Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in <em>Xenopus</em> oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Washington University in St. Louis

&#x7535;&#x538B;&#x4F20;&#x611F;&#x5668;&#x57DF; (VSD) &#x548C;&#x914D;&#x4F53;&#x4F20;&#x611F;&#x5668; &#xFF08;&#x80DE;&#x8D28;&#x57DF;&#xFF09; &#x7684;&#x6D45;&#x6EE9;&#x6E20;&#x9053;&#x534F;&#x540C;&#x63A7;&#x5236;&#x901A;&#x9053;&#x6D3B;&#x52A8;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x7EFC;&#x5408;&#x7535;&#x5668;&#x548C;&#x5316;&#x5B66;&#x4FE1;&#x53F7;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x529F;&#x80FD;&#x3002;&#x7814;&#x7A76;&#x8868;&#x660E;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185; Mg2 + &#x4ECB;&#x5BFC;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x611F;&#x5B98;&#x57DF;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x901A;&#x8FC7;&#x9759;&#x7535;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x4E0E;&#x5BA4;&#x95F4;&#x9694;&#x7F3A;&#x635F;&#x901A;&#x9053;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A; Mg2 + &#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7AD9;&#x70B9;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x4FA7;&#x94FE;&#x4ECE;&#x5BA4;&#x95F4;&#x9694;&#x7F3A;&#x635F; (Asp99 &#x548C; Asn172) &#x548C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x57DF; &#xFF08;Glu374 &#x548C; Glu399&#xFF09;&#x3002;&#x5BF9;&#x4E8E;&#x6BCF;&#x4E2A; Mg2 + &#x7ED1;&#x5B9A;&#x7AD9;&#x70B9;&#xFF0C;&#x5BA4;&#x95F4;&#x9694;&#x7F3A;&#x635F;&#x4E2D;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x91CF;&#x53CA;&#x80DE;&#x8D28;&#x57DF;&#x4E2D;&#x90A3;&#x4E9B;&#x6765;&#x81EA;&#x76F8;&#x90BB;&#x7684;&#x4E9A;&#x57FA;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x5728;&#x5BA4;&#x95F4;&#x9694;&#x7F3A;&#x635F;&#x548C;&#x4ECE;&#x4E0D;&#x540C;&#x4E9A;&#x57FA;&#x7684;&#x80DE;&#x8D28;&#x57DF;&#x53EF;&#x80FD;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4EA4;&#x4E92;&#x901A;&#x9053;&#x95E8;&#x63A7;&#xFF0C;&#x548C;&#x5BA4;&#x95F4;&#x9694;&#x7F3A;&#x635F;&#x6216; BK &#x901A;&#x9053;&#x4E2D;&#x5B54;&#x9699;&#x7684; RCK1 &#x57DF;&#x5305;&#x88C5;&#x6709;&#x6240;&#x4E0D;&#x540C;&#xFF0C;&#x5728; Kv1.2 &#x6216; MthK &#x7684;&#x6E20;&#x9053;&#x3002;

&#x7535;&#x538B;&#x4F20;&#x611F;&#x5668;&#x548C; RCK1 &#x57DF;&#x4E4B;&#x95F4;&#x534F;&#x8C03;&#x7684; Mg2 + Slo1 BK &#x901A;&#x9053;&#x7684;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x3002;

The voltage-sensor domain (VSD) and the ligand sensor (cytoplasmic domain) of BK channels synergistically control channel activities, thereby integrating electrical and chemical signals for cell function. Studies show that intracellular Mg2+ mediates the interaction between these sensory domains to activate the channel through an electrostatic interaction with the VSD. Here we report that Mg2+ binds to a site that consists of amino acid side chains from both the VSD (Asp99 and Asn172) and the cytoplasmic domain (Glu374 and Glu399). For each Mg2+ binding site, the residues in the VSD and those in the cytoplasmic domain come from neighboring subunits. These results suggest that the VSD and the cytoplasmic domains from different subunits may interact during channel gating, and the packing of VSD or the RCK1 domain to the pore in BK channels differ from that in Kv1.2 or MthK channels.

Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1 domains.

Le domaine de tension de capteur (CIV) et le capteur de ligand (domaine cytoplasmique) de canaux BK synergique contr&#xF4;ler les activit&#xE9;s de canal, int&#xE9;grant ainsi des signaux &#xE9;lectriques et chimiques pour la fonction cellulaire. Des &#xE9;tudes montrent que Mg2 + intracellulaire le m&#xE9;diateur de l&#x26;#39;interaction entre ces domaines sensoriels pour activer le canal &#xE0; travers une interaction &#xE9;lectrostatique avec le VSD. Nous rapportons ici que Mg 2 + se lie &#xE0; un site qui se compose de cha&#xEE;nes lat&#xE9;rales d&#x26;#39;acides amin&#xE9;s &#xE0; la fois du VSD (Asp99 et Asn172) et le domaine cytoplasmique (Glu374 et Glu399). Pour chaque site de liaison Mg 2 +, les r&#xE9;sidus dans le VSD et ceux dans le domaine cytoplasmique proviennent de sous-unit&#xE9;s voisines. Ces r&#xE9;sultats sugg&#xE8;rent que la VSD et les domaines cytoplasmiques de diff&#xE9;rentes sous-unit&#xE9;s peuvent interagir au cours de d&#xE9;clenchement de canal, et l&#x26;#39;emballage de VSD ou le domaine RCK1 au pore dans les canaux BK diff&#xE9;rente de celle de Kv1.2 ou canaux MthK.

Activation des canaux BK Slo1 par Mg 2 + coordonn&#xE9;s entre le capteur de tension et de RCK1 Domaines

Der Spannungssensor Dom&auml;ne (VSD) und der Ligand-Sensor (zytoplasmatischen Dom&auml;ne) BK-Kan&auml;le steuern synergistisch Kanal Aktivit&auml;ten, damit Integration von elektrischen und chemischen Signale f&uuml;r Zellfunktion. Studien zeigen, dass intrazellul&auml;ren Mg2 + die Interaktion zwischen diesen sensorischen Dom&auml;nen vermittelt, den Kanal durch eine elektrostatische Interaktion mit den VSD zu aktivieren. Hier berichten wir, dass Mg2 + an einem Standort bindet, der Aminos&auml;ure-Seitenketten aus der VSD (Asp99 und Asn172) und der zytoplasmatischen Dom&auml;ne (Glu374 und Glu399) besteht. F&uuml;r jedes Mg2 + Bindungsstelle kommen die R&uuml;ckst&auml;nde in der VSD und diejenigen in der zytoplasmatischen Dom&auml;ne aus dem benachbarten Untereinheiten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die VSD und die zytoplasmatischen Dom&auml;nen aus verschiedenen Untereinheiten w&auml;hrend Kanal Anspritzung einwirken und die Verpackung der VSD oder der RCK1-Dom&auml;ne zu der Pore in BK Kan&auml;len unterscheidet sich von dem in Kv1.2 oder MthK Kan&auml;le k&ouml;nnen.

Aktivierung des Slo1 BK Channels von Mg2 + koordiniert zwischen der Spannungssensor und RCK1 Dom&auml;nen.

Il dominio di sensore di voltaggio (VSD) e il sensore di ligando (dominio citoplasmatico) dei canali BK sinergicamente controllo attivit&agrave; di canale, quindi integrare segnali elettrici e chimici per la funzione delle cellule. Gli studi dimostrano che Mg2 + intracellulare media l&#39;interazione tra questi domini sensoriali per attivare il canale attraverso un&#39;interazione elettrostatica con VSD. Qui riportiamo che Mg2 + lega ad un sito che &egrave; costituito da catene laterali dell&#39;amminoacido dal VSD (Asp99 e Asn172) sia il dominio citoplasmatico (Glu374 e Glu399). Per ogni sito di legame del Mg2 +, i residui in VSD e quelli del dominio citoplasmatico venire dalle limitrofe subunit&agrave;. Questi risultati suggeriscono che il VSD e i domini citoplasmatici da diverse subunit&agrave; possono interagire durante il canale gating e l&#39;imballaggio di VSD o il dominio di RCK1 per il poro in canali BK differisce da quello nei canali Kv1.2 o MthK.

Attivazione dei canali Slo1 BK di Mg2 + coordinato tra il sensore di voltaggio e RCK1 domini.

BK&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x96FB;&#x4F4D;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#xFF08;VSD&#xFF09;&#x3068;&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC;&#xFF08;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#xFF09;&#x304C;&#x76F8;&#x4E57;&#x7684;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x7D30;&#x80DE;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x96FB;&#x6C17;&#x7684;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x3092;&#x7D71;&#x5408;&#x3057;&#x3001;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x5236;&#x5FA1;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x306E;Mg2 +&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3057;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x611F;&#x899A;&#x306E;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x304C;VSD&#x3068;&#x306E;&#x9759;&#x96FB;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3092;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;Mg2 +&#x304C;VSD&#xFF08;Asp99&#x3068;Asn172&#xFF09;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#xFF08;Glu374&#x3068;Glu399&#xFF09;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x5074;&#x9396;&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x5404;Mg2 +&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x306F;&#x3001;VSD&#x306E;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x3082;&#x306E;&#x306F;&#x3001;&#x96A3;&#x63A5;&#x3059;&#x308B;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x6765;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;VSD&#x3068;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3001;&#x3068;BK&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x7D30;&#x5B54;&#x3078;&#x306E;VSD&#x306E;&#x68B1;&#x5305;&#x307E;&#x305F;&#x306F;RCK1&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;Kv1.2&#x307E;&#x305F;&#x306F;MthK&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x3082;&#x306E;&#x3068;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x3002;

MG2&#x306B;&#x3088;&#x308B;SLO1 BK&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;+&#x96FB;&#x5727;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC;&#x3068;RCK1&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x9593;&#x306E;&#x5354;&#x5B9A;

&#xC804;&#xC555; &#xC13C;&#xC11C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; (VSD) &#xBCF4; &#xB9AC; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xB9AC;&#xAC04;&#xB4DC; &#xC13C;&#xC11C; (&#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;) synergistically &#xCC44;&#xB110; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xD568;&#xC73C;&#xB85C;&#xC368; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC804;&#xAE30; &#xBC0F; &#xD654;&#xD559; &#xC2E0;&#xD638;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD569; &#xC81C;&#xC5B4;. &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; Mg2 + &#xC911;&#xC7AC;&#xB294; VSD&#xC640; &#xC815;&#xC804;&#xAE30; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xCC44;&#xB110;&#xC744; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xAC10;&#xAC01; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; Mg2 + &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; VSD (Asp99 &#xBC0F; Asn172) &#xBC0F; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; (Glu374 &#xBC0F; Glu399)&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0AC;&#xC774;&#xB4DC; &#xCCB4;&#xC778; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;&#xC73C;&#xB85C; &#xAD6C;&#xC131; &#xB41C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB97C; &#xBCF4;&#xACE0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAC01; Mg2 + &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB294; VSD&#xC758; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xBC0F; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xC778;&#xC811; &#xD55C; &#xD558;&#xC704; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC654;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; VSD&#xC640; &#xB2E4;&#xB978; &#xD558;&#xC704; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xCC44;&#xB110; &#xAC8C;&#xC774;&#xD305;, &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC73C;&#xBA70; VSD &#xB610;&#xB294; &#xBCF4; &#xB9AC; &#xCC44;&#xB110;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAE30; &#xACF5;&#xC5D0; RCK1 &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xD328;&#xD0B9;&#xC744; Kv1.2 &#xB610;&#xB294; MthK &#xCC44;&#xB110;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E4; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Mg2 + Slo1 BK &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xC804;&#xC555; &#xC13C;&#xC11C;&#xC640; RCK1 &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xAC04;&#xC758; &#xC870;&#xC815;.

El dominio del detector de voltaje (CIV) y el sensor de ligando (dominio citopl&#xE1;smico) de canales BK sin&#xE9;rgicamente controlar las actividades de canal, con lo que la integraci&#xF3;n de las se&#xF1;ales el&#xE9;ctricas y qu&#xED;micas para la funci&#xF3;n celular. Los estudios demuestran que Mg2 + intracelular media la interacci&#xF3;n entre estos dominios sensoriales para activar el canal a trav&#xE9;s de una interacci&#xF3;n electrost&#xE1;tica con la CIV. Aqu&#xED; mostramos que Mg 2 + se une a un sitio que est&#xE1; formado por cadenas de amino&#xE1;cidos, tanto de la CIV (Asp99 y Asn172) y el dominio citopl&#xE1;smico (Glu374 y Glu399). Para cada sitio de uni&#xF3;n Mg 2 +, los residuos en la CIV y los del dominio citopl&#xE1;smico provienen de subunidades vecinos. Estos resultados sugieren que la CIV y los dominios citopl&#xE1;smicos de diferentes subunidades pueden interactuar durante compuerta del canal, y el embalaje de VSD o el dominio RCK1 al poro en los canales BK difieren de la de Kv1.2 o canales MthK.

La activaci&#xF3;n de los canales BK Slo1 por el Mg 2 + de forma coordinada entre el sensor de voltaje y dominios RCK1

Ca(2+) &#x6FC0;&#x6D3B; BK &#x901A;&#x9053;&#x8C03;&#x8282;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x7684;&#x6D3B;&#x52A8;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x5CF0;&#x503C;&#x9891;&#x7387;&#x9002;&#x5E94;&#x548C;&#x7A81;&#x89E6;&#x4F20;&#x9012;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x53D1;&#x73B0; Ca(2+) &#x7ED1;&#x5B9A;&#x7AD9;&#x70B9;&#x548C;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x95E8;&#x901A;&#x9053;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x4F46;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x6253;&#x5F00;&#x54EA;&#x4E2A;&#x7ECF;&#x6B64;&#x8DDD;&#x79BB;&#x5927;&#x95E8;&#x4ECD;&#x7136;&#x672A;&#x77E5;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#x5728;&#x7A7A;&#x95F4;&#x5206;&#x9694;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x7814;&#x7A76; Asp &#x5411;&#x7518;&#x7A81;&#x53D8; (D434G) &#x4E0E;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EFC;&#x5408;&#x5F81;&#x7684;&#x5168;&#x8EAB;&#x6027;&#x766B;&#x75EB;&#x7684;&#x4E34;&#x5E8A;&#x4E0E;&#x9635;&#x53D1;&#x6027;&#x8FD0;&#x52A8;&#x969C;&#x788D; &#xFF08;GEPD&#xFF09;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A;&#x540E;&#x7ACB;&#x5373;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x95E8; S6 &#x87BA;&#x65CB;&#xFF0C;&#x79F0;&#x4E3A;&#x4EA4;&#x6D41;&#x533A;&#x57DF;&#xFF0C;&#x6E38;&#x79BB;&#x4E3B;&#x9898;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x53D8;&#x6784;&#x7ECF;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4E0E;&#x901A;&#x9053;&#x5F00;&#x653E;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x8026;&#x5408;&#x3002;GEPD &#x7A81;&#x53D8;&#x4EA4;&#x6D41;&#x533A;&#x57DF;&#x5185;&#x7684;&#x589E;&#x52A0; BK &#x901A;&#x9053;&#x6D3B;&#x52A8;&#x52A0;&#x5F3A;&#x8FD9;&#x79CD;&#x53D8;&#x6784;&#x8026;&#x5408;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x7ECF;&#x654F;&#x611F;&#x6027;&#x901A;&#x8FC7;&#x589E;&#x52A0;&#x4E2D;&#x51CF;&#x5C11;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x7684;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x7C98;&#x5EA6;&#x589E;&#x5F3A;&#x3002;GEPD &#x7A81;&#x53D8;&#x6539;&#x53D8;&#x4E86;&#x8FD9;&#x79CD;&#x53CD;&#x5E94;&#xFF0C;&#x6697;&#x793A;&#x4E0D;&#x592A;&#x7075;&#x6D3B;&#x7684;&#x4EA4;&#x6D41;&#x533A;&#x57DF;&#x53EF;&#x80FD;&#x4F1A;&#x66F4;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x8026;&#x5408;&#x7ECF;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x901A;&#x9053;&#x5F00;&#x653E;&#x3002;

&#x766B;&#x75EB;&#x8FD0;&#x52A8;&#x969C;&#x788D;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x901A;&#x8FC7;&#x53D1;&#x6325;&#x5176;&#x6F5C;&#x80FD; Ca2 + &#x4F20;&#x611F;&#x589E;&#x5F3A;&#x4E86; BK &#x901A;&#x9053;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x3002;

Ca(2+)-activated BK channels modulate neuronal activities, including spike frequency adaptation and synaptic transmission. Previous studies found that Ca(2+)-binding sites and the activation gate are spatially separated in the channel protein, but the mechanism by which Ca(2+) binding opens the gate over this distance remains unknown. By studying an Asp-to-Gly mutation (D434G) associated with human syndrome of generalized epilepsy and paroxysmal dyskinesia (GEPD), we show that a cytosolic motif immediately following the activation gate S6 helix, known as the AC region, mediates the allosteric coupling between Ca(2+) binding and channel opening. The GEPD mutation inside the AC region increases BK channel activity by enhancing this allosteric coupling. We found that Ca(2+) sensitivity is enhanced by increases in solution viscosity that reduce protein dynamics. The GEPD mutation alters such a response, suggesting that a less flexible AC region may be more effective in coupling Ca(2+) binding to channel opening.

An epilepsy/dyskinesia-associated mutation enhances BK channel activation by potentiating Ca2+ sensing.

Ca (2 +) activ&#xE9;s par des canaux BK moduler les activit&#xE9;s neuronales, y compris l&#x26;#39;adaptation fr&#xE9;quence d&#x26;#39;impulsion et la transmission synaptique. Des &#xE9;tudes ant&#xE9;rieures ont montr&#xE9; que Ca (2 +) des sites de liaison et la porte d&#x26;#39;activation sont s&#xE9;par&#xE9;es spatialement dans la prot&#xE9;ine du canal, mais le m&#xE9;canisme par lequel Ca (2 +) de liaison ouvre la porte sur cette distance reste inconnue. En &#xE9;tudiant une mutation Asp-&#xE0;-Gly (D434G) associ&#xE9;e au syndrome de l&#x26;#39;homme de l&#x26;#39;&#xE9;pilepsie g&#xE9;n&#xE9;ralis&#xE9;e et la dyskin&#xE9;sie paroxystique (GEPD), nous montrons que un motif cytosolique imm&#xE9;diatement apr&#xE8;s la porte d&#x26;#39;activation S6 h&#xE9;lice, connu sous le nom de la r&#xE9;gion AC, le m&#xE9;diateur de l&#x26;#39;accouplement allost&#xE9;rique entre Ca (2 +) et l&#x26;#39;ouverture du canal de liaison. La mutation GEPD int&#xE9;rieur de la r&#xE9;gion CA augmente BK activit&#xE9; du canal par l&#x26;#39;am&#xE9;lioration de ce couplage allost&#xE9;rique. Nous avons constat&#xE9; que Ca (2 +) la sensibilit&#xE9; est am&#xE9;lior&#xE9;e par l&#x26;#39;augmentation de la viscosit&#xE9; solution qui r&#xE9;duisent la dynamique des prot&#xE9;ines. La mutation GEPD modifie une telle r&#xE9;ponse, ce qui sugg&#xE8;re que d&#x26;#39;une r&#xE9;gion moins flexible AC peut &#xEA;tre plus efficace dans le couplage Ca (2 +) se liant &#xE0; l&#x26;#39;ouverture du canal.

Une &#xE9;pilepsie / dyskin&#xE9;sie associ&#xE9;e mutation am&#xE9;liore BK activation des canaux en potentialisant Ca2 + Sensing

Ca(2+) aktivierte BK Kan&auml;le modulieren neuronale Aktivit&auml;ten wie Spike-Frequenz-Anpassung und synaptischen &Uuml;bertragung. Fr&uuml;here Studien festgestellt, dass Ca(2+)-Bindungsstellen und Aktivierung Tor r&auml;umlich voneinander, in das Kanal-Protein, aber der Mechanismus getrennt sind, durch welchen, den ca(2+) Bindung &ouml;ffnet das Tor &uuml;ber diese Distanz bleibt unklar. Durch das Studium einer Asp-Gly-Mutation (D434G) assoziiert mit menschlichen Syndrom Generalisierte Epilepsie und paroxysmale Dyskinesie (GEPD), zeigen wir, dass ein cytosolisches Motiv, die unmittelbar nach die Aktivierung Tor S6 Helix, bekannt als der AC-Region, die allosterische Kopplung zwischen Ca(2+) Bindung und Kanal-Er&ouml;ffnung vermittelt. Die GEPD-Mutation innerhalb der AC-Region erh&ouml;ht BK-Channel-Aktivit&auml;ten durch verst&auml;rkte diese allosterischer Kopplung. Wir fanden, dass Ca(2+) Empfindlichkeit erh&ouml;ht wird, durch Zuw&auml;chse in L&ouml;sungsviskosit&auml;t, die Protein-Dynamik zu reduzieren. Die Mutation GEPD &auml;ndert eine solche Reaktion, darauf hindeutet, dass eine weniger flexible AC-Region mehr Kupplung Ca(2+) Bindung an Kanal Er&ouml;ffnung wirken k&ouml;nnte.

Eine Epilepsie/Dyskinesie-assoziierten Mutation verbessert BK Kanal Aktivierung durch potentiating Ca2 + Sensorik.

CA(2+)-attivato canali BK modulano attivit&agrave; neuronale, tra cui spike frequenza adattamento e trasmissione sinaptica. Precedenti studi hanno trovato che Ca(2+)-associazione siti e il cancello di attivazione sono spazialmente separati in proteina canale, ma il meccanismo da cui Ca(2+) associazione si apre il cancello sopra questa distanza rimane sconosciuto. Studiando una mutazione Asp-Gly (D434G) associata a sindrome umana di epilessia generalizzata e discinesia parossistica (GEPD), ci mostra che un motivo citosolico immediatamente dopo l&#39;elica attivazione cancello S6, conosciuta come la regione di AC, da intermediario allosterico accoppiamento tra associazione Ca(2+) e apertura del canale. La mutazione del GEPD all&#39;interno della regione di AC aumenta BK canale attivit&agrave; migliorando questo accoppiamento allosterico. Abbiamo trovato che Ca(2+) sensibilit&agrave; &egrave; arricchito da aumento della viscosit&agrave; della soluzione che riducono il dynamics della proteina. La mutazione del GEPD altera tale risposta, suggerendo che una regione meno flessibile AC pu&ograve; essere pi&ugrave; efficacia in associazione Ca(2+) all&#39;apertura del canale di accoppiamento.

Una mutazione di epilessia/discinesia-associated migliora attivazione canale BK POTENZIANTI Ca2 + di rilevamento.

&#x306E;Ca&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;BK&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x304C;&#x30B9;&#x30D1;&#x30A4;&#x30AF;&#x983B;&#x5EA6;&#x9806;&#x5FDC;&#x3068;&#x30B7;&#x30CA;&#x30D7;&#x30B9;&#x4F1D;&#x9054;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x795E;&#x7D4C;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x307E;&#x3067;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;Ca&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3068;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;&#x304C;&#x7A7A;&#x9593;&#x7684;&#x306B;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;&#x5206;&#x96E2;&#x304C;&#x3001;Ca&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x7D50;&#x5408;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x8DDD;&#x96E2;&#x3067;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;&#x3092;&#x958B;&#x304D;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x306F;&#x4E0D;&#x660E;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x5206;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x5168;&#x822C;&#x3066;&#x3093;&#x304B;&#x3093;&#x3068;&#x767A;&#x4F5C;&#x6027;&#x30B8;&#x30B9;&#x30AD;&#x30CD;&#x30B8;&#x30A2;&#x306E;&#x4EBA;&#x9593;&#x75C7;&#x5019;&#x7FA4;&#xFF08;GEPD&#xFF09;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x306E;Asp&#x304B;&#x3089;Gly&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#xFF08;D434G&#xFF09;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3059;&#x3050;&#x306B;AC&#x9818;&#x57DF;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;S6&#x3078;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3001;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x30A2;&#x30ED;&#x30B9;&#x30C6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x6B21;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;CA&#x306E;&#x9593;&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x7D50;&#x5408;&#x3068;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x958B;&#x53E3;&#x3002; AC&#x9818;&#x57DF;&#x5185;&#x306E;GEPD&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30ED;&#x30B9;&#x30C6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x5F37;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;BK&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x3055;&#x305B;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;Ca&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x611F;&#x5EA6;&#x306F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x6E1B;&#x3089;&#x3059;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x7C98;&#x5EA6;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x305F;&#x3002; GEPD&#x5909;&#x7570;&#x304C;&#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x67D4;&#x8EDF;&#x306A;AC&#x9818;&#x57DF;&#x306F;Ca&#x3092;&#x30AB;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3067;&#x3001;&#x3088;&#x308A;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3092;&#x5909;&#x5316;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x958B;&#x53E3;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x3002;

&#x3066;&#x3093;&#x304B;&#x3093;/&#x30B8;&#x30B9;&#x30AD;&#x30CD;&#x30B8;&#x30A2;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3057;&#x305F;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x3001;Ca2 +&#x306E;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x5897;&#x5F37;&#x3057;&#x3066;BK&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3092;&#x5897;&#x5F37;&#x3059;&#x308B;

&#xBCF4; &#xB9AC; &#xCC44;&#xB110; Ca(2+) &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xC2A4;&#xD30C;&#xC774;&#xD06C; &#xC8FC;&#xD30C;&#xC218; &#xC801;&#xC751;, &#xC2DC; &#xB0C5; &#xC2A4; &#xC804;&#xC1A1; &#xB4F1; &#xC2E0;&#xACBD; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC870;&#xC808;. &#xC774;&#xC804; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; Ca(2+) &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC640; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xAC8C;&#xC774;&#xD2B8; &#xCC44;&#xB110; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xB9CC;&#xC774; &#xAC70;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xAC8C;&#xC774;&#xD2B8; &#xC5F4;&#xB9BD;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xB294; ca(2+)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC54C; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xB0A8;&#xC544; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBD84;&#xB9AC; &#xACF5;&#xAC04;&#xC801; &#xBC1C;&#xACAC;. (D434G)&#xB85C; &#xC77C;&#xBC18;&#xD654; &#xB41C; &#xAC04; &#xC9C8;&#xACFC; &#xBC1C;&#xC791;&#xC758; &#xC6B4;&#xB3D9; &#xC774;&#xC0C1; &#xC99D; (GEPD)&#xC758; &#xC778;&#xAC04; &#xC99D;&#xD6C4;&#xAD70;&#xACFC; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; Asp Gly &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xD568;&#xC73C;&#xB85C;&#xC368; &#xC6B0;&#xB9AC; AC &#xC601;&#xC5ED;&#xC73C;&#xB85C; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xAC8C;&#xC774;&#xD2B8; S6 &#xB098;&#xC120; &#xC9C1;&#xD6C4; cytosolic &#xBAA8;&#xD2F0;&#xBE0C; Ca(2+) &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xACFC; &#xCC44;&#xB110; &#xAC1C;&#xBC29; &#xAC04;&#xC758; allosteric &#xCEE4;&#xD50C;&#xB9C1; &#xC911;&#xC7AC; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. AC &#xC601;&#xC5ED; &#xB0B4; GEPD &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; allosteric &#xCEE4;&#xD50C;&#xB9C1;&#xC774; &#xAC15;&#xD654; &#xD558; &#xC5EC; &#xBCF4; &#xB9AC; &#xCC44;&#xB110; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC99D;&#xAC00; &#xC2DC;&#xD0B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; Ca(2+) &#xAC10;&#xB3C4; &#xC904;&#xC774;&#xACE0; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC5ED;&#xD559; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158; &#xC810;&#xB3C4; &#xC99D;&#xAC00; &#xC758;&#xD574; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC1C;&#xACAC;. GEPD &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xB35C; &#xC720;&#xC5F0;&#xD55C; AC &#xC9C0;&#xC5ED; &#xCC44;&#xB110; &#xC624;&#xD504;&#xB2DD;&#xC5D0; Ca(2+) &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xCEE4;&#xD50C;&#xB9C1;&#xC5D0; &#xB354; &#xD6A8;&#xACFC;&#xAC00; &#xC788;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; &#xC751;&#xB2F5;&#xC744; &#xBCC0;&#xACBD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xAC04; &#xC9C8;/&#xC6B4;&#xB3D9; &#xC7A5;&#xC560; &#xAD00;&#xB828; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; potentiating Ca2 + &#xAC10;&#xC9C0; &#xD558; &#xC5EC; &#xBCF4; &#xB9AC; &#xCC44;&#xB110; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xB97C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xC2DC;&#xD0B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Ca (2 +) activados por los canales BK modular la actividad neuronal, incluida la adaptaci&#xF3;n de frecuencias pico y la transmisi&#xF3;n sin&#xE1;ptica. Estudios anteriores encontraron que el Ca (2 +)-sitios de uni&#xF3;n y la puerta de activaci&#xF3;n est&#xE1;n separados espacialmente en la prote&#xED;na del canal, pero el mecanismo por el cual Ca (2 +) de uni&#xF3;n se abre la puerta sobre esta distancia sigue siendo desconocido. Al estudiar una mutaci&#xF3;n Asp-a-Gly (D434G) asociada con el s&#xED;ndrome humano de epilepsia generalizada y disquinesia parox&#xED;stica (GEPD), nos muestran que un motivo citos&#xF3;lica inmediatamente despu&#xE9;s de la puerta de activaci&#xF3;n S6 h&#xE9;lice, conocida como la regi&#xF3;n de CA, media el acoplamiento alost&#xE9;rico entre Ca (2 +) de uni&#xF3;n y apertura del canal. La mutaci&#xF3;n GEPD dentro de la regi&#xF3;n de CA aumenta la actividad del canal BK mediante la mejora de este acoplamiento alost&#xE9;rico. Hemos encontrado que el Ca (2 +) sensibilidad est&#xE1; potenciada por el aumento en la viscosidad soluci&#xF3;n que reducen la din&#xE1;mica de prote&#xED;nas. La mutaci&#xF3;n GEPD altera dicha respuesta, lo que sugiere que una regi&#xF3;n de CA menos flexible puede ser m&#xE1;s eficaz en el acoplamiento de Ca (2 +) de uni&#xF3;n a la apertura del canal.

Un Epilepsia / discinesia asociada a la mutaci&#xF3;n aumenta la activaci&#xF3;n de los canales BK potenciando la Ca2 + Sensor

BK &#x578B; K(+) &#x901A;&#x9053;&#x88AB;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x7535;&#x538B;&#x548C;&#x80DE;&#x5185;&#x7684;&#x7ECF;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x662F;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x8C03;&#x8282;&#x808C;&#x8089;&#x6536;&#x7F29;&#x3001; &#x795E;&#x7ECF;&#x4F20;&#x9012;&#x53CA;&#x663C;&#x591C;&#x8282;&#x5F8B;&#x7684;&#x8D77;&#x640F;&#x5668;&#x8F93;&#x51FA;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x8868;&#x660E; BK &#x901A;&#x9053;&#x7684;&#x80DE;&#x6D46;&#x57DF;&#x5305;&#x542B;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x7ECF;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F4D;&#x70B9;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F;&#x5B8C;&#x5168;&#x77E5;&#x9053;&#x5206;&#x5B50;&#x6784;&#x6210;&#x7684;&#x5730;&#x70B9;&#x4E4B;&#x4E00;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#xFF0C;&#x7531;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x8BF1;&#x53D8;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x67E5;&#x660E; E535 &#x4F5C;&#x4E3A;&#x6B64;&#x7ECF;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7AD9;&#x70B9;&#x7684;&#x4E00;&#x90E8;&#x5206;&#x3002;&#x672C;&#x7F51;&#x7AD9;&#x662F;&#x5177;&#x4F53;&#x7528;&#x4E8E;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x7ECF;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F; Cd(2+)&#x3002;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x7ED3;&#x679C;&#x548C;&#x57FA;&#x4E8E; BK &#x901A;&#x9053;&#x80DE;&#x6D46;&#x57DF;&#x7684; x &#x5C04;&#x7EBF;&#x6676;&#x4F53;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x5EFA;&#x6A21;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x66F4;&#x6539;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7AD9;&#x70B9;&#x5468;&#x56F4;&#x7684;&#x5F62;&#x6001;&#x548C;&#x8F6C;&#x5230;&#x758F;&#x6C34;&#x6027;&#x7684;&#x6838;&#x5FC3;&#xFF0C;M513 &#x7684;&#x4FA7;&#x94FE;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x4E00;&#x4E2A;&#x57FA;&#x7840;&#xFF0C;&#x61C2;&#x5F97;&#x5982;&#x4F55;&#x7ECF;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5728;&#x6B64;&#x7AD9;&#x70B9;&#x6253;&#x5F00;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x95E8;&#x7684;&#x901A;&#x9053;&#x7684;&#x8FDC;&#x7A0B;&#x4F4D;&#x4E8E;&#x819C;&#x7ECF; E535 &#x548C;&#x4EE5;&#x524D;&#x53D1;&#x73B0;&#x7684; D367 &#x4FA7;&#x94FE;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x3002;

&#x79BB;&#x5B50;&#x611F;&#x5E94; BK &#x901A;&#x9053;&#x7684; RCK1 &#x57DF;&#x4E2D;&#x3002;

BK-type K(+) channels are activated by voltage and intracellular Ca(2+), which is important in modulating muscle contraction, neural transmission, and circadian pacemaker output. Previous studies suggest that the cytosolic domain of BK channels contains two different Ca(2+) binding sites, but the molecular composition of one of the sites is not completely known. Here we report, by systematic mutagenesis studies, the identification of E535 as part of this Ca(2+) binding site. This site is specific for binding to Ca(2+) but not Cd(2+). Experimental results and molecular modeling based on the X-ray crystallographic structures of the BK channel cytosolic domain suggest that the binding of Ca(2+) by the side chains of E535 and the previously identified D367 changes the conformation around the binding site and turns the side chain of M513 into a hydrophobic core, providing a basis to understand how Ca(2+) binding at this site opens the activation gate of the channel that is remotely located in the membrane.

Ion sensing in the RCK1 domain of BK channels.

BK-type K (+) les canaux sont activ&#xE9;s par la tension et intracellulaire de Ca (2 +), ce qui est important dans la contraction musculaire de modulation, la transmission nerveuse, et la sortie oscillateur circadien. Des &#xE9;tudes ant&#xE9;rieures sugg&#xE8;rent que le domaine cytosolique de BK contient deux canaux diff&#xE9;rents Ca (2 +) des sites de liaison, mais la composition mol&#xE9;culaire de l&#x26;#39;un des sites n&#x26;#39;est pas compl&#xE8;tement connue. Nous rapportons ici, par des &#xE9;tudes de mutagen&#xE8;se syst&#xE9;matique, l&#x26;#39;identification des E535 dans le cadre de cette Ca (2 +) site de liaison. Ce site est sp&#xE9;cifique pour la liaison &#xE0; Ca (2 +), mais pas Cd (2 +). Les r&#xE9;sultats exp&#xE9;rimentaux et de mod&#xE9;lisation mol&#xE9;culaire bas&#xE9;e sur les structures cristallographiques aux rayons X du domaine BK canal cytosolique sugg&#xE8;rent que la fixation du Ca (2 +) par les cha&#xEE;nes lat&#xE9;rales de E535 et D367 pr&#xE9;c&#xE9;demment identifi&#xE9;s les changements de la conformation autour du site de liaison et fait de la la cha&#xEE;ne lat&#xE9;rale de M513 en un noyau hydrophobe, fournissant une base pour comprendre comment ca (2 +) contraignant &#xE0; ce site ouvre la porte d&#x26;#39;activation de la voie qui est &#xE0; distance situ&#xE9; dans la membrane.

Ion de d&#xE9;tection dans le domaine de canaux BK RCK1

BK-Typ K(+)-Kan&auml;le sind durch Spannung und intrazellul&auml;re Ca(2+), die in modulierende Muskelkontraktion, neuronale &Uuml;bertragung und zirkadianen Schrittmacher Ausgabe wichtig ist aktiviert. Fr&uuml;here Studien schlagen vor, da&szlig; die Zytosolische Dom&auml;ne BK Kan&auml;le zwei verschiedene Ca(2+)-Bindungsstellen enth&auml;lt, aber die molekulare Zusammensetzung von einer der Seiten ist nicht vollst&auml;ndig bekannt. Hier berichten wir, durch systematische Mutagenese Studien, die Identifizierung der E535 als Teil dieses Ca(2+)-Bindungsstelle. Diese Seite ist speziell f&uuml;r die Bindung an Ca(2+) aber nicht Cd(2+). Experimentelle Ergebnisse und Molekulare Modellierung basierend auf der x-ray kristallographischen Strukturen der BK Kanal Zytosolische Dom&auml;ne schlagen vor, da&szlig; die Bindung des Ca(2+) durch die Seitenketten E535 und die zuvor identifizierten D367 die Konformation um die Bindungsstelle &auml;ndert und die Seitenkette des M513 in einen hydrophoben Kern dreht, eine Basis um zu verstehen, wie Ca(2+) Bindung an diesem Standort die Aktivierungs-Gates f&uuml;r den Kanal &ouml;ffnet, die sich aus der Ferne in der Membran befindet.

Ion Sensorik im Bereich RCK1 BK-Kan&auml;le.

BK-tipo K(+) canali sono attivati dalla tensione e Ca(2+) intracellulare, che &egrave; importante nella modulante la contrazione muscolare, trasmissione neurale e pacemaker circadiano output. Studi precedenti suggeriscono che il dominio citosolico di canali BK contiene due diversi siti di legame Ca(2+), ma la composizione molecolare di uno dei siti non &egrave; completamente noto. Riportiamo, da studi di mutagenesi sistematica, l&#39;identificazione di E535 come parte di questo sito di legame Ca(2+). Questo sito &egrave; specifico per l&#39;associazione di Ca(2+) ma non Cd(2+). Risultati sperimentali e modellistica molecolare basato sulle strutture cristallografiche dei raggi x del dominio citosolico BK canale suggeriscono che l&#39;associazione di Ca(2+) dalle catene laterali di E535 e il D367 precedentemente identificati cambia la conformazione intorno al sito dell&#39;associazione e si trasforma la catena laterale di M513 in un core idrofobico, fornendo una base per capire come associazione Ca(2+) in questo sito si apre il cancello di attivazione del canale che si trova in remoto nella membrana.

Ione di rilevamento nel dominio dei canali BK RCK1.

BK-K&#x578B;&#xFF08;+&#xFF09;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x5909;&#x8ABF;&#x7B4B;&#x53CE;&#x7E2E;&#x3001;&#x795E;&#x7D4C;&#x4F1D;&#x9054;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x6982;&#x65E5;&#x30DA;&#x30FC;&#x30B9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x306E;&#x51FA;&#x529B;&#x304C;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x96FB;&#x5727;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;Ca&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x307E;&#x3067;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;BK&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;2&#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;Ca&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x4E00;&#x3064;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x7D44;&#x6210;&#x304C;&#x5B8C;&#x5168;&#x306B;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;Ca&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306E;&#x4E00;&#x90E8;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F53;&#x7CFB;&#x7684;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x8A98;&#x767A;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;E535&#x306E;&#x540C;&#x5B9A;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306F;&#x3001;Ca&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;CD&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x56FA;&#x6709;&#x306E;&#x3082;&#x306E;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x5B9F;&#x9A13;&#x7D50;&#x679C;&#x3068;BK&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;X&#x7DDA;&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x304F;&#x5206;&#x5B50;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3067;&#x306F;&#x3001;E535&#x306E;&#x5074;&#x9396;&#x3068;&#x4EE5;&#x524D;&#x306B;&#x540C;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;D367&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x5468;&#x8FBA;&#x306E;&#x7ACB;&#x4F53;&#x914D;&#x5EA7;&#x306B;&#x3088;&#x308B;Ca&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x3068;&#x304C;&#x56DE;&#x8EE2;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x306E;Ca&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x7D50;&#x5408;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30E2;&#x30FC;&#x30C8;&#x819C;&#x306B;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;&#x3092;&#x958B;&#x304F;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x7406;&#x89E3;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x57FA;&#x790E;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x758E;&#x6C34;&#x6027;&#x30B3;&#x30A2;&#x306B;M513&#x306E;&#x5074;&#x9396;&#x3001;&#x3002;

&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;BK&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;RCK1&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x5185;&#x306E;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;

BK &#xD0C0;&#xC785; K(+) &#xCC44;&#xB110; &#xC804;&#xC555; &#xBC0F; &#xBCC0;&#xC870; &#xADFC;&#xC721; &#xC218;&#xCD95;, &#xC2E0;&#xACBD; &#xC804;&#xC1A1; &#xBC0F; circadian &#xC2EC;&#xC7A5; &#xBC15; &#xB3D9;&#xAE30; &#xCD9C;&#xB825;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; ca(2+)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xC804; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xC81C;&#xC548; &#xBCF4; &#xB9AC; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; cytosolic &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xC11C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xB978; Ca(2+) &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;, &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC758; &#xBD84;&#xC790; &#xAD6C;&#xC131; &#xC644;&#xC804;&#xD788; &#xC54C;&#xB824;&#xC838; &#xC788;&#xC9C0; &#xC54A;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC778; mutagenesis &#xC5F0;&#xAD6C;, E535 Ca(2+) &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC758; &#xD55C; &#xBD80;&#xBD84;&#xC73C;&#xB85C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558; &#xC5EC; &#xBCF4;&#xACE0;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB294; Ca(2+) &#xD558;&#xC9C0; Cd(2+) &#xD558;&#xB294; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;. &#xC2E4;&#xD5D8; &#xACB0;&#xACFC; &#xBCF4; &#xB9AC; &#xCC44;&#xB110; cytosolic &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; crystallographic x-&#xC120; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xD558;&#xB294; &#xBD84;&#xC790; &#xBAA8;&#xB378;&#xB9C1;&#xC5D0;&#xB294; e535&#xC640; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xD655;&#xC778; &#xB41C; D367 &#xCE21;&#xBA74; &#xCCB4;&#xC778;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; ca(2+)&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xC8FC;&#xC704; &#xB098; &#xB780;&#xC744; &#xBCC0;&#xACBD; &#xD558; &#xACE0; &#xC5B4;&#xB5BB;&#xAC8C;&#xC774; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; Ca(2+) &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC5F4;&#xB9BD;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC6D0;&#xACA9;&#xC73C;&#xB85C; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xBB38; &#xC774;&#xD574;&#xB97C; &#xAE30;&#xCD08;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558; &#xACE0; &#xC18C;&#xC218; &#xC131; &#xCF54;&#xC5B4;&#xB85C; M513 &#xCE21;&#xBA74; &#xCCB4;&#xC778; &#xC124;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC774;&#xC628; &#xBCF4; &#xB9AC; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; RCK1 &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

BK de tipo K (+) canales son activados por voltaje y intracelular de Ca (2 +), lo cual es importante en la modulaci&#xF3;n de la contracci&#xF3;n muscular, la transmisi&#xF3;n nerviosa, y la salida del marcapasos circadiano. Los estudios anteriores sugieren que el dominio citos&#xF3;lico de BK canales contiene dos diferentes Ca (2 +) los sitios de uni&#xF3;n, pero la composici&#xF3;n molecular de uno de los sitios no es completamente conocido. Aqu&#xED; mostramos, mediante estudios de mutag&#xE9;nesis sistem&#xE1;ticas, la identificaci&#xF3;n de E535 como parte de este Ca (2 +) sitio de uni&#xF3;n. Este sitio es espec&#xED;fica para la uni&#xF3;n a Ca (2 +), pero no Cd (2 +). Los resultados experimentales y de modelado molecular basada en las estructuras cristalogr&#xE1;ficas de rayos X del dominio BK canal citos&#xF3;lica sugieren que la uni&#xF3;n de Ca (2 +) por las cadenas laterales de E535 y los anteriormente identificados D367 cambia la conformaci&#xF3;n alrededor del sitio de uni&#xF3;n y se vuelve el la cadena lateral de M513 en un n&#xFA;cleo hidr&#xF3;fobo, proporcionando una base para comprender c&#xF3;mo Ca (2 +) de uni&#xF3;n en este sitio se abre la puerta de activaci&#xF3;n del canal que est&#xE1; situado a distancia en la membrana.

Junqiu Yang

Department of Energy,
Environmental & Chemical Engineering

Washington University in St. Louis

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Junqiu Yang

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Department of Energy,Environmental & Chemical Engineering

Washington University in St. Louis

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Department of Energy,
Environmental & Chemical Engineering