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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

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Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Harvard Medical School

&#x566C;&#x83CC;&#x4F53; T7 DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x548C; DNA &#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x7684;&#x5355;&#x4E2A;&#x526F;&#x672C;&#x63A8;&#x8FDB;&#x4E0E; processivity &#x5927;&#x4E8E; 17,000 &#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x590D;&#x5236;&#x53C9;&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x5982;&#x6B64;&#xFF0C;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x77ED;&#x6682;&#x52A0;&#x5165;&#x4ECE; DNA &#x65E0;&#x9700;&#x79BB;&#x5F00; replisome&#x3002;&#x4E50;&#x56E2;&#x4E0E;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x6280;&#x672F;&#x6F14;&#x793A;&#x6B64;&#x52A8;&#x6001; processivity &#x7531;&#x4E24;&#x79CD; DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x89E3;&#x65CB;&#x4E92;&#x52A8;&#x6A21;&#x5F0F;&#x53EF;&#x80FD;&#x3002;&#x5728; DNA &#x5408;&#x6210;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x3001; &#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x4EA4;&#x4E92;&#x5728;&#x9AD8;&#x4EB2;&#x548C;&#x6027;&#x7AD9;&#x70B9;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x79CD;&#x805A;&#x5408;&#x6A21;&#x5F0F;&#xFF0C;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x4ECE; DNA &#x52A0;&#x5165;&#x5927;&#x7EA6;&#x6BCF; 5000 &#x7684;&#x57FA;&#x5730;&#x3002;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#xFF0C;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x4ECD;&#x7136;&#x662F;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x901A;&#x8FC7;&#x9759;&#x7535;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x6A21;&#x5F0F;&#x6D89;&#x53CA;&#x5230;&#x9178;&#x6027; C-&#x672B;&#x7AEF;&#x7684;&#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x548C;&#x57FA;&#x672C;&#x7684;&#x533A;&#x57DF;&#xFF0C;&#x5728; processivity &#x56E0;&#x5B50;&#x8FD8;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x3002;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x4F20;&#x8F93;&#x901A;&#x8FC7;&#x5468;&#x56F4;&#x5BFB;&#x627E;&#x5E95;&#x6F06;&#x6A21;&#x677F;&#x516D;&#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x7684;&#x9759;&#x7535;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

DNA &#x89E3;&#x65CB;&#x9176; DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x7684;&#x52A8;&#x6001;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x4FDD;&#x8BC1;&#x845B;&#x590D;&#x5236;&#x53C9;&#x8FD0;&#x52A8;&#x3002;

A single copy of bacteriophage T7 DNA polymerase and DNA helicase advance the replication fork with a processivity greater than 17,000 nucleotides. Nonetheless, the polymerase transiently dissociates from the DNA without leaving the replisome. Ensemble and single-molecule techniques demonstrate that this dynamic processivity is made possible by two modes of DNA polymerase-helicase interaction. During DNA synthesis the polymerase and the helicase interact at a high-affinity site. In this polymerizing mode, the polymerase dissociates from the DNA approximately every 5000 bases. The polymerase, however, remains bound to the helicase via an electrostatic binding mode that involves the acidic C-terminal tail of the helicase and a basic region in the polymerase to which the processivity factor also binds. The polymerase transfers via the electrostatic interaction around the hexameric helicase in search of the primer-template.

Dynamic DNA helicase-DNA polymerase interactions assure processive replication fork movement.

Une seule copie de l&#x26;#39;ADN polym&#xE9;rase du bact&#xE9;riophage T7 et l&#x26;#39;avance ADN h&#xE9;licase la fourche de r&#xE9;plication avec un processivit&#xE9; plus de 17.000 nucl&#xE9;otides. N&#xE9;anmoins, la polym&#xE9;rase se dissocie de fa&#xE7;on transitoire &#xE0; partir de l&#x26;#39;ADN, sans quitter l&#x26;#39;r&#xE9;plisome. Ensemble des techniques et une seule mol&#xE9;cule de d&#xE9;montrer que cette processivit&#xE9; dynamique est rendue possible par deux modes de l&#x26;#39;ADN polym&#xE9;rase-h&#xE9;licase interaction. Lors de la synth&#xE8;se d&#x26;#39;ADN-polym&#xE9;rase et l&#x26;#39;h&#xE9;licase interagir &#xE0; un site de haute affinit&#xE9;. Dans ce mode de polym&#xE9;risation, les dissocie polym&#xE9;rase de l&#x26;#39;ADN d&#x26;#39;environ tous les 5000 bases. La polym&#xE9;rase, cependant, reste li&#xE9; &#xE0; l&#x26;#39;h&#xE9;licase via un mode de liaison &#xE9;lectrostatique qui implique l&#x26;#39;acidit&#xE9; queue C-terminale de l&#x26;#39;h&#xE9;licase et une r&#xE9;gion de base dans la polym&#xE9;rase &#xE0; laquelle le facteur de processivit&#xE9; se lie &#xE9;galement. La polym&#xE9;rase transf&#xE8;re via l&#x26;#39;interaction &#xE9;lectrostatique autour de l&#x26;#39;h&#xE9;licase hexam&#xE9;rique &#xE0; la recherche de l&#x26;#39;amorce-matrice.

Interactions dynamiques ADN polym&#xE9;rase ADN h&#xE9;licase-Assurer processive mouvement de la fourche de r&#xE9;plication

Eine einzelne Kopie der Bakteriophage T7-DNA-Polymerase und DNA Helicase advance der Wiederholunggabel mit einer mehr als 17.000 Nukleotide Processivity. Dennoch distanziert die Polymerase vor&uuml;bergehend von der DNA ohne die Replisom zu verlassen. Ensemble und Einzelmolek&uuml;l-Techniken zeigen, dass diese dynamische Processivity durch zwei Modi der DNA-Polymerase-Helicase Interaktion m&ouml;glich ist. W&auml;hrend der DNA-Synthese interagieren der Polymerase und die Helicase an einem Standort mit hoher Affinit&auml;t. In diesem Modus polymerizing distanziert die Polymerase von der DNA etwa alle 5000 Basen. Die Polymerase bleibt jedoch verpflichtet die Helicase &uuml;ber eine elektrostatische Bindungsmodus, bei der das saure C-terminalen Ende der Helicase und eine Grund-Region in die Polymerase an der der Processivity Faktor auch gebunden. Die Polymerase &uuml;bertr&auml;gt &uuml;ber die elektrostatische Interaktion rund um die Hexameric Helicase auf der Suche nach der Grundierung-Vorlage.

Dynamische DNA Helicase-DNA-Polymerase-Interaktionen versichern prozessualen Replikation Gabel Bewegung.

Una singola copia del batteriofago T7 DNA polimerasi e DNA elicasi avanzare la forcella replica con un maggiore di 17.000 nucleotidi processivity. Ciononostante, la polimerasi transitoriamente si dissocia dal DNA senza lasciare il replisome. Ensemble e singola molecola tecniche dimostrano che questo processivity dinamico &egrave; reso possibile da due modalit&agrave; di interazione della polimerasi del DNA-elicasi. Durante la sintesi del DNA polimerasi e l&#39;elicasi interagire in un sito ad alta affinit&agrave;. In questa modalit&agrave; di polimerizzazione, la polimerasi si dissocia dal DNA circa ogni 5000 basi. La polimerasi, tuttavia, rimane legata per l&#39;elicasi tramite una modalit&agrave; di legame elettrostatico che coinvolge la coda C-terminale acida l&#39;elicasi e una base nella regione della polimerasi che si lega anche il fattore di processivity. La polimerasi i trasferimenti tramite l&#39;interazione elettrostatica intorno l&#39;elicasi esamerica in cerca il modello di primer.

Le interazioni della polimerasi di DNA elicasi DNA dinamiche assicurano movimento forcella replica processive.

&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;T7&#x306E;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;DNA&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x4E8B;&#x524D;17000&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x306E;&#x80FD;&#x529B;&#xFF08;processivity&#xFF09;&#x3068;&#x8907;&#x88FD;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30AF;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x30B3;&#x30D4;&#x30FC;&#x3002; replisome&#x3092;&#x96E2;&#x308C;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306A;&#x304F;&#x3001;DNA&#x304B;&#x3089;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x4E00;&#x6642;&#x7684;&#x306B;&#x89E3;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x30A2;&#x30F3;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EB;&#x3068;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x6280;&#x8853;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x52D5;&#x7684;&#x306A;&#x80FD;&#x529B;&#xFF08;processivity&#xFF09;&#x306F;&#x3001;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;2&#x3064;&#x306E;&#x30E2;&#x30FC;&#x30C9;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x53EF;&#x80FD;&#x3068;&#x306A;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; DNA&#x5408;&#x6210;&#x6642;&#x306E;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x3001;&#x9AD8;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3067;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x91CD;&#x5408;&#x30E2;&#x30FC;&#x30C9;&#x3067;&#x306F;&#x3001;DNA&#x306E;&#x304A;&#x3088;&#x305D;5000&#x5869;&#x57FA;&#x304B;&#x3089;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x89E3;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x3001;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x80FD;&#x529B;&#xFF08;processivity&#xFF09;&#x56E0;&#x5B50;&#x3082;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x57FA;&#x672C;&#x7684;&#x306A;&#x5730;&#x57DF;&#x306E;&#x9178;&#x6027;&#x306E;C&#x672B;&#x7AEF;&#x5C3E;&#x90E8;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x9759;&#x96FB;&#x7D50;&#x5408;&#x30E2;&#x30FC;&#x30C9;&#x3092;&#x7D4C;&#x7531;&#x3057;&#x3066;&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x305F;&#x307E;&#x307E;&#x3002;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x3001;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#xB7;&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x306E;&#x691C;&#x7D22;&#x3067;&#x306F;&#x516D;&#x91CF;&#x4F53;&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x5468;&#x308A;&#x306E;&#x9759;&#x96FB;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x8EE2;&#x9001;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30C3;&#x30AF;DNA&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC; -  DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30C3;&#x8907;&#x88FD;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30AF;&#x306E;&#x52D5;&#x304D;&#x3092;&#x78BA;&#x4FDD;&#x3059;&#x308B;

&#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0; T7 DNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC640; DNA helicase&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBCF5;&#xC0AC;&#xBCF8; processivity 17000 &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD070; &#xD568;&#xAED8; &#xBCF5;&#xC81C; &#xD3EC;&#xD06C; &#xC0AC;&#xC804;. &#xADF8;&#xB7FC;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0;, &#xD6A8;&#xC18C;&#xB294; transiently&#xC5D0;&#xC11C; dissociates DNA&#xB294; replisome&#xB97C; &#xB5A0;&#xB098;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0;. &#xC559;&#xC0C1;&#xBE14; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xC77C;-&#xBD84;&#xC790; &#xAE30;&#xBC95;&#xC774; &#xB3D9;&#xC801; processivity DNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; helicase &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBAA8;&#xB4DC;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xC81C;&#xC791;&#xC740; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. DNA &#xD569;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548;&#xC740; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC640;&#xB294; helicase &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; polymerizing &#xBAA8;&#xB4DC;&#xC5D0;&#xB294; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; dissociates DNA 5000 &#xAE30;&#xC9C0;&#xC5D0; &#xC57D; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xD6A8;&#xC18C;, &#xC0B0; &#xC131; C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xAF2C;&#xB9AC;&#xB294; helicase&#xC640; &#xC911; &#xD569; processivity &#xC694;&#xC18C;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC601;&#xC5ED;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC815;&#xC804;&#xAE30; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBAA8;&#xB4DC;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; helicase&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; &#xB0A8;&#xC544; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD6A8;&#xC18C; &#xB1CC;&#xAD00; &#xC11C;&#xC2DD; &#xD30C;&#xC77C; &#xCC3E;&#xAE30; hexameric helicase &#xC8FC;&#xC704;&#xC5D0; &#xC815;&#xC804;&#xAE30; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC804;&#xC1A1;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB3D9;&#xC801; DNA helicase DNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC791;&#xC6A9; processive &#xBCF5;&#xC81C; &#xD3EC;&#xD06C; &#xC6B4;&#xB3D9; &#xBCF4;&#xC7A5;.

Una sola copia de la polimerasa de ADN del bacteri&#xF3;fago T7 y el avance de ADN helicasa el tenedor de replicaci&#xF3;n con una procesividad m&#xE1;s de 17.000 nucle&#xF3;tidos. Sin embargo, la polimerasa transitoriamente se disocia del ADN sin salir de la replisoma. T&#xE9;cnicas Ensemble y &#xFA;nica mol&#xE9;cula-demostrar que este procesividad din&#xE1;mica es posible gracias a dos modos de ADN polimerasa-helicasa interacci&#xF3;n. Durante la s&#xED;ntesis de ADN polimerasa y helicasa el interactuar en un sitio de alta afinidad. En este modo la polimerizaci&#xF3;n, se disocia de la polimerasa del ADN aproximadamente cada 5000 bases. La polimerasa, sin embargo, permanece unido a la helicasa a trav&#xE9;s de una uni&#xF3;n electrost&#xE1;tica modo que implica el &#xE1;cido C-terminal de la cola de la helicasa y una regi&#xF3;n de base en la polimerasa para que el factor de procesividad tambi&#xE9;n se une. La polimerasa transfiere a trav&#xE9;s de la interacci&#xF3;n electrost&#xE1;tica en torno a la helicasa hexameric en busca de la cartilla de plantilla.

Dynamic DNA helicasa ADN polimerasa-Interacciones asegurar el movimiento processive Tenedor de replicaci&#xF3;n

&#x6211;&#x4EEC;&#x76EE;&#x524D;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x590D;&#x5236;&#x673A;&#x68B0;&#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x60F3;&#x8C61;&#x4ECE;&#x4E8B;&#x5E95;&#x6F06;&#x6269;&#x5C55;&#x548C;&#x9886;&#x5148;&#x7EDE;&#x5408;&#x6210;&#x7684;&#x4E2A;&#x522B;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC; DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; III (Pol III) holoenzymes&#x3002;&#x5F53;&#x8026;&#x5408;&#x5230;&#x7E41;&#x6B96;&#x7684;&#x89E3;&#x65CB;&#x9176; DnaB&#xFF0C;Pol III &#x4ECB;&#x5BFC;&#x9886;&#x5148;&#x7EDE;&#x5408;&#x6210;&#x4E0E; processivity &#x7684;&#x516B;&#x500D;&#x9AD8;&#x4E8E;&#x7531; Pol III &#x4EC5; 10.5 kilobases (kb)&#x3002;Primase DnaG &#x52A0;&#x6CD5;&#x4E2D;&#x9886;&#x5148;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x5408;&#x6210;&#xFF0C;&#x4F9D;&#x8D56; DnaB DnaG &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x800C;&#x4E0D;&#x662F; primase &#x6D3B;&#x52A8;&#x5F71;&#x54CD;&#x7684; processivity &#x5BFC;&#x81F4;&#x51CF;&#x5C11;&#x4E86;&#x4E09;&#x500D;&#x3002;&#x5177;&#x6709;&#x4E0D;&#x540C; DnaG &#x6D53;&#x5EA6;&#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x5206;&#x6790;&#x8868;&#x660E;&#x5408;&#x4F5C;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6216;&#x4E09;&#x4E2A; DnaG &#x5355;&#x4F53;&#x5230; DnaB &#x505C;&#x6B62;&#x5408;&#x6210;&#x3002;&#x8C03;&#x8282;&#x901A;&#x8FC7;&#x4E0E; DnaG &#x4E92;&#x52A8; DnaB &#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x8868;&#x660E;&#x4E00;&#x79CD;&#x673A;&#x5236;&#xFF0C;&#x9632;&#x6B62;&#x843D;&#x540E;&#x94A2;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x4E0A;&#x7F13;&#x6162;&#x7684;&#x5E95;&#x6F06;&#x5408;&#x6210;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x8D85;&#x8FC7;&#x6EDE;&#x540E;&#x7EDE;&#x5408;&#x6210;&#x9886;&#x5148;&#x7EDE;&#x5408;&#x6210;&#x3002;

&#x53C9;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x5728;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC; DNA &#x590D;&#x5236;&#x4E2D;&#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;

We present single-molecule studies of the Escherichia coli replication machinery. We visualize individual E. coli DNA polymerase III (Pol III) holoenzymes engaging in primer extension and leading-strand synthesis. When coupled to the replicative helicase DnaB, Pol III mediates leading-strand synthesis with a processivity of 10.5 kilobases (kb), eight-fold higher than that by Pol III alone. Addition of the primase DnaG causes a three-fold reduction in the processivity of leading-strand synthesis, an effect dependent upon the DnaB-DnaG protein-protein interaction rather than primase activity. A single-molecule analysis of the replication kinetics with varying DnaG concentrations indicates that a cooperative binding of two or three DnaG monomers to DnaB halts synthesis. Modulation of DnaB helicase activity through the interaction with DnaG suggests a mechanism that prevents leading-strand synthesis from outpacing lagging-strand synthesis during slow primer synthesis on the lagging strand.

Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication.

Nous pr&#xE9;sentons une seule mol&#xE9;cule d&#x26;#39;&#xE9;tudes de la machinerie de r&#xE9;plication Escherichia coli. Nous visualisons individuelle E. coli l&#x26;#39;ADN polym&#xE9;rase III (Pol III) holoenzymes engag&#xE9;s dans l&#x26;#39;extension d&#x26;#39;amorce et d&#x26;#39;avant-brin de synth&#xE8;se. Lorsque coupl&#xE9; &#xE0; la r&#xE9;plication h&#xE9;licase DnaB, Pol III m&#xE9;diateur menant brin de synth&#xE8;se avec un processivit&#xE9; de 10,5 kilobases (kb), huit fois plus &#xE9;lev&#xE9; que celui de Pol III seul. Ajout de la dnaG primase entra&#xEE;ne une r&#xE9;duction de trois fois dans la processivit&#xE9; de la synth&#xE8;se du brin d&#x26;#39;avant-, un effet qui d&#xE9;pend de la DnaB-dnaG interaction prot&#xE9;ine-prot&#xE9;ine plut&#xF4;t que l&#x26;#39;activit&#xE9; primase. Une analyse mol&#xE9;cule unique de la cin&#xE9;tique de r&#xE9;plication avec des concentrations variables dnaG indique qu&#x26;#39;une liaison de coop&#xE9;ration de deux ou trois monom&#xE8;res de dnaG DnaB s&#x26;#39;arr&#xEA;te synth&#xE8;se. Modulation de l&#x26;#39;activit&#xE9; h&#xE9;licase DnaB travers l&#x26;#39;interaction avec dnaG sugg&#xE8;re un m&#xE9;canisme qui emp&#xEA;che d&#x26;#39;avant-brin de synth&#xE8;se &#xE0; partir d&#xE9;passant retard brin de synth&#xE8;se lors de la synth&#xE8;se d&#x26;#39;amorce lente sur le brin &#xE0; la tra&#xEE;ne.

Une seule mol&#xE9;cule d&#x26;#39;&#xE9;tudes de la dynamique des fourches de r&#xE9;plication dans Escherichia Coli ADN

Wir pr&auml;sentieren Einzelmolek&uuml;l-Studien &uuml;ber die Escherichia-coli-Replikation-Maschinen. Wir visualisieren einzelne E. Coli DNA-Polymerase III (Pol III) Holoenzymes Beteiligung an Z&uuml;ndkapsel-Erweiterung und f&uuml;hrende-Strang-Synthese. Gekoppelt an die replicative Helikase DnaB vermittelt Pol III f&uuml;hrende-Strang Synthese mit einem Processivity von 10,5 Kilobases (kb), Achtfach h&ouml;her als die von Pol III allein. Zusatz von der Primase DnaG verursacht eine dreifache Verringerung in der Processivity von f&uuml;hrenden-Strang-Synthese, eine Wirkung, die auf die DnaB-DnaG-Protein-Protein-Interaktion anstatt Primase Aktivit&auml;t abh&auml;ngig. Eine Analyse der Einzelmolek&uuml;l-Replikation Kinetics mit unterschiedlichen DnaG-Konzentrationen zeigt, dass eine kooperative Bindung von zwei oder drei DnaG-Monomere, DnaB Synthese stoppt. Modulation der DnaB Helicase T&auml;tigkeit durch die Interaktion mit DnaG schl&auml;gt einen Mechanismus, der verhindert, dass f&uuml;hrende-Strang Synthese &uuml;bertraf Verz&ouml;gerungsstrang Synthese bei langsamen Grundierung Synthese auf der Verz&ouml;gerungsstrang.

Einzelmolek&uuml;l-Studien der Gabel Dynamik in Escherichia coli DNA-Replikation.

Presentiamo gli studi di singola molecola della macchina replica Escherichia coli. Noi visualizzare holoenzymes di individuali e. coli DNA polimerasi III (Pol III) impegnati nella sintesi di estensione e leader-strand primer. Quando accoppiato per l&#39;elicasi DnaB replicativa, Pol III media sintesi leader-filo con un processivity della 10,5 kilobasi (kb), otto superiore a quello di Pol III da solo. Aggiunta di primasi DnaG causa una riduzione triplice processivity della sintesi leader-filo, un effetto dipendente con l&#39;interazione della proteina-proteina DnaB-DnaG anzich&eacute; primasi attivit&agrave;. Un&#39;analisi di singola molecola della cinetica replica con diverse concentrazioni DnaG indica che un&#39;associazione cooperativa di due o tre monomeri DnaG di DnaB interrompe la sintesi. Modulazione dell&#39;attivit&agrave; dell&#39;elicasi DnaB attraverso l&#39;interazione con DnaG suggerisce un meccanismo che impedisce la sintesi leader filo superando la sintesi del filamento lagging durante la sintesi primer lento sul filamento in ritardo.

Studi di singola molecola della dinamica della forcella nella replicazione del DNA di Escherichia coli.

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x306E;&#x8907;&#x88FD;&#x6A5F;&#x68B0;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3092;&#x7D39;&#x4ECB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x500B;&#x3005;&#x306E;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;III&#xFF08;POL III&#xFF09;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x4F38;&#x9577;&#x3068;&#x6700;&#x5148;&#x7AEF;&#x306E;&#x9396;&#x306E;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x5F93;&#x4E8B;holoenzymes&#x3092;&#x53EF;&#x8996;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x8907;&#x88FD;&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;DnaB&#x3001;&#x5358;&#x72EC;&#x6027;Pol III&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x305D;&#x308C;&#x3088;&#x308A;&#x3082;8&#x500D;&#x9AD8;&#x3044;10.5&#x30AD;&#x30ED;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#xFF08;kb&#xFF09;&#x3001;&#x80FD;&#x529B;&#xFF08;processivity&#xFF09;&#x3068;pol III&#x7CFB;&#x306E;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x306F;&#x3001;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x9396;&#x306E;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30BC;DnaG&#x306E;&#x6DFB;&#x52A0;&#x306F;&#x3001;&#x6700;&#x5148;&#x7AEF;&#x9396;&#x5408;&#x6210;&#x80FD;&#x529B;&#xFF08;processivity&#xFF09;&#x306E;3&#x500D;&#x306E;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3001;DnaB-DnaG&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; - &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3059;&#x308B;&#x52B9;&#x679C;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; DnaG&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3092;&#x5909;&#x5316;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x8907;&#x88FD;&#x52D5;&#x614B;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x5206;&#x6790;&#x306F;DnaB&#x3092;&#x505C;&#x6B62;&#x3057;&#x3001;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x306F;2&#x3064;&#x307E;&#x305F;&#x306F;3 DnaG&#x30E2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E;&#x5354;&#x540C;&#x7684;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; DnaG&#x3068;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;DnaB&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x306E;&#x5909;&#x8ABF;&#x304C;&#x30E9;&#x30AE;&#x30F3;&#x30B0;&#x9396;&#x4E0A;&#x306B;&#x4F4E;&#x901F;&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x5408;&#x6210;&#x6642;&#x306E;&#x30E9;&#x30AE;&#x30F3;&#x30B0;&#x9396;&#x5408;&#x6210;&#x3092;&#x4E0A;&#x56DE;&#x3063;&#x3066;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x30EA;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x9396;&#x5408;&#x6210;&#x3092;&#x9632;&#x6B62;&#x3059;&#x308B;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x306E;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x306E;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30AF;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;

&#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xBCF5;&#xC81C; &#xAE30;&#xACC4;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xC81C;&#xC2DC;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; DNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; III (Pol III) holoenzymes &#xB1CC;&#xAD00; &#xC5F0;&#xC7A5; &#xBC0F; &#xC120;&#xB3C4; &#xAC00;&#xB2E5; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xAD00;&#xC5EC; &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654;. &#xC77C;&#xCC28; helicase DnaB &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xACBD;&#xC6B0; Pol III eight-fold Pol III &#xD63C;&#xC790;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB192;&#xC740; 10.5 kilobases (kb), processivity &#xAC00;&#xC9C4; &#xC120;&#xB3C4; &#xAC00;&#xB2E5; &#xC885;&#xD569; &#xC911;&#xC7AC;. Primase Dnag&#xC758; &#xCD94;&#xAC00; processivity &#xC120;&#xB3C4; &#xAC00;&#xB2E5; &#xC885;&#xD569;, primase &#xD65C;&#xB3D9; &#xBCF4;&#xB2E4;&#xB294; DnaB DnaG &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xC885;&#xC18D; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC758; 3 &#xBC30; &#xAC10;&#xC18C;&#xB97C; &#xBC1C;&#xC0DD;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xBD84;&#xC11D; DnaG &#xB18D;&#xB3C4; &#xBCC0;&#xD654; &#xB41C; &#xBCF5;&#xC81C; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860; DnaB 2 &#xAC1C; &#xB610;&#xB294; 3 &#xAC1C;&#xC758; DnaG &#xB2E8;&#xC704;&#xCCB4;&#xC758; &#xD611;&#xB825;&#xC801;&#xC778; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC911;&#xB2E8; &#xD569;&#xC131; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBCC0;&#xC870; DnaG &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; DnaB helicase &#xD65C;&#xB3D9;&#xC758; &#xC120;&#xB3C4; &#xAC00;&#xB2E5; &#xC885;&#xD569; &#xB4A4;&#xC9C0;&#xB294; &#xAC00;&#xB2E5;&#xC5D0; &#xB290;&#xB9B0; &#xB1CC;&#xAD00; &#xD569;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xB4A4;&#xC9C0;&#xB294; &#xAC00;&#xB2E5; &#xD569;&#xC131;&#xC744; &#xB2A5;&#xAC00; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xC744; &#xBC29;&#xC9C0; &#xD558;&#xB294; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; DNA &#xBCF5;&#xC81C;&#xC5D0; &#xD3EC;&#xD06C; &#xC5ED;&#xD559;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC5F0;&#xAD6C;.

Se presenta una sola mol&#xE9;cula de estudios de la maquinaria de replicaci&#xF3;n de Escherichia coli. Visualizamos individuo de E. coli DNA polimerasa III (Pol III) holoenzimas que participan en la extensi&#xF3;n del cebador y la s&#xED;ntesis principal de hebra. Cuando se acopla a la helicasa replicativa DnaB, Pol III que lleva media l&#xED;nea de s&#xED;ntesis con una procesividad de 10,5 kilobases (kb), ocho veces m&#xE1;s alto que el de Pol III solo. La adici&#xF3;n de la dnaG primasa causa una reducci&#xF3;n de tres veces en la s&#xED;ntesis de procesividad l&#xED;der hebra, un efecto que depende de la DnaB-dnaG interacci&#xF3;n prote&#xED;na-prote&#xED;na en lugar de la actividad primasa. Un an&#xE1;lisis de una sola mol&#xE9;cula de la cin&#xE9;tica de replicaci&#xF3;n con concentraciones variables dnaG indica que una uni&#xF3;n cooperativa de dos o tres mon&#xF3;meros dnaG a DnaB s&#xED;ntesis se detiene. La modulaci&#xF3;n de la actividad helicasa DnaB a trav&#xE9;s de la interacci&#xF3;n con dnaG sugiere un mecanismo que impide principal l&#xED;nea de s&#xED;ntesis de retraso superando l&#xED;nea de s&#xED;ntesis durante la s&#xED;ntesis de imprimaci&#xF3;n lento en el cap&#xED;tulo menos.

Una sola mol&#xE9;cula de estudios de la din&#xE1;mica Tenedor en la replicaci&#xF3;n de Escherichia coli DNA

&#x6211;&#x4EEC;&#x73B0;&#x65F6;&#x7B80;&#x5355;&#x7684;&#x53EF;&#x89C6;&#x5316;&#x5B9E;&#x65F6;&#x7684;&#x5355;&#x4E2A; DNA &#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x6280;&#x672F;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x5C06;&#x6EDA;&#x5706;&#x5E95;&#x9644;&#x52A0;&#x5230;&#x4E00;&#x4E2A;&#x63D0;&#x5C14;&#x592B;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x88C5;&#x5165;&#x6D41;&#x5206;&#x5EAD;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x662F;&#x80FD;&#x591F;&#x76D1;&#x6D4B;&#x7684;&#x5355; DNA &#x5408;&#x6210;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x8FDB;&#x5C55;&#x548C;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x590D;&#x5236; DNA &#x51C6;&#x786E;&#x5730;&#x8861;&#x91CF;&#x5229;&#x7387;&#x548C;&#x5355;&#x4E00;&#x7684; T7 &#x548C;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC; replisomes processivities&#x3002;&#x6B64;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5141;&#x8BB8;&#x4E3A;&#x5FEB;&#x901F;&#x548C;&#x7CBE;&#x786E;&#x8868;&#x5F81;&#x7684;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76; DNA &#x5408;&#x6210;&#x548C;&#x590D;&#x5236;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;

&#x5B9E;&#x65F6;&#x7684;&#x6EDA;&#x5706; DNA &#x590D;&#x5236;&#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x89C2;&#x5BDF;&#x3002;

We present a simple technique for visualizing replication of individual DNA molecules in real time. By attaching a rolling-circle substrate to a TIRF microscope-mounted flow chamber, we are able to monitor the progression of single-DNA synthesis events and accurately measure rates and processivities of single T7 and Escherichia coli replisomes as they replicate DNA. This method allows for rapid and precise characterization of the kinetics of DNA synthesis and the effects of replication inhibitors.

Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.

Nous pr&#xE9;sentons une technique simple pour visualiser la r&#xE9;plication des mol&#xE9;cules individuelles d&#x26;#39;ADN en temps r&#xE9;el. En attachant un substrat de cercle roulant &#xE0; une chambre de flux FRBR microscope mont&#xE9;, nous sommes en mesure de surveiller la progression des &#xE9;v&#xE9;nements de synth&#xE8;se unique d&#x26;#39;ADN et de mesurer avec pr&#xE9;cision les taux et processivities de simple T7 et replisomes Escherichia coli car ils r&#xE9;pliquent l&#x26;#39;ADN. Cette m&#xE9;thode permet la caract&#xE9;risation rapide et pr&#xE9;cise de la cin&#xE9;tique de synth&#xE8;se de l&#x26;#39;ADN et les effets des inhibiteurs de la r&#xE9;plication.

En temps r&#xE9;el unique mol&#xE9;cule d&#x26;#39;observation de la r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN de cercle roulant

Wir pr&auml;sentieren eine einfache Technik f&uuml;r Replikation einzelner DNA-Molek&uuml;le in Echtzeit zu visualisieren. Durch Anf&uuml;gen eines Rollen-Kreis-Substrat zu einer TIRF Mikroskop montierte Str&ouml;mung Kammer, k&ouml;nnen wir das Fortschreiten der Einzel-DNA-Synthese-Ereignisse zu &uuml;berwachen und genau messen Preise und Processivities der einzelnen T7 und Escherichia-coli-Replisomes, wie sie DNA repliziert werden. Diese Methode erm&ouml;glicht schnelle und pr&auml;zise Charakterisierung der Kinetik der DNA-Synthese und die Auswirkungen der Replikation-Inhibitoren.

Echtzeit Einzelmolek&uuml;l-Beobachtung der Rollen-Kreis-DNA-Replikation.

Vi presentiamo una tecnica semplice per la visualizzazione di replica di singole molecole di DNA in tempo reale. Allegando un substrato rolling-cerchio ad una camera di flusso microscopio montato TIRF, siamo in grado di monitorare la progressione degli eventi di sintesi del DNA singolo e misurare con precisione le tariffe e processivities del singolo T7 ed Escherichia coli replisomes come replicare il DNA. Questo metodo consente rapida e precisa caratterizzazione della cinetica della sintesi del DNA e gli effetti degli inibitori della replica.

Osservazione in tempo reale di singola molecola della replica del DNA rolling-circle.

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x3067;&#x500B;&#x3005;&#x306E;DNA&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x8907;&#x88FD;&#x3092;&#x53EF;&#x8996;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x5358;&#x7D14;&#x306A;&#x624B;&#x6CD5;&#x3092;&#x63D0;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; TIRF&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x30DE;&#x30A6;&#x30F3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30D0;&#x30FC;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x30B5;&#x30FC;&#x30AF;&#x30EB;&#x57FA;&#x677F;&#x3092;&#x53D6;&#x308A;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;DNA&#x5408;&#x6210;&#x30A4;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x9032;&#x884C;&#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x304C;DNA&#x3092;&#x8907;&#x88FD;&#x3059;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x6B63;&#x78BA;&#x306B;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;T7&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x306E;replisomes&#x7387;&#x3068;processivities&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;DNA&#x5408;&#x6210;&#x306E;&#x52D5;&#x529B;&#x5B66;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x8907;&#x88FD;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x306E;&#x8FC5;&#x901F;&#x304B;&#x3064;&#x6B63;&#x78BA;&#x306A;&#x7279;&#x6027;&#x8A55;&#x4FA1;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30ED;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x30B5;&#x30FC;&#x30AF;&#x30EB;&#x306E;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x306E;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x89B3;&#x5BDF;

&#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC1C;&#xBCC4; DNA &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xBCF5;&#xC81C;&#xB97C; &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xAE30;&#xC220;&#xC744; &#xC18C;&#xAC1C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB864;&#xB9C1; &#xC6D0; &#xAE30;&#xD310; TIRF &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xC2E4;&#xC7A5; &#xD750;&#xB984; &#xCC54;&#xBC84;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xD558; &#xC5EC; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB2E8;&#xC77C; DNA &#xD569;&#xC131; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8;&#xC758; &#xC9C4;&#xD589;&#xC744; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558; &#xACE0; &#xC815;&#xD655; &#xD558; &#xAC8C; &#xCE21;&#xC815; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB2E8;&#xC77C; t 7&#xACFC; Escherichia&#xC758; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; replisomes&#xC758; processivities&#xB85C; DNA&#xB97C; &#xBCF5;&#xC81C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB294; DNA &#xD569;&#xC131;&#xC758; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860; &#xBC0F; &#xBCF5;&#xC81C; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;&#xC758; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC758; &#xC2E0;&#xC18D; &#xD558; &#xACE0; &#xC815;&#xD655;&#xD55C; &#xD2B9;&#xC131;&#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC555; &#xC5F0; &#xC6D0;&#xD615; DNA &#xBCF5;&#xC81C;&#xC758; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xAD00;&#xCC30;.

Se presenta una t&#xE9;cnica sencilla para la visualizaci&#xF3;n de la replicaci&#xF3;n de mol&#xE9;culas de ADN individuales en tiempo real. Al colocar un sustrato de c&#xED;rculo rodante con una c&#xE1;mara de flujo TIRF microscopio montado, somos capaces de controlar la progresi&#xF3;n de los eventos de s&#xED;ntesis de ADN de una sola y medir con precisi&#xF3;n los precios y de un solo processivities T7 y replisomes Escherichia coli, ya que replicar el ADN. Este m&#xE9;todo permite la caracterizaci&#xF3;n r&#xE1;pida y precisa de la cin&#xE9;tica de la s&#xED;ntesis de ADN y los efectos de los inhibidores de la replicaci&#xF3;n.

En tiempo real de una sola mol&#xE9;cula de Observaci&#xF3;n de la replicaci&#xF3;n del ADN c&#xED;rculo rodante

&#x5149;&#x5B66;&#x6210;&#x50CF;&#x4E0E;&#x5206;&#x5B50;&#x64CD;&#x7EB5;&#x6280;&#x672F;&#x6700;&#x65B0;&#x8FDB;&#x5C55;&#x5DF2;&#x89C2;&#x5BDF;&#x4E2A;&#x522B;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x548C;&#x5B66;&#x4E60;&#x90FD;&#x5F88;&#x96BE;&#x6F84;&#x6E05;&#x4F7F;&#x7528;&#x5408;&#x594F;&#x5E73;&#x5747;&#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x8FDB;&#x7A0B;&#x7684;&#x52A8;&#x6001;&#x5C5E;&#x6027;&#x3002;&#x5229;&#x7528;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5DF2;&#x8BC1;&#x660E;&#x662F;&#x7279;&#x522B;&#x6210;&#x529F;&#x590D;&#x5236;&#x53C9;&#x5904;&#x7684;&#x7EC4;&#x4EF6;&#x7684;&#x52A8;&#x6001;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x8282;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x5FC5;&#x8981;&#x7684;&#x4F53;&#x5916;&#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x7814;&#x7A76; ofprokaryotic &#x590D;&#x5236;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5B9E;&#x9A8C;&#xFF0C;&#x53EF;&#x7387;&#x548C; processivities &#x7684; DNA &#x653E;&#x6599;&#x548C;&#x805A;&#x5408;&#x83B7;&#x5F97;&#x51C6;&#x786E;&#x7684;&#x4FE1;&#x606F;&#x3002;&#x5B9E;&#x65F6;&#x76D1;&#x89C6;&#x5355;&#x4E2A;&#x590D;&#x5236;&#x53C9;&#x7684;&#x8FDB;&#x5EA6;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x5141;&#x8BB8;&#x77ED;&#x6682;&#x3001; &#x4E2D;&#x95F4;&#x7684;&#x56FD;&#x5BB6;&#xFF0C;&#x5C31;&#x5F88;&#x96BE;&#x60F3;&#x8C61;&#x4E2D;&#x6279;&#x91CF;&#x9636;&#x6BB5;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x3002;

&#x539F;&#x6838; DNA &#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x89C2;&#x6D4B;&#x3002;

Recent advances in optical imaging and molecular manipulation techniques have made it possible to observe the activity of individual enzymes and study the dynamic properties of processes that are challenging to elucidate using ensemble-averaging techniques. The use of single-molecule approaches has proven to be particularly successful in the study of the dynamic interactions between the components at the replication fork. In this section, we describe the methods necessary for in vitro single-molecule studies ofprokaryotic replication systems. Through these experiments, accurate information can be obtained on the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization. The ability to monitor in real time the progress of a single replication fork allows for the detection of short-lived, intermediate states that would be difficult to visualize in bulk-phase assays.

Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.

Les progr&#xE8;s r&#xE9;cents de l&#x26;#39;imagerie optique et les techniques de manipulation mol&#xE9;culaires ont permis d&#x26;#39;observer l&#x26;#39;activit&#xE9; des enzymes individuels et d&#x26;#39;&#xE9;tudier les propri&#xE9;t&#xE9;s dynamiques des processus qui sont difficiles &#xE0; &#xE9;lucider &#xE0; l&#x26;#39;aide des techniques d&#x26;#39;&#xE9;talement ensemble. L&#x26;#39;utilisation de mol&#xE9;cule unique des approches s&#x26;#39;est av&#xE9;r&#xE9;e particuli&#xE8;rement fructueuse dans l&#x26;#39;&#xE9;tude des interactions dynamiques entre les composantes de la fourche de r&#xE9;plication. Dans cette section, nous d&#xE9;crivons les m&#xE9;thodes n&#xE9;cessaires pour des syst&#xE8;mes in vitro des &#xE9;tudes d&#x26;#39;une seule mol&#xE9;cule de r&#xE9;plication ofprokaryotic. Gr&#xE2;ce &#xE0; ces exp&#xE9;riences, des informations pr&#xE9;cises peuvent &#xEA;tre obtenues sur les taux et processivities de d&#xE9;roulement d&#x26;#39;ADN et la polym&#xE9;risation. La capacit&#xE9; de surveiller en temps r&#xE9;el l&#x26;#39;&#xE9;tat d&#x26;#39;avancement d&#x26;#39;une fourche de r&#xE9;plication unique permet la d&#xE9;tection de la courte dur&#xE9;e de vie, les &#xE9;tats interm&#xE9;diaires qui seraient difficiles &#xE0; visualiser en vrac phase des essais.

Simple-mol&#xE9;cule Observation de la r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN chez les procaryotes

J&uuml;ngste Fortschritte in der optischen Abbildung und Molekulare Manipulation Techniken haben es m&ouml;glich gemacht die Aktivit&auml;t der einzelnen Enzyme zu beobachten und die dynamischen Eigenschaften der Prozesse, die herausfordern um zu erhellen, mit Ensemble-Mittelwertbildung Techniken zu studieren. Einzelmolek&uuml;l-Konzepte der erweist sich besonders erfolgreich in der Studie der dynamischen Wechselwirkungen zwischen den Komponenten an der Wiederholunggabel. In diesem Abschnitt beschreiben wir die Methoden, die f&uuml;r in-vitro-Studien der Einzelmolek&uuml;l-Ofprokaryotic Replikationssysteme notwendig. Durch diese Experimente erhalten Sie genauer Informationen &uuml;ber die Preise und die Processivities der DNA abwickeln und Polymerisation. Die M&ouml;glichkeit, in Echtzeit &uuml;berwachen den Fortschritt von einem einzigen Wiederholunggabel zum Nachweis von kurzlebigen, fortgeschrittene Staaten, die w&auml;re schwierig, bei Bulk-Phase-Assays zu visualisieren.

Einzelmolek&uuml;l-Beobachtung der prokaryotischen DNA-Replikation.

I recenti progressi nelle tecniche di manipolazione molecolare e di imaging ottico hanno permesso di osservare l&#39;attivit&agrave; dei singoli enzimi e studiare le propriet&agrave; dinamiche dei processi che sono difficili a delucidare utilizzando tecniche ensemble-Media. L&#39;uso di approcci di singola molecola ha dimostrato di essere particolarmente riuscita nello studio delle interazioni dinamiche tra i componenti presso la forcella di replicazione. In questa sezione descriviamo i metodi necessari per i sistemi di replica ofprokaryotic studi in vitro di singola molecola. Attraverso questi esperimenti, accurate informazioni sulle tariffe e processivities del DNA e la polimerizzazione. La capacit&agrave; di monitorare in tempo reale lo stato di avanzamento di una forcella singola replica consente il rilevamento degli Stati intermedi, di breve durata che sarebbe difficile visualizzare in dosaggi di fase di massa.

Osservazione di singola molecola della replica del DNA procariota.

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&#xAD11;&#xD559; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xBC0F; &#xBD84;&#xC790; &#xC870;&#xC791; &#xAE30;&#xC220; &#xCD5C;&#xADFC;&#xC758; &#xC9C4;&#xBCF4;&#xB294; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xAD00;&#xCC30; &#xD558; &#xACE0; &#xC559;&#xC0C1;&#xBE14; &#xD3C9;&#xADE0; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBA85;&#xB8CC; &#xD558; &#xAC8C; &#xB3C4;&#xC804; &#xD558;&#xB294; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC758; &#xB3D9;&#xC801; &#xC18D;&#xC131;&#xC744; &#xACF5;&#xBD80;&#xB97C; &#xB9CC;&#xB4E4;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC811;&#xADFC;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xBCF5;&#xC81C; &#xD3EC;&#xD06C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C; &#xAC04;&#xC758; &#xB3D9;&#xC801; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD2B9;&#xD788; &#xC131;&#xACF5;&#xC744; &#xC785;&#xC99D; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC139;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; &#xCCB4; &#xC678; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC5F0;&#xAD6C; ofprokaryotic &#xBCF5;&#xC81C; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; DNA &#xD574;&#xC81C; &#xBC0F; &#xC911; &#xD569; processivities &#xBC0F; &#xC694;&#xAE08;&#xC5D0; &#xC815;&#xD655;&#xD55C; &#xC815;&#xBCF4;&#xB97C; &#xC5BB;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC0C1; &#xB300;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654; &#xD558;&#xAE30; &#xC5B4;&#xB824;&#xC6B4; &#xC9E7;&#xC740;, &#xC911;&#xAC04; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC758; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBCF5;&#xC81C; &#xD3EC;&#xD06C;&#xC758; &#xC9C4;&#xD589; &#xC0C1;&#xD669;&#xC744; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04;&#xC73C;&#xB85C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; prokaryotic DNA &#xBCF5;&#xC81C;&#xC758; &#xAD00;&#xCC30;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Los recientes avances en im&#xE1;genes &#xF3;pticas y de manipulaci&#xF3;n de las t&#xE9;cnicas moleculares han permitido observar la actividad de las enzimas individuales y estudiar las propiedades din&#xE1;micas de los procesos que son un reto para dilucidar mediante promediado conjunto de t&#xE9;cnicas. El uso de una sola mol&#xE9;cula de los enfoques ha demostrado ser particularmente exitoso en el estudio de las interacciones din&#xE1;micas entre los componentes en el tenedor de replicaci&#xF3;n. En esta secci&#xF3;n se describen los m&#xE9;todos necesarios para in vitro de mol&#xE9;culas de un solo sistema de replicaci&#xF3;n de los estudios ofprokaryotic. A trav&#xE9;s de estos experimentos, la informaci&#xF3;n precisa se puede obtener en los tipos y processivities de desenrollamiento del ADN y la polimerizaci&#xF3;n. La capacidad de monitorear en tiempo real el progreso de un tenedor de replicaci&#xF3;n permite por s&#xED; sola para la detecci&#xF3;n de corta duraci&#xF3;n, los estados intermedios, que ser&#xED;an dif&#xED;ciles de visualizar en los ensayos de fase a granel.

Una sola mol&#xE9;cula de Observaci&#xF3;n de la replicaci&#xF3;n del ADN procari&#xF3;tico

&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x6700;&#x65B0;&#x8FDB;&#x5C55;&#x5DF2;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2A;&#x522B;&#x9176;&#x548C;&#x5176;&#x4E0E; multiprotein &#x914D;&#x5408;&#x7269;&#x4E2D;&#x7684;&#x5176;&#x4ED6;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x52A8;&#x6001;&#x884C;&#x4E3A;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x65B0;&#x5F00;&#x53D1;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x7814;&#x7A76; DNA &#x653E;&#x6599;&#x3001; &#x8D77;&#x7206;&#x548C;&#x5408;&#x6210; DNA &#x590D;&#x5236;&#x53C9;&#x4E0A;&#x7684;&#x534F;&#x8C03;&#x3002;&#x5355;&#x4E2A; DNA &#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x957F;&#x5EA6;&#x7528;&#x6765;&#x6D4B;&#x91CF;&#x5355;&#x4E2A; replisomes &#x4ECE;&#x4E8B;&#x534F;&#x8C03; DNA &#x590D;&#x5236;&#x7684;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E00;&#xFF0C;&#x6813;&#x7CFB;&#x7C92;&#x5B50;&#x6280;&#x672F;&#x7528;&#x4E8E;&#x53EF;&#x89C6;&#x5316;&#x7684;&#x5F62;&#x6210;&#x548C;&#x91CA;&#x653E;&#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x5FAA;&#x73AF;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E8C;&#xFF0C;&#x8367;&#x5149;&#x6210;&#x50CF;&#x65B9;&#x6CD5;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x590D;&#x5236;&#x7387;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4ECE;&#x4E2A;&#x4EBA; replisomes processivities &#x76F4;&#x63A5;&#x8BFB;&#x51FA;&#x3002;&#x76F4;&#x63A5;&#x89C2;&#x5BDF;&#x77AC;&#x6001;&#x53CD;&#x5E94;&#x4E2D;&#x95F4;&#x4F53;&#x548C;&#x5B9A;&#x6027;&#x5F02;&#x7C7B;&#x884C;&#x4E3A;&#x80FD;&#x529B;&#x4F7F;&#x5F97;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6DFB;&#x52A0;&#x7684;&#x53EF;&#x7528;&#x6765;&#x7814;&#x7A76; DNA &#x590D;&#x5236;&#x7684;&#x5DE5;&#x5177;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x65B0;&#x5185;&#x5BB9;&#x3002;

&#x5728;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x53EF;&#x89C6;&#x5316; DNA &#x590D;&#x5236;&#x3002;

Recent advances in single-molecule methodology have made it possible to study the dynamic behavior of individual enzymes and their interactions with other proteins in multiprotein complexes. Here, we describe newly developed methods to study the coordination of DNA unwinding, priming, and synthesis at the DNA-replication fork. The length of individual DNA molecules is used to measure the activity of single replisomes engaged in coordinated DNA replication. First, a tethered-particle technique is used to visualize the formation and release of replication loops. Second, a fluorescence imaging method provides a direct readout of replication rates and processivities from individual replisomes. The ability to directly observe transient reaction intermediates and characterize heterogeneous behavior makes these single-molecule approaches important new additions to the tools available to study DNA replication.

Visualizing DNA replication at the single-molecule level.

Les progr&#xE8;s r&#xE9;cents dans une seule mol&#xE9;cule de la m&#xE9;thodologie ont permis d&#x26;#39;&#xE9;tudier le comportement dynamique des enzymes individuels et de leurs interactions avec d&#x26;#39;autres prot&#xE9;ines dans des complexes multiprot&#xE9;iques. Ici, nous d&#xE9;crivons les m&#xE9;thodes nouvellement d&#xE9;velopp&#xE9;es pour &#xE9;tudier la coordination de l&#x26;#39;ADN de d&#xE9;roulement, d&#x26;#39;amor&#xE7;age, et la synth&#xE8;se &#xE0; la fourche r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN. La longueur de mol&#xE9;cules individuelles d&#x26;#39;ADN est utilis&#xE9; pour mesurer l&#x26;#39;activit&#xE9; de replisomes simples engag&#xE9;s dans la r&#xE9;plication d&#x26;#39;ADN coordonn&#xE9;e. Tout d&#x26;#39;abord, une technique attach&#xE9;-particules est utilis&#xE9;e pour visualiser la formation et le rejet de boucles de r&#xE9;plication. Deuxi&#xE8;mement, une m&#xE9;thode d&#x26;#39;imagerie de fluorescence fournit une lecture directe du taux de r&#xE9;plication et de processivities replisomes individuels. La capacit&#xE9; d&#x26;#39;observer directement aux interm&#xE9;diaires de r&#xE9;action et de caract&#xE9;riser le comportement h&#xE9;t&#xE9;rog&#xE8;ne rend ces mol&#xE9;cules mono-s&#x26;#39;approche importants ajouts aux outils disponibles pour &#xE9;tudier r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN.

Visualisation de la r&#xE9;plication d&#x26;#39;ADN &#xE0; la mol&#xE9;cule seul niveau

J&uuml;ngste Fortschritte in der Einzelmolek&uuml;l-Methodik haben um das dynamische Verhalten der einzelnen Enzyme und ihre Interaktionen mit anderen Proteinen in multiprotein komplexe studieren erm&ouml;glicht. Hier beschreiben wir die neu entwickelte Methoden, um die Koordinierung der DNA entladen, Grundierung und Synthese an der Gabelung der DNA-Replikation zu studieren. Die L&auml;nge der einzelnen DNA-Molek&uuml;le wird verwendet, um die Aktivit&auml;t des einzigen Replisomes in der koordinierten DNA-Replikation zu ermitteln. Zun&auml;chst ist eine gefesselte-Partikel-Technik verwendet, um die Bildung und Freisetzung von Replikation Schleifen zu visualisieren. Zweitens bietet eine Fluoreszenz-Bildgebung-Methode eine direkte Auslesen der Replikation Preise und Processivities von einzelnen Replisomes. Die M&ouml;glichkeit direkt beobachten transiente Reaktion Zwischenprodukte und Charakterisierung heterogener Verhalten macht diese Ans&auml;tze Einzelmolek&uuml;l-wichtige Neuerungen f&uuml;r die Tools zur Verf&uuml;gung, um DNA-Replikation zu studieren.

Visualisierung der DNA-Replikation der Einzelmolek&uuml;l-Ebene.

I recenti progressi nella molecola singola metodologia hanno permesso di studiare il comportamento dinamico dei singoli enzimi e loro interazioni con altre proteine in complessi multiproteici. Qui, descriviamo recentemente sviluppati metodi per studiare il coordinamento della DNA svolgitura, adescamento e sintesi presso la forcella di replicazione del DNA. La lunghezza delle singole molecole di DNA viene utilizzata per misurare l&#39;attivit&agrave; del singolo replisomes impegnati in coordinato replicazione del DNA. In primo luogo, una tecnica di tethered-particella &egrave; usata per prevedere la formazione e il rilascio di cicli di replicazione. In secondo luogo, un metodo di formazione immagine di fluorescenza fornisce una lettura diretta delle tariffe di replica e processivities da replisomes individuali. La possibilit&agrave; di direttamente osservare intermedi di reazione transitoria e caratterizzare il comportamento eterogeneo rende questi approcci di singola molecola importanti nuove aggiunte agli strumenti disponibili per studiare la replicazione del DNA.

Visualizzando la replicazione del DNA a livello di singola molecola.

&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x8AD6;&#x306E;&#x6700;&#x8FD1;&#x306E;&#x9032;&#x6B69;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x500B;&#x3005;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x3084;&#x591A;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x52D5;&#x7684;&#x6319;&#x52D5;&#x3092;&#x7814;&#x7A76;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F5C;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;DNA-&#x8907;&#x88FD;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30AF;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;DNA&#x5DFB;&#x304D;&#x623B;&#x3057;&#x3001;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DF;&#x30F3;&#x30B0;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5408;&#x6210;&#x306E;&#x8ABF;&#x6574;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x65B0;&#x305F;&#x306B;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x305F;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x500B;&#x3005;&#x306E;DNA&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x9577;&#x3055;&#x304C;&#x8ABF;&#x6574;&#x3055;&#x308C;&#x305F;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x306B;&#x5F93;&#x4E8B;&#x3057;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;replisomes&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x521D;&#x306B;&#x3001;&#x30C6;&#x30B6;&#x30FC;&#x7C92;&#x5B50;&#x6280;&#x8853;&#x306F;&#x3001;&#x8907;&#x88FD;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x3068;&#x653E;&#x51FA;&#x3092;&#x8996;&#x899A;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x306B;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x500B;&#x3005;&#x306E;replisomes&#x304B;&#x3089;&#x8907;&#x88FD;&#x7387;&#x3068;processivities&#x306E;&#x76F4;&#x63A5;&#x8AAD;&#x307F;&#x51FA;&#x3057;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x76F4;&#x63A5;&#x4E00;&#x6642;&#x7684;&#x306A;&#x53CD;&#x5FDC;&#x4E2D;&#x9593;&#x4F53;&#x3092;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3057;&#x3001;&#x7570;&#x7A2E;&#x306E;&#x884C;&#x52D5;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3065;&#x3051;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306F;&#x3001;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306B;&#x5229;&#x7528;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x65B0;&#x6A5F;&#x80FD;&#x304C;&#x8FFD;&#x52A0;&#x306B;&#x8FD1;&#x3065;&#x304F;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3067;&#x306E;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x3092;&#x53EF;&#x8996;&#x5316;&#x3059;&#x308B;

&#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xBC29;&#xBC95;&#xB860;&#xC758; &#xCD5C;&#xADFC; &#xBC1C;&#xC804; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC640; &#xB2E4;&#xB978; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; multiprotein &#xB2E8;&#xC9C0;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC640; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xB3D9;&#xC801; &#xB3D9;&#xC791;&#xC744; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB97C; &#xB9CC;&#xB4E4;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; DNA &#xD574;&#xC81C;, &#xC560; &#xBC8C; &#xCE60;, &#xBC0F; DNA &#xBCF5;&#xC81C; &#xD3EC;&#xD06C;&#xC5D0; &#xC885;&#xD569; &#xC870;&#xC815; &#xACF5;&#xBD80;&#xB97C; &#xC0C8;&#xB85C; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xB41C; &#xB41C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAC1C;&#xBCC4; DNA &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xAE38;&#xC774; &#xC870;&#xC815;&#xB41C; DNA &#xBCF5;&#xC81C;&#xC5D0; &#xAD00;&#xC5EC; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xC77C; replisomes&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xCE21;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCCAB;&#xC9F8;, &#xB2FF;&#xB294; &#xC785;&#xC790; &#xAE30;&#xC220;&#xC740; &#xD615;&#xC131; &#xBC0F; &#xBCF5;&#xC81C; &#xB8E8;&#xD504;&#xAC00;&#xC758; &#xB9B4;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB458;&#xC9F8;, &#xD615;&#xAD11; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC; &#xBCF5;&#xC81C; &#xC728; &#xBC0F; &#xAC1C;&#xBCC4; replisomes&#xC5D0;&#xC11C; processivities&#xC758; &#xC9C1;&#xC811; &#xD310;&#xB3C5;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2A5;&#xB825;&#xC744; &#xC9C1;&#xC811; &#xACFC;&#xB3C4; &#xBC18;&#xC751; &#xC911;&#xAC04;&#xCCB4;&#xB97C; &#xAD00;&#xCC30; &#xD558; &#xACE0; &#xB2E4;&#xB978; &#xC720;&#xD615;&#xC758; &#xB3D9;&#xC791;&#xC758; &#xD2B9;&#xC131;&#xC740; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC811;&#xADFC; DNA &#xBCF5;&#xC81C; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB97C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC0C8; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC774; &#xCD94;&#xAC00;.

&#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC218;&#xC900;&#xC5D0;&#xC11C; DNA &#xBCF5;&#xC81C;&#xB97C; &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654;.

Los recientes avances en la metodolog&#xED;a de una sola mol&#xE9;cula ha permitido estudiar el comportamiento din&#xE1;mico de las enzimas individuales y sus interacciones con otras prote&#xED;nas en complejos multiproteicos. A continuaci&#xF3;n, describimos los nuevos m&#xE9;todos desarrollados para estudiar la coordinaci&#xF3;n de la anulaci&#xF3;n de ADN, el cebado y la s&#xED;ntesis de DNA en el tenedor de replicaci&#xF3;n. La longitud de las mol&#xE9;culas individuales de ADN se utiliza para medir la actividad de replisomes individuales que participan en la replicaci&#xF3;n del ADN coordinada. En primer lugar, una t&#xE9;cnica de atado-part&#xED;cula se utiliza para visualizar la formaci&#xF3;n y liberaci&#xF3;n de los bucles de replicaci&#xF3;n. En segundo lugar, un m&#xE9;todo de im&#xE1;genes de fluorescencia proporciona una lectura directa de las tasas de replicaci&#xF3;n y processivities de replisomes individuales. La posibilidad de observar directamente intermedios transitorios de reacci&#xF3;n y caracterizar el comportamiento heterog&#xE9;neo hace que estas sola mol&#xE9;cula-se acerca a importantes nuevas adiciones a las herramientas disponibles para estudiar la replicaci&#xF3;n del ADN.

Visualizaci&#xF3;n de la replicaci&#xF3;n del ADN en el &#xE1;mbito de una sola mol&#xE9;cula de

&#x5728; DNA &#x590D;&#x5236;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x79BB;&#x6563;&#x5188;&#x5D0E;&#x7247;&#x6BB5;&#x91CD;&#x590D;&#x5408;&#x6210;&#x9700;&#x8981;&#x673A;&#x5236;&#x4FDD;&#x8BC1; DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x3001; &#x5939;&#x548C; primase &#x86CB;&#x767D;&#x662F;&#x76EE;&#x524D;&#x4E3A;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x5468;&#x671F;&#x3002;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#xFF0C;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E00;&#x8FDB;&#x7A0B;&#x901A;&#x8FC7;&#x6ED1;&#x52A8;&#x5230;&#x7EC4;&#x88C5;&#x65B0; RNA &#x5E95;&#x6F06;&#x4E0A;&#x5939;&#x5939;&#x7559;&#x5728;&#x5DF2;&#x5B8C;&#x6210;&#x7684;&#x5188;&#x5D0E;&#x7247;&#x6BB5;&#x7684; &beta; &#x6EDE;&#x540E;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x8F6C;&#x79FB;&#x6536;&#x76CA;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x843D;&#x540E;&#x80A1;&#x5939;&#x88AB;&#x8BA4;&#x4E3A;&#x53D7;&#x7EA6;&#x675F;&#xFF0C;replisome &#x4ECE;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x5E76;&#x52A0;&#x8F7D;&#x4E00;&#x4E2A;&#x65B0;&#x7684;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x7247;&#x6BB5;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x4E86;&#x4EE4;&#x4EBA;&#x60CA;&#x8BB6;&#x3001; &#x66FF;&#x4EE3;&#x843D;&#x540E;&#x7EDE;&#x5408;&#x6210;&#x673A;&#x5236;&#xFF1A; replisome &#x9AD8;&#x6548;&#x7684;&#x590D;&#x5236;&#xFF0C;&#x5728;&#x6CA1;&#x6709;&#x4EFB;&#x4F55;&#x5939;&#x4EE5;&#x5916;&#x7684;&#x7EC4;&#x5408;&#x800C;&#x6210;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x5B9E;&#x9A8C;&#xFF0C;&#x663E;&#x793A;&#x590D;&#x5236;&#x590D;&#x5408;&#x7269;&#x7684;&#x9884;&#x88C5;&#x914D;&#x5BF9; DNA &#x652F;&#x6301;&#x5408;&#x6210;&#x7684;&#x591A;&#x4E2A;&#x5188;&#x5D0E;&#x7247;&#x6BB5;&#x4E2D;&#x6CA1;&#x6709;&#x591A;&#x4F59;&#x7684; &beta; &#x5939;&#x5177;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B; replisomes&#xFF0C;&#x800C;&#x4E0D;&#x662F;&#x6570;&#x91CF;&#x7684;&#x5408;&#x6210;&#x5188;&#x5D0E;&#x7247;&#x6BB5;&#xFF0C;processivity &#x662F;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E; RNA &#x5F15;&#x7269;&#x5408;&#x6210;&#x7684;&#x9891;&#x7387;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x6269;&#x5927;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x843D;&#x540E;&#x7EDE;&#x5408;&#x6210;&#x7684;&#x7406;&#x89E3;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5F3A;&#x8C03;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7684; replisome&#xFF0C;&#x7EE7;&#x7EED;&#x65E0;&#x65B0;&#x5939;&#x5408;&#x6210;&#x3002;

&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC; DNA &#x590D;&#x5236;&#x4E2D;&#x7F3A;&#x5E2D;&#x7684;&#x514D;&#x8D39; &beta; &#x5939;&#x3002;

During DNA replication, repetitive synthesis of discrete Okazaki fragments requires mechanisms that guarantee DNA polymerase, clamp, and primase proteins are present for every cycle. In Escherichia coli, this process proceeds through transfer of the lagging-strand polymerase from the Î² sliding clamp left at a completed Okazaki fragment to a clamp assembled on a new RNA primer. These lagging-strand clamps are thought to be bound by the replisome from solution and loaded a new for every fragment. Here, we discuss a surprising, alternative lagging-strand synthesis mechanism: efficient replication in the absence of any clamps other than those assembled with the replisome. Using single-molecule experiments, we show that replication complexes pre-assembled on DNA support synthesis of multiple Okazaki fragments in the absence of excess Î² clamps. The processivity of these replisomes, but not the number of synthesized Okazaki fragments, is dependent on the frequency of RNA-primer synthesis. These results broaden our understanding of lagging-strand synthesis and emphasize the stability of the replisome to continue synthesis without new clamps.

E. coli DNA replication in the absence of free Î² clamps.

Au cours de r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN, la synth&#xE8;se de fragments d&#x26;#39;Okazaki r&#xE9;p&#xE9;titif discr&#xE8;tes exige des m&#xE9;canismes qui garantissent l&#x26;#39;ADN polym&#xE9;rase, une pince, et les prot&#xE9;ines primase sont pr&#xE9;sents pour chaque cycle. Chez Escherichia coli, ce processus produit par le transfert de la polym&#xE9;rase en retard brin de la pince &#x3B2; coulissant &#xE0; gauche &#xE0; un fragment d&#x26;#39;Okazaki achev&#xE9; &#xE0; une pince mont&#xE9;e sur une nouvelle amorce d&#x26;#39;ARN. Ces pinces retard brin sont pens&#xE9;s pour &#xEA;tre li&#xE9; par la r&#xE9;plisome de la solution et a charg&#xE9; un nouveau pour chaque fragment. Ici, nous discutons d&#x26;#39;un &#xE9;tonnant m&#xE9;canisme alternatif de synth&#xE8;se retard brin: r&#xE9;plication efficace en l&#x26;#39;absence de toute pinces autres que ceux assembl&#xE9;s &#xE0; l&#x26;#39;r&#xE9;plisome. En utilisant une seule mol&#xE9;cule d&#x26;#39;exp&#xE9;riences, nous montrons que les complexes de r&#xE9;plication pr&#xE9;-assembl&#xE9;s sur la synth&#xE8;se de l&#x26;#39;ADN du soutien de multiples fragments d&#x26;#39;Okazaki, en l&#x26;#39;absence de pinces &#xDF; exc&#xE8;s. Le processivit&#xE9; de ces replisomes, mais pas le nombre de fragments d&#x26;#39;Okazaki synth&#xE9;tis&#xE9;s, est d&#xE9;pendante de la fr&#xE9;quence de l&#x26;#39;ARN-amorce de synth&#xE8;se. Ces r&#xE9;sultats &#xE9;largissent notre compr&#xE9;hension de retard brin de synth&#xE8;se et de mettre l&#x26;#39;accent sur la stabilit&#xE9; de la r&#xE9;plisome de continuer la synth&#xE8;se sans pinces nouvelles.

E. Coli de r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN dans l&#x26;#39;absence de Free Pinces b&#xEA;ta

W&auml;hrend der DNA-Replikation erfordert sich wiederholenden Synthese von diskreten Okazaki-Fragmente Mechanismen, die gew&auml;hrleisten, dass DNA-Polymerase, Klemme und Primase Proteine f&uuml;r jeden Zyklus vorhanden sind. Escherichia coli schreitet dieser Prozess durch Umwandlung der Verz&ouml;gerungsstrang Polymerase von der &beta;-Klemme links an eine abgeschlossene Okazaki-Fragment in eine Klemme, montiert auf einem neuen RNS-Z&uuml;ndkapsel schieben. Diese Verz&ouml;gerungsstrang Klemmen werden gedacht, um durch die Replisom von L&ouml;sung gebunden zu sein und ein neues f&uuml;r jedes Fragment geladen. Hier diskutieren wir einen &uuml;berraschenden und alternative Verz&ouml;gerungsstrang Synthese-Mechanismus: effiziente Replikation in Ermangelung jeder Klemmen als die mit dem Replisom zusammengebaut. Anhand Einzelmolek&uuml;l-Experimente zeigen wir, dass die Replikation-komplexe auf DNA-Unterst&uuml;tzung-Synthese mehrere Okazaki-Fragmente keine &uuml;bersch&uuml;ssige &beta; Schellen vormontiert. Die Processivity von diesen Replisomes, aber nicht die Anzahl der Okazaki-Fragmenten synthetisiert, ist abh&auml;ngig von der H&auml;ufigkeit der RNA-Primer-Synthese. Diese Ergebnisse unser Verst&auml;ndnis der Verz&ouml;gerungsstrang Synthese erweitern und betonen die Stabilit&auml;t der Replisom Synthese ohne neue Klemmen weiter.

E. Coli DNA-Replikation keine freie &beta;-Klemmen.

Durante la replicazione del DNA, ripetitive sintesi dei frammenti di Okazaki discreti richiede meccanismi che garantiscono la DNA polimerasi, pinza e primasi proteine sono presenti per ogni ciclo. In Escherichia coli, questo processo procede attraverso il trasferimento della polimerasi in ritardo-filo da &beta; scorrevole pinza sinistra a un frammento di Okazaki completato da una pinza montata su un nuovo primer di RNA. Queste pinze in ritardo-filo sono pensate per essere vincolato dal replisome dalla soluzione e caricata una nuova per ogni frammento. Qui, si discute di un meccanismo di sintesi del filamento lagging sorprendente, alternativa: replica efficiente in assenza di qualsiasi morsetti diversi da quelli assemblati con il replisome. Tramite esperimenti di singola molecola, mostriamo che complessi replica premontati sulla sintesi del DNA il supporto di pi&ugrave; frammenti di Okazaki in assenza di morsetti &beta; in eccesso. Il processivity di questi replisomes, ma non il numero di frammenti di Okazaki sintetizzati, dipende dalla frequenza di sintesi di RNA-primer. Questi risultati ampliano la nostra comprensione della sintesi del filamento in ritardo e sottolineano la stabilit&agrave; del replisome continuare sintesi senza nuove fascette.

Fascette di e. coli la replicazione del DNA in assenza di &beta; libero.

DNA&#x8907;&#x88FD;&#x6642;&#x306B;&#x3001;&#x96E2;&#x6563;&#x5CA1;&#x5D0E;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x53CD;&#x5FA9;&#x7684;&#x306A;&#x5408;&#x6210;&#x306F;&#x3001;&#x4FDD;&#x8A3C;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3001;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306F;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5B58;&#x5728;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;RNA&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x4E0A;&#x306B;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306B;&#x5B8C;&#x4E86;&#x3057;&#x305F;&#x5CA1;&#x5D0E;&#x65AD;&#x7247;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x3067;&#x3B2;&#x30B9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x304B;&#x3089;&#x30E9;&#x30AE;&#x30F3;&#x30B0;&#x9396;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x79FB;&#x8EE2;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306F;&#x7D9A;&#x884C;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30E9;&#x30AE;&#x30F3;&#x30B0;&#x9396;&#x306E;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306F;&#x3001;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x304B;&#x3089;replisome&#x306B;&#x62D8;&#x675F;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x8003;&#x3048;&#x3001;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x65B0;&#x305F;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002; replisome&#x3067;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x305F;&#x3082;&#x306E;&#x4EE5;&#x5916;&#x306E;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x8907;&#x88FD;&#xFF1A;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x9A5A;&#x304F;&#x3079;&#x304D;&#x3001;&#x5225;&#x306E;&#x30E9;&#x30AE;&#x30F3;&#x30B0;&#x9396;&#x5408;&#x6210;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x8907;&#x88FD;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x904E;&#x5270;&#x306A;&#x3B2;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x6709;&#x7121;&#x3067;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x5CA1;&#x5D0E;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;DNA&#x306E;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x3042;&#x3089;&#x304B;&#x3058;&#x3081;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;replisomes&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x5408;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5CA1;&#x5D0E;&#x65AD;&#x7247;&#x306E;&#x6570;&#x306F;&#x3001;RNA-&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x5408;&#x6210;&#x306E;&#x5468;&#x6CE2;&#x6570;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x30E9;&#x30AE;&#x30F3;&#x30B0;&#x9396;&#x5408;&#x6210;&#x306E;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7406;&#x89E3;&#x3092;&#x5E83;&#x3052;&#x3001;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306A;&#x3057;&#x3067;&#x5408;&#x6210;&#x3092;&#x7D99;&#x7D9A;&#x3059;&#x308B;replisome&#x306E;&#x5B89;&#x5B9A;&#x6027;&#x3092;&#x5F37;&#x8ABF;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x7121;&#x6599;&#x3B2;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x4E0D;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;DNA&#x8907;&#x88FD;

DNA &#xBCF5;&#xC81C; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xC624;&#xCE74;&#xC790;&#xD0A4; &#xC870;&#xAC01;&#xC758; &#xBC18;&#xBCF5;&#xC801;&#xC778; &#xD569;&#xC131; DNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;, &#xD074;&#xB7A8;&#xD504;, &#xBC0F; primase &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC740; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC874;&#xC7AC;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC7A5; &#xD558;&#xB294; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC774; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;,&#xC774; &#xACFC;&#xC815;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; RNA &#xB1CC;&#xAD00;&#xC5D0; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504;&#xB97C; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; &#xC67C;&#xCABD; &#xC644;&#xB8CC; &#xB41C; &#xC624;&#xCE74;&#xC790;&#xD0A4; &#xC870;&#xAC01;&#xC5D0; &#xC2AC;&#xB77C;&#xC774;&#xB529; &beta; &#xB4A4;&#xC9C0;&#xB294; &#xAC00;&#xB2E5; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xC591;&#xB3C4; &#xC9C4;&#xD589; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB4A4;&#xC9C0;&#xB294; &#xAC00;&#xB2E5; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504;&#xB294; replisome &#xC194;&#xB8E8;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC900;&#xC218;&#xD560; &#xAC83;&#xC744; &#xC0DD;&#xAC01; &#xD558; &#xACE0; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xC870;&#xAC01;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xB85C;&#xB4DC;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB180;&#xB77C;&#xC6B4; &#xB300;&#xC548; &#xB4A4;&#xC9C0;&#xB294; &#xAC00;&#xB2E5; &#xD569;&#xC131; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xB17C;&#xC758;: &#xC774;&#xC678;&#xC758; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504;&#xC758; &#xBD80;&#xC7AC;&#xC5D0; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xBCF5;&#xC81C;&#xB294; replisome&#xC640; &#xC870;&#xB9BD;. &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xBCF5;&#xC81C; &#xB2E8;&#xC9C0; &#xCD08;&#xACFC; &beta; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; &#xC5C6;&#xC774; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC624;&#xCE74;&#xC790;&#xD0A4; &#xC870;&#xAC01;&#xC758; DNA &#xC9C0;&#xC6D0; &#xC885;&#xD569;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC870;&#xB9BD; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; replisomes &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xD569;&#xC131; &#xC624;&#xCE74;&#xC790;&#xD0A4; &#xC870;&#xAC01;&#xC758; &#xC218; &#xC5C6;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; processivity RNA &#xB1CC;&#xAD00; &#xC885;&#xD569;&#xC758; &#xC8FC;&#xD30C;&#xC218;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xB2EC;&#xB77C; &#xC9D1;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; &#xB4A4;&#xC9C0;&#xB294; &#xAC00;&#xB2E5; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC774;&#xD574;&#xB97C; &#xD655;&#xB300; &#xD558; &#xACE0; &#xACC4;&#xC18D; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; &#xC5C6;&#xC774; &#xD569;&#xC131; replisome&#xC758; &#xC548;&#xC815;&#xC131;&#xC744; &#xAC15;&#xC870;.

&#xBB34;&#xB8CC; &beta; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504;&#xC758; &#xBD80;&#xC7AC;&#xC5D0; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; DNA &#xBCF5;&#xC81C;.

Durante la replicaci&#xF3;n del ADN, s&#xED;ntesis repetitiva de discretos fragmentos de Okazaki requiere mecanismos que la polimerasa de ADN de garant&#xED;a, la abrazadera, y las prote&#xED;nas primase est&#xE1;n presentes para cada ciclo. En E. coli, este proceso pasa a trav&#xE9;s de transferencia de la polimerasa en retraso-hebra de la abrazadera &#x3B2; deslizante a la izquierda en un fragmento de Okazaki completado a una abrazadera montada sobre un nuevo cebador de ARN. Estas abrazaderas cadena retrasada se cree que est&#xE1;n obligados por el replisoma de la soluci&#xF3;n y se carga una nueva para cada fragmento. En este caso, hablamos de una sorprendente alternativa de retraso-cadena mecanismo de s&#xED;ntesis: la replicaci&#xF3;n eficiente en la ausencia de las abrazaderas que no sean las de ensamblaje con el replisoma. Utilizando una sola mol&#xE9;cula de experimentos, se muestra que los complejos de replicaci&#xF3;n pre-ensamblados en la s&#xED;ntesis de ADN apoyo de m&#xFA;ltiples fragmentos de Okazaki, en ausencia de pinzas beta en exceso. La procesividad de estos replisomes, pero no el n&#xFA;mero de fragmentos sintetizados Okazaki, es dependiente de la frecuencia de la s&#xED;ntesis de ARN-cebador. Estos resultados ampl&#xED;an la comprensi&#xF3;n de la s&#xED;ntesis de retraso-cap&#xED;tulo y hacer hincapi&#xE9; en la estabilidad de la replisoma para continuar la s&#xED;ntesis sin pinzas nuevas.

Nathan A. Tanner

Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology

Harvard Medical School

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay