9A;&#x7684; Mgm101 &#x901A;&#x8FC7;&#x9632;&#x6B62;&#x5426;&#x5219;&#x4E3A;&#x4E0D;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7684;&#x5355;&#x4F53;&#x5F62;&#x6001;&#x7684;&#x805A;&#x5408;&#x3002;&#x5728;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230; ssDNA&#xFF0C;Mgm101 &#x88AB;&#x884C;&#x5F84;&#x4ECE;&#x73AF;&#xFF0C;&#x5F62;&#x6210;&#x72EC;&#x7279;&#x7684;&#x6838;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7EC6;&#x4E1D;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7814;&#x7A76;&#x8868;&#x660E;&#x5728;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x7684;&#x539F;&#x7C4D;&#x53EF;&#x80FD;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x7684;&#x91CD;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x548C;&#x652F;&#x6301;&#x8FD9;&#x4E00;&#x6982;&#x5FF5;&#xFF0C;&#x91CD;&#x7EC4;&#x662F;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6216;&#x7F3A;&#x7684; mtDNA &#x5B8C;&#x6574;&#x6027;&#x3002;

Mgm101 &#x662F;&#x4E0E; Rad52 &#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53; DNA &#x91CD;&#x7EC4;&#x3002;

Homologous recombination is a conserved molecular process that has primarily evolved for the repair of double-stranded DNA breaks and stalled replication forks. However, the recombination machinery in mitochondria is poorly understood. Here, we show that the yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is related to the Rad52-type recombination proteins that are widespread in organisms from bacteriophage to humans. Mgm101 is required for repeat-mediated recombination and suppression of mtDNA fragmentation in vivo. It preferentially binds to single-stranded DNA and catalyzes the annealing of ssDNA precomplexed with the mitochondrial ssDNA-binding protein, Rim1. Transmission electron microscopy showed that Mgm101 forms large oligomeric rings of âˆ¼14-fold symmetry and highly compressed helical filaments. Specific mutations affecting ring formation reduce protein stability in vitro. The data suggest that the ring structure may provide a scaffold for stabilization of Mgm101 by preventing the aggregation of the otherwise unstable monomeric conformation. Upon binding to ssDNA, Mgm101 is remobilized from the rings to form distinct nucleoprotein filaments. These studies reveal a recombination protein of likely bacteriophage origin in mitochondria and support the notion that recombination is indispensable for mtDNA integrity.

Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination.

La recombinaison homologue est un processus mol&#xE9;culaire qui a conserv&#xE9; principalement &#xE9;volu&#xE9; pour la r&#xE9;paration des cassures de l&#x26;#39;ADN double-brin et fourches de r&#xE9;plication bloqu&#xE9;es. Toutefois, la machinerie de recombinaison dans les mitochondries est mal comprise. Ici, nous montrons que la prot&#xE9;ine nucl&#xE9;o&#xEF;de mitochondrial de la levure, Mgm101, est li&#xE9;e &#xE0; des prot&#xE9;ines de recombinaison Rad52 de type qui sont tr&#xE8;s r&#xE9;pandues dans les organismes du bact&#xE9;riophage &#xE0; l&#x26;#39;homme. Mgm101 est n&#xE9;cessaire pour la recombinaison induite par r&#xE9;p&#xE9;tition et de la r&#xE9;pression de l&#x26;#39;ADNmt de fragmentation in vivo. Il se lie pr&#xE9;f&#xE9;rentiellement &#xE0; l&#x26;#39;ADN simple brin et le recuit de catalyse ADNsb precomplexed avec l&#x26;#39;ADNsb mitochondriale prot&#xE9;ine de liaison, Rim1. Microscopie &#xE9;lectronique &#xE0; transmission ont montr&#xE9; que Mgm101 formes oligom&#xE9;riques de grands anneaux de sym&#xE9;trie ~ 14 fois et fortement compress&#xE9;es filaments h&#xE9;lico&#xEF;daux. Des mutations sp&#xE9;cifiques qui affectent la formation des anneaux de r&#xE9;duire la stabilit&#xE9; des prot&#xE9;ines in vitro. Les donn&#xE9;es sugg&#xE8;rent que la structure en anneau peut fournir un &#xE9;chafaudage pour la stabilisation de Mgm101 en emp&#xEA;chant l&#x26;#39;agr&#xE9;gation de la conformation contraire instable monom&#xE8;re. Lors de la liaison &#xE0; ADN simple brin, est remobilis&#xE9; Mgm101 des anneaux pour former des filaments nucl&#xE9;oprot&#xE9;iques distinctes. Ces &#xE9;tudes r&#xE9;v&#xE8;lent une prot&#xE9;ine de recombinaison d&#x26;#39;origine bact&#xE9;riophage susceptibles dans les mitochondries et de soutenir la notion que la recombinaison est indispensable pour l&#x26;#39;int&#xE9;grit&#xE9; ADNmt.

Mgm101 est une prot&#xE9;ine Rad52 li&#xE9;e requis pour la recombinaison d&#x26;#39;ADN mitochondrial

Homologe Rekombination ist ein konservierten Molekulare Prozess, der in erster Linie entwickelt f&uuml;r die Reparatur von Br&uuml;chen doppelstr&auml;ngige DNA und ins Stocken geraten Replikation Gabeln. Allerdings ist die Rekombination-Maschinerie in den Mitochondrien schlecht verstanden. Hier zeigen wir, dass das Hefe mitochondriale Kern&auml;quivalent Protein, Mgm101, mit Rad52-Typ Rekombination Proteine, die in Organismen von Bakteriophage Menschen weit verbreitet sind. Mgm101 ist erforderlich f&uuml;r Wiederholung-vermittelten Rekombination und Unterdr&uuml;ckung der MtDNA Fragmentierung in-vivo. Es bevorzugt an einzelstr&auml;ngige DNA bindet und katalysiert das Gl&uuml;hen von SsDNA-Precomplexed mit der mitochondrialen SsDNA-verbindliches Protein, Rim1. Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, dass Mgm101 gro&szlig;e Oligomere Ringe des &sim;14-Fold-Symmetrie und hochkomprimierten spiralf&ouml;rmige Filamenten bildet. Spezifische Mutationen Ring Bildung reduzieren Protein Stabilit&auml;t in-vitro. Die Daten legen nahe, dass die Ringstruktur ein Ger&uuml;st zur Stabilisierung des Mgm101 bieten kann, indem verhindert die Aggregation von den ansonsten unstable Monomer Konformation. Bei der Bindung an SsDNA, ist Mgm101 von den Ringen um unterschiedliche Nukleoprotein Filamente bilden reaktiviert. Diese Studien zeigen eine Rekombination Eiwei&szlig; wahrscheinlich Bakteriophage in den Mitochondrien, und unterst&uuml;tzen das Konzept dieser Rekombination ist unverzichtbar f&uuml;r MtDNA Integrit&auml;t.

Mgm101 ist ein Rad52-bezogene-Protein f&uuml;r mitochondriale DNA-Rekombination erforderlich.

Ricombinazione omologa &egrave; un conservato processo molecolare che ha principalmente si &egrave; evoluta per la riparazione di rotture del DNA double-stranded e forcelle replica in stallo. Tuttavia, il macchinario di ricombinazione nei mitocondri &egrave; capito male. Qui, ci mostra che la proteina mitocondriale nucleoide lievito, Mgm101, &egrave; legata alle proteine di ricombinazione Rad52-tipo che sono diffusione negli organismi da batteriofago agli esseri umani. Mgm101 &egrave; richiesto per ricombinazione mediata da ripetere e la soppressione di frammentazione del DNA mitocondriale in vivo. Esso preferenzialmente si lega al DNA single-stranded e catalizza la ricottura di ssDNA precomplexed con la proteina mitocondriale ssDNA binding, Rim1. Microscopia elettronica della trasmissione ha mostrato che Mgm101 forme grandi anelli oligomerici della simmetria &sim;14-piega e filamenti elicoidali altamente compressi. Mutazioni specifiche che interessano la formazione di anello riducono la stabilit&agrave; della proteina in vitro. I dati suggeriscono che la struttura ad anello pu&ograve; fornire un&#39;impalcatura per la stabilizzazione dei Mgm101 prevenendo l&#39;aggregazione di conformazione monomerica altrimenti instabile. Dell&#39;associazione ssDNA, Mgm101 &egrave; remobilized da anelli per formare filamenti distinti nucleoproteina. Questi studi rivelano una proteina di ricombinazione di origine probabile del batteriofago nei mitocondri e supporta la nozione che la ricombinazione &egrave; indispensabile per l&#39;integrit&agrave; del DNA mitocondriale.

Mgm101 &egrave; una proteina Rad52 necessaria per ricombinazione del DNA mitocondriale.

&#x76F8;&#x540C;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x306F;&#x3001;&#x4E3B;&#x306B;&#x4E8C;&#x672C;&#x9396;DNA&#x5207;&#x65AD;&#x3068;&#x505C;&#x6B62;&#x3057;&#x305F;&#x8907;&#x88FD;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30AF;&#x306E;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9032;&#x5316;&#x3057;&#x3066;&#x304D;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5206;&#x5B50;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x306E;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306F;&#x3042;&#x307E;&#x308A;&#x7406;&#x89E3;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x9175;&#x6BCD;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x6838;&#x69D8;&#x4F53;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3001;Mgm101&#x306F;&#x3001;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x304B;&#x3089;&#x30D2;&#x30C8;&#x307E;&#x3067;&#x306E;&#x751F;&#x7269;&#x306B;&#x5E83;&#x304F;&#x5B58;&#x5728;Rad52&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x306E;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002; Mgm101&#x306F;&#x3001;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x3067;&#x7E70;&#x308A;&#x8FD4;&#x3057;&#x5A92;&#x4ECB;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;DNA&#x306E;&#x65AD;&#x7247;&#x5316;&#x306E;&#x6291;&#x5236;&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x512A;&#x5148;&#x7684;&#x306B;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;DNA&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x3001;ssDNA&#x306E;&#x30A2;&#x30CB;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306F;&#x3001;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x306E;ssDNA&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3001;Rim1&#x3068;precomplexed&#x89E6;&#x5A92;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x900F;&#x904E;&#x578B;&#x96FB;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x301C;14&#x500D;&#x306E;&#x5BFE;&#x79F0;&#x6027;&#x3068;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x306B;&#x5727;&#x7E2E;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3089;&#x305B;&#x3093;&#x72B6;&#x30D5;&#x30A3;&#x30E9;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;Mgm101&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x304C;&#x5927;&#x304D;&#x3044;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x3001;in vitro&#x3067;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x5B89;&#x5B9A;&#x6027;&#x3092;&#x6E1B;&#x3089;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x69CB;&#x9020;&#x304C;&#x305D;&#x3046;&#x3067;&#x306A;&#x3051;&#x308C;&#x3070;&#x4E0D;&#x5B89;&#x5B9A;&#x306A;&#x5358;&#x91CF;&#x4F53;&#x306E;&#x7ACB;&#x4F53;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x51DD;&#x96C6;&#x3092;&#x9632;&#x6B62;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;Mgm101&#x306E;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8DB3;&#x5834;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002; ssDNA&#x306E;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;Mgm101&#x306F;&#x5225;&#x500B;&#x306E;&#x6838;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30D5;&#x30A3;&#x30E9;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x304B;&#x3089;remobilized&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x5185;&#x3067;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x7531;&#x6765;&#x306E;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x3001;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x304C;mtDNA&#x306E;&#x6574;&#x5408;&#x6027;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x6982;&#x5FF5;&#x3092;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

Mgm101&#x306F;&#x3001;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;DNA&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;Rad52&#x95A2;&#x9023;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3067;&#x3042;&#x308B;

&#xB3D9;&#xC885; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569;&#xC740; &#xC8FC;&#xB85C; &#xC774;&#xC911; &#xAC00;&#xB2E5; DNA &#xB098;&#xB204;&#xAE30;&#xC758; &#xC218;&#xB9AC;&#xB97C; &#xC704;&#xD574; &#xC9C4;&#xD654; &#xD558; &#xACE0; &#xC9C0;&#xC5F0; &#xBCF5;&#xC81C; &#xD3EC;&#xD06C;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; &#xBD84;&#xC790; &#xACFC;&#xC815; &#xC774;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xAE30;&#xACC4; &#xC774;&#xD574; &#xAC00;&#xB09C; &#xD558; &#xAC8C; &#xB41C;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC; &#xB9AC;&#xC544; &#xD575;&#xC591;&#xCCB4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;, Mgm101, &#xC778; &#xAC04;&#xC5D0; &#xAC8C; &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD558; &#xAC8C;&#xB294; Rad52 &#xD615; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAD00;&#xB828; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. Mgm101&#xB294; &#xBC18;&#xBCF5; &#xC911;&#xC7AC; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xBC0F; mtDNA &#xC870;&#xAC01;&#xD654; vivo&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; &#xC6B0;&#xC120;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; DNA&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC; &#xB9AC;&#xC544; ssDNA &#xC758;&#xBB34;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;, rim1&#xC640; precomplexed ssDNA &#xC5B4; &#xB2D0; &#xB9C1; catalyzes. &#xC804;&#xC1A1; &#xC804;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; Mgm101 &sim;14 &#xBC30; &#xB300;&#xCE6D;&#xACFC; &#xACE0;&#xB3C4;&#xB85C; &#xC555;&#xCD95; &#xB41C; &#xB098;&#xC120;&#xD615; &#xD544; &#xB77C; &#xBA58; &#xD2B8;&#xC758; &#xB300;&#xD615; oligomeric &#xACE0;&#xB9AC;&#xB97C; &#xD615;&#xC131; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB9C1; &#xD615;&#xC131;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE58;&#xB294; &#xD2B9;&#xC815; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCCB4; &#xC678; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC548;&#xC815;&#xC131; &#xAC10;&#xC18C;. &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xB9C1; &#xAD6C;&#xC870; &#xADF8;&#xB807;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC73C;&#xBA74; &#xBD88;&#xC548; &#xC815;&#xD55C; monomeric &#xB098; &#xB780;&#xC758; &#xC9D1;&#xACC4;&#xB97C; &#xBC29;&#xC9C0; &#xD558; &#xC5EC; mgm101&#xC758; &#xC548;&#xC815;&#xD654;&#xB97C; &#xC704;&#xD574; &#xD55C; &#xBE44; &#xACC4;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;&#xB294; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. SsDNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; Mgm101 &#xB69C;&#xB837;&#xD55C; nucleoprotein &#xD544; &#xB77C; &#xBA58; &#xD2B8;&#xB97C; &#xB9C1;&#xC5D0;&#xC11C; remobilized&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0; &#xAE30;&#xC6D0; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xACF5;&#xAC1C; &#xD558; &#xACE0; &#xAC1C;&#xB150;&#xC744; &#xC9C0; &#xC6D0;&#xD558;&#xB294; &#xADF8; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; mtDNA &#xBB34;&#xACB0;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD544;&#xC218;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Mgm101 &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544; DNA &#xC7AC;&#xC870;&#xD569;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; rad52&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC774;&#xB2E4;.

La recombinaci&#xF3;n hom&#xF3;loga es un proceso conservada molecular que ha evolucionado principalmente para la reparaci&#xF3;n de roturas de ADN de doble cadena y tenedores estancadas de replicaci&#xF3;n. Sin embargo, la maquinaria de recombinaci&#xF3;n en la mitocondria es poco conocida. En este sentido, muestran que la prote&#xED;na de levadura nucleoide mitocondrial, Mgm101, est&#xE1; relacionada con las prote&#xED;nas de recombinaci&#xF3;n Rad52 tipo que son comunes en los organismos del bacteri&#xF3;fago a los seres humanos. Mgm101 se requiere para la recombinaci&#xF3;n mediada por la repetici&#xF3;n y la supresi&#xF3;n de la fragmentaci&#xF3;n del ADN mitocondrial in vivo. Se une preferentemente a ADN de cadena simple y cataliza la recocido de ssDNA precomplexed con el mitocondrial ADNmc-prote&#xED;na de uni&#xF3;n, RIM1. Microscop&#xED;a electr&#xF3;nica de transmisi&#xF3;n mostr&#xF3; que Mgm101 formas grandes anillos oligom&#xE9;ricos de simetr&#xED;a ~ 14-pliegue y altamente comprimidos filamentos helicoidales. Las mutaciones espec&#xED;ficas que afectan a la formaci&#xF3;n del anillo reducir la estabilidad de la prote&#xED;na in vitro. Los datos sugieren que la estructura del anillo puede proporcionar un andamio para la estabilizaci&#xF3;n de Mgm101 mediante la prevenci&#xF3;n de la agregaci&#xF3;n de la conformaci&#xF3;n monom&#xE9;rica otro modo inestable. Tras la uni&#xF3;n a ADN de cadena simple, Mgm101 se removilizado de los anillos para formar filamentos distintas nucleoprote&#xED;na. Estos estudios revelan una prote&#xED;na de la recombinaci&#xF3;n de origen bacteri&#xF3;fago probable que en las mitocondrias y apoyar la idea de que la recombinaci&#xF3;n es indispensable para la integridad del ADNmt.

Mgm101 es una prote&#xED;na Rad52-relacionado requerido para la recombinaci&#xF3;n del ADN mitocondrial

Mgm101 is a Rad52-type recombination protein of bacteriophage origin required for the repair and maintenance of mitochondrial DNA (mtDNA). It forms large oligomeric rings of âˆ¼14-fold symmetry that catalyze the annealing of single-stranded DNAs in vitro. In this study, we investigated the structural elements that contribute to this distinctive higher order structural organization and examined its functional implications. A pair of vicinal cysteines, Cys-216 and Cys-217, was found to be essential for mtDNA maintenance. Mutations to the polar serine, the negatively charged aspartic and glutamic acids, and the hydrophobic amino acid alanine all destabilize mtDNA in vivo. The alanine mutants have an increased propensity of forming macroscopic filaments. In contrast, mutations to aspartic acid drastically destabilize the protein and result in unstructured aggregates with severely reduced DNA binding activity. Interestingly, the serine mutants partially disassemble the Mgm101 rings into smaller oligomers. In the case of the C216S mutant, a moderate increase in DNA binding activity was observed. By using small angle x-ray scattering analysis, we found that Mgm101 forms rings of âˆ¼200 â„« diameter in solution, consistent with the structure previously established by transmission electron microscopy. We also found that the C216A/C217A double mutant tends to form broken rings, which likely provide free ends for seeding the growth of the super-stable but functionally defective filaments. Taken together, our data underscore the importance of a delicately maintained ring structure critical for Mgm101 activity. We discuss a potential role of Cys-216 and Cys-217 in regulating Mgm101 function and the repair of damaged mtDNA under stress conditions.

A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein, Mgm101.

Mgm101 est une prot&eacute;ine de recombinaison de type Rad52 d&#39;origine bact&eacute;riophage requis pour la r&eacute;paration et l&#39;entretien de l&#39;ADN mitochondrial (ADNmt). Il forme de grands anneaux oligom&egrave;res de &sim;14-pli sym&eacute;trie qui catalysent le recuit des brins simples d&#39;ADN in vitro. Dans cette &eacute;tude, nous avons examin&eacute; les &eacute;l&eacute;ments structurels qui contribuent &agrave; cette organisation structurale distinctif de plus &eacute;lev&eacute;e ordre et examin&eacute; ses implications fonctionnelles. Une paire de cyst&eacute;ines vicinaux, Cys-216 et Cys-217, s&#39;est av&eacute;r&eacute;e essentiel pour l&#39;entretien de l&#39;ADNmt. Des mutations de la s&eacute;rine polaire, l&#39;aspartique charg&eacute; n&eacute;gativement et acides glutamique et l&#39;alanine des acides amin&eacute;s hydrophobes tous les d&eacute;stabilisent ADNmt in vivo. Les mutants de l&#39;alanine ont une propension accrue de former des filaments macroscopiques. En revanche, des mutations &agrave; l&#39;acide aspartique radicalement d&eacute;stabilisent la prot&eacute;ine et entra&icirc;ner des agr&eacute;gats non structur&eacute;es avec l&#39;activit&eacute; de liaison ADN s&eacute;v&egrave;rement r&eacute;duite. Fait int&eacute;ressant, les mutants de la s&eacute;rine d&eacute;monter partiellement les anneaux Mgm101 en oligom&egrave;res plus petits. Dans le cas du mutant C216S, une augmentation mod&eacute;r&eacute;e de l&#39;activit&eacute; de liaison de l&#39;ADN a &eacute;t&eacute; observ&eacute;e. En utilisant l&#39;analyse de la diffusion des rayons x petit angle, nous avons constat&eacute; que Mgm101 forme des anneaux de diam&egrave;tre &Aring; &sim;200 en solution, conform&eacute;ment &agrave; la structure pr&eacute;c&eacute;demment &eacute;tablie par microscopie &eacute;lectronique &agrave; transmission. Nous avons &eacute;galement constat&eacute; que le mutant double C216A/C217A a tendance &agrave; former des anneaux bris&eacute;s, qui probablement des extr&eacute;mit&eacute;s libres pour l&#39;ensemencement de la croissance des filaments super-stable mais fonctionnellement d&eacute;fectueuses. Pris ensemble, nos r&eacute;sultats soulignent l&#39;importance d&#39;une structure d&#39;anneau d&eacute;licatement entretenu critique pour l&#39;activit&eacute; Mgm101. Nous discutons un r&ocirc;le potentiel de Cys-216 et 217-Cys dans la r&eacute;gulation de la fonction de Mgm101 et la r&eacute;paration de l&#39;ADNmt endommag&eacute;e conditions de stress.

Une structure d&#39;anneau correctement configur&eacute; est critique pour la fonction de la prot&eacute;ine de recombinaison de l&#39;ADN mitochondriale, Mgm101.

Mgm101 &egrave; una proteina di ricombinazione Rad52-tipo di origine del batteriofago necessaria per la riparazione e la manutenzione del DNA mitocondriale (mtDNA). Forma oligomerici grandi anelli di simmetria &sim;14-piega che catalizzano la ricottura di DNAs single-stranded in vitro. In questo studio, abbiamo studiato gli elementi strutturali che contribuiscono a questa organizzazione strutturale distintiva di maggiore ordine ed esaminate le implicazioni funzionali. Una coppia di cisteine vicinali, Cys-216 e Cys-217, &egrave; stata trovata per essere essenziale per il mantenimento del mtDNA. Mutazioni per la serina polare, la carica negativa aspartico e acidi glutammico e l&#39;alanina aminoacidi idrofobici destabilizzano mtDNA in vivo. I mutanti di alanina hanno una maggiore propensione di formare filamenti macroscopici. Al contrario, mutazioni di acido aspartico drasticamente destabilizzano la proteina e risultano in aggregati non strutturati con attivit&agrave; di associazione DNA gravemente ridotta. &Egrave; interessante notare che, i mutanti di serina parzialmente smontare gli anelli Mgm101 in oligomeri pi&ugrave; piccoli. Nel caso il mutante C216S, &egrave; stato osservato un moderato aumento nell&#39;attivit&agrave; di legame del DNA. Utilizzando analisi di dispersione dei raggi x angolo piccolo, abbiamo trovato che Mgm101 forme di anelli di diametro &Aring; &sim;200 in soluzione, coerente con la struttura precedentemente stabilita da microscopia elettronica della trasmissione. Abbiamo anche trovato che il mutante doppio C216A/C217A tende a formare anelli rotti, che probabilmente forniscono estremit&agrave; libere per seminare la crescita dei filamenti super-stable ma funzionalmente difettosi. Presi insieme, i nostri dati sottolineano l&#39;importanza di una struttura ad anello delicatamente mantenuto critica per l&#39;attivit&agrave; Mgm101. Discutiamo un ruolo potenziale di Cys-216 e Cys-217 nella regolazione della funzione Mgm101 e la riparazione del DNA mitocondriale danneggiato in condizioni di stress.

Una struttura ad anello correttamente configurato &egrave; critica per la funzione della proteina di ricombinazione del DNA mitocondriale, Mgm101.

Mgm101 is a Rad52-type single-stranded annealing protein (SSAP) required for mitochondrial DNA (mtDNA) repair and maintenance. Structurally, Mgm101 forms large oligomeric rings. Here we determine the function(s) of a 32-amino acid carboxyl-terminal tail (Mgm101(238-269)) conserved in the Mgm101 family of proteins. Mutagenic analysis shows that Lys-253, Trp-257, Arg-259, and Tyr-268 are essential for mtDNA maintenance. Mutations in Lys-251, Arg-252, Lys-260, and Tyr-266 affect mtDNA stability at 37Â°C and under oxidative stress. The Y268A mutation severely affects single-stranded DNA (ssDNA) binding without altering the ring structure. Mutations in the Lys-251-Arg-252-Lys-253 positive triad also affect ssDNA binding. Moreover, the C-tail alone is sufficient to mediate ssDNA binding. Finally, we find that the W257A and R259A mutations dramatically affect the conformation and oligomeric state of Mgm101. These structural alterations correlate with protein degradation in vivo. The data thus indicate that the C-tail of Mgm101, likely displayed on the ring surface, is required for ssDNA binding, higher-order structural organization, and protein stability. We speculate that an initial electrostatic and base-stacking interaction with ssDNA could remodel ring organization. This may facilitate the formation of nucleoprotein filaments competent for mtDNA repair. These findings could have broad implications for understanding how SSAPs promote DNA repair and genome maintenance.

A short carboxyl-terminal tail is required for single-stranded DNA binding, higher-order structural organization, and stability of the mitochondrial single-stranded annealing protein Mgm101.

Mgm101 est une Rad52 de type simple brin recuite prot&eacute;ine (SSAP) n&eacute;cessaire &agrave; l&#39;entretien et la r&eacute;paration de l&#39;ADN (ADN mitochondrial) mitochondriale. Structurellement, Mgm101 forme de grands anneaux oligom&egrave;re. Ici, nous d&eacute;terminons l&#39;ou les fonctions d&#39;une queue de carboxyl terminal acide amine 32 (Mgm101(238-269)) conserv&eacute; dans la famille de Mgm101 des prot&eacute;ines. Mutag&egrave;ne analyse montre que les Lys-253, Trp-257, Arg-259 et Tyr-268 sont essentiels pour l&#39;entretien de l&#39;ADNmt. Des mutations dans Lys-251, 252-Arg, Lys-260 et Tyr-266 affectent la stabilit&eacute; de l&#39;ADN mitochondrial &agrave; 37&deg; C et sous stress oxydatif. La mutation de Y268A affecte gravement les ADN simple brin (ssDNA) contraignant sans modifier la structure de l&#39;anneau. Mutations dans la triade positive Lys-251-Arg-252-Lys-253 affectent &eacute;galement liaison ADN simple brin. Par ailleurs, la queue C seul suffit &agrave; la m&eacute;diation obligatoire d&#39;ADN simple brin. Enfin, nous trouvons que les mutations W257A et R259A un effet dramatique sur la conformation et l&#39;&eacute;tat oligom&egrave;re de Mgm101. Ces alt&eacute;rations structurales sont en corr&eacute;lation avec la d&eacute;gradation des prot&eacute;ines in vivo. Par cons&eacute;quent, les donn&eacute;es indiquent que le C-queue de Mgm101, affich&eacute;e, sur la surface de l&#39;anneau, est requise pour la liaison de l&#39;ADN simple brin, organisation structurelle d&#39;ordre sup&eacute;rieur et stabilit&eacute; des prot&eacute;ines. Nous croyons qu&#39;une interaction &eacute;lectrostatique et empilement base initiale avec l&#39;ADN simple brin pourrait remodeler organisation d&#39;anneau. Cela peut faciliter la formation de filaments de nucl&eacute;oprot&eacute;ine comp&eacute;tentes pour la r&eacute;paration de l&#39;ADN mitochondrial. Ces r&eacute;sultats pourraient avoir des r&eacute;percussions g&eacute;n&eacute;rales permettant de comprendre comment la SSAP promotion entretien r&eacute;paration et g&eacute;nome d&#39;ADN.

Une courte queue carboxyl terminal est n&eacute;cessaire pour la fixation &agrave; l&#39;ADN simple brin, organisation structurelle d&#39;ordre sup&eacute;rieur et la stabilit&eacute; de la prot&eacute;ine mitochondriale de recuit de simple brin Mgm101.

Mgm101 &egrave; una Rad52-tipo single-stranded ricottura (SSAP) per proteina mitocondriale del DNA (mtDNA) riparazione e manutenzione. Strutturalmente, Mgm101 forma grandi anelli oligomerici. Qui noi determinare la funzione di una 32-amino acida carbossilico-terminale coda (Mgm101(238-269)) conservato nella famiglia Mgm101 di proteine. Mutageni analisi dimostra che la Lys-253, Trp-257, 259-Arg e Tyr-268 sono essenziali per il mantenimento del mtDNA. Mutazioni Lys-251, 252-Arg, Lys-260 e Tyr-266 possono influenzare la stabilit&agrave; del DNA mitocondriale a 37&deg; C e sotto stress ossidativo. La mutazione Y268A colpisce gravemente single-stranded DNA (ssDNA) associazione senza alterare la struttura ad anello. Mutazioni nella triade Lys-251-Arg-252-Lys-253 positiva anche interessano ssDNA binding. Inoltre, la coda-C da sola &egrave; sufficiente per mediare ssDNA binding. Infine, troviamo che le mutazioni W257A e R259A possono influenzare drasticamente la conformazione e lo stato oligomerica della Mgm101. Queste alterazioni strutturali si correlano con la degradazione delle proteine in vivo. I dati indicano quindi che la C-coda di Mgm101, probabilmente visualizzata sulla superficie dell&#39;anello, &egrave; necessaria per ssDNA binding, organizzazione strutturale pi&ugrave; alto ordine e stabilit&agrave; proteica. Si ipotizzano che un&#39;interazione elettrostatica e accatastamento di base iniziale con ssDNA potrebbe rimodellare organizzazione anello. Ci&ograve; pu&ograve; facilitare la formazione di filamenti di nucleoproteine competente per la riparazione del DNA mitocondriale. Queste scoperte potrebbero avere ampie implicazioni per comprendere come SSAP promuovere manutenzione riparazione e del genoma del DNA.

Una breve coda carbossi-terminale &egrave; necessaria per single-stranded DNA binding, organizzazione strutturale pi&ugrave; alto ordine e stabilit&agrave; della single-stranded mitocondriale ricottura proteina Mgm101.

MacMillan Mbantenkhu

Department of Biochemistry and Molecular Biology

State University of New York Upstate Medical University

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

MacMillan Mbantenkhu

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State University of New York Upstate Medical University

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Department of Biochemistry and Molecular Biology