Generación de humanos CD40 activado por células B

Resumen

En este video se presenta la Ex vivo Generación y ampliación de los derechos humanos CD40-activa las células B (CD40-B) a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) por la estimulación con el ligando CD40 y la interleucina-4.

Resumen

CD40-activa las células B (CD40-células B) se han identificado como una fuente alternativa de presentadoras de antígeno inmuno-estimulantes de las células (APC) para la inmunoterapia del cáncer ^1-3. Comparación con las células dendríticas (CDs), la mejor caracterizada APC, las células CD40-B tienen varias propiedades diferentes biológicos y técnicos. Al igual que en los países en desarrollo, las células B muestran un incremento en la expresión de MHC y moléculas co-estimulantes (Fig.1b), muestran una gran capacidad migratoria y la presentación de antígenos presentes de manera eficiente a las células T, después de la estimulación con el ligando interleucina-4 y CD40 (CD40L). Sin embargo, en contraste con los países en desarrollo inmaduro o maduro, las células CD40-B expresan la tríada de los ganglios linfáticos completa mensajeras que consta de CD62L, CCR7/CXCR4, y la función leucocitaria antígeno-1 (LFA1, CD11a/CD18), necesarios para la recalada de los órganos linfoides secundarios (Fig. 1A) ^3. Las células CD40-B se puede generar sin problemas de cantidades muy pequeñas de sangre periférica, que puede ser ampliado in vitro a cantidades muy grandes de muy pura CD40-células B (> 10 ⁹ células por paciente) de donantes sanos, así como el cáncer pacientes (Fig. 1c, d) ^1,4.

En este protocolo se demuestra cómo obtener completamente activados CD40-células B a partir de PBMC humanos. Moléculas clave para el cultivo de células son CD40 ligando, la interleucina-4 (IL-4) y ciclosporina A (CsA), que se renuevan en un ciclo de día y la cultura 4.3. Para fines de laboratorio CD40-estimulación es proporcionado por NIH/3T3 células que expresan el ligando CD40 humano recombinante (tCD40L NIH/3T3) ^5. Para evitar la contaminación con células no transfectadas, la expresión del ligando de CD40 humano en los transfectantes tiene que ser revisado regularmente (Fig. 2).

Después de 14 días CD40-B consisten en cultivos celulares de más del 95% de pureza células B y la expansión de células B CD40-más de 65 días es con frecuencia posible sin ningún tipo de pérdida de la función ^{1, 4.} Las células CD40-B de manera eficiente recoger, procesar y ⁶ presentan antígenos a las células T. No sólo naϊve principal, sino también ampliar las células T de memoria ^7,8. CD40-activa las células B puede ser usado para estudiar la activación de células B, diferenciación y función. Además, representan una herramienta prometedora para la vacunación terapéutica o preventiva contra los tumores ^9.

Protocolo

El protocolo para la generación de las células B CD40-activado a partir de PBMC se divide en dos partes: la parte A demuestra la preparación de ligando de CD40 que expresa NIH/3T3 células, que se utilizará como células alimentadoras obligado placa. La parte B describe la actual CD40-B cultura.

A. Preparación de las células de alimentación (tCD40L NIH/3T3)

El NIH/3T3 tCD40L es un adherente línea murina de células de fibroblastos, que nunca debe ser totalmente confluente. Las células son por lo tanto, dividido dos veces por semana. El cultivo de más de más de 6 semanas no es recomendable.

1. Quitar medio de edad de la cultura de primaria con una pipeta estéril y lavar las células con 10 ml de PBS 1x. Aspirar el PBS después del lavado.
2. Agregar 4 ml de tripsina / EDTA en un matraz de 75 cm ² durante 5-10 minutos a 37 ° C. Use suaves golpecitos para separar las células.
3. Agregar 10 ml de medio de tipo salvaje y giro suave.
4. La transferencia de la suspensión de células en un tubo de 50 ml con una pipeta estéril y el giro de las células hacia abajo a 225 xg durante 5 min.
5. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de medio de tipo salvaje. Cuente el número de células de una parte alícuota de la suspensión celular y preparar tres tubos de 50 ml con el número adecuado de células:
   1. 1,5 x 10 ⁶ células por subcultivo
   2. 0,2 x 10 ⁶ células / pocillo de irradiación utilizadas para el cultivo de células CD40-B
   3. resto de congelar (si es necesario).
6. Giro de las células hacia abajo a 225 xg durante 5 min.
7. Eliminar el sobrenadante.
   1. Para subcultivo: resuspender 1,5 x 10 ⁶ células en 10 ml de medio de tipo salvaje en un 75 cm ² frasco de cultivo celular (densidad celular de 1,5 x 10 ⁵ células / ml), añadir G-418 [0,7 mg / ml] e incubar las células en 37 ° C con 5% de CO _2. Dividir las células dos veces por semana.
   2. Para el cultivo de células CD40-B: Es necesario 1,2 x 10 ⁶ células por uno de 6 pocillos. Resuspender las células en el medio silvestre, con una densidad de 0,1 x 10 ⁶ células / ml e irradiar a los 78 Gy. Placa de 2 ml de la suspensión celular en cada pocillo y se incuba a 37 ° C con 5% de CO _2. Utilice esta platos preparados para la estimulación de células B cuando tCD40L NIH/3T3 células adherentes (por lo menos 4 horas: comprobar el cumplimiento con el microscopio, no espere más de 24 horas para empezar la estimulación de células B). (Continuar con B.)

B. CD 40-B de cultivo celular

I. Preparación de PBMCs de CD40-estimulación (día 0):

Tenga en cuenta: antes de continuar asegurarse de que las células alimentadoras son adherentes. Siempre agregue nuevas soluciones de interleucina-4 y la ciclosporina A para el medio de cultivo inmediatamente antes del uso.

1. Tome PBMCs, ya sea fresco o descongelado adecuadamente. Resuspender PBMCs dos veces en 50 ml de PBS 1x para lavar y centrifugar por primera vez a 265 g durante 7 min y una segunda vez a 190 xg durante 7 min para eliminar otras células. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 20 ml de PBS. Determinar el número de células en una parte alícuota de la suspensión celular.
2. Decantar la cantidad necesaria de células en 225 g durante 5 min. Para una placa de 6 pocillos 4 x 10 ⁶ células / así se necesitan, por lo tanto 24 x 10 ⁶ células por placa.
3. Eliminar el sobrenadante y resuspender el PBMC a 1 x 10 ⁶ células / ml en CD40-B medio de cultivo fresco suplementado con 50 U / mL de IL-4 como un factor de crecimiento y 0,63 ciclosporina mg / ml A para prevenir la extensión de las células T (Teniendo en cuenta las concentraciones se refieren a un medio de cultivo ml!).
4. Eliminar el sobrenadante de 6 y placa pre-incubadas con tCD40L NIH/3T3 células.
5. Lave el adherente tCD40L NIH/3T3 células con 2 ml de PBS por el primer pozo y en una segunda fase con 2 ml de CD40-B medio de lavado.
6. Suavemente agregar 4 ml de la suspensión de PBMC (1 x 10 ⁶ células / ml) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos.
7. Se incuban las células a 37 º C con CO2 al _5%.
8. El día 7, reculture las células (Continúe con 3.2.).

II. Nueva puesta en cultivo de células CD40-B (día 7, y después cada 3-4 días):

1. Racimos de la cosecha de células B CD40-de 6 y placa resuspendiendo con una pipeta de 10 ml y la piscina que en un tubo de 50 ml.
2. Centrifugar a 225 xg durante 7 minutos y sustituir por completo el sobrenadante con CD40-B medio de lavado. Al contar la cantidad de células de una parte alícuota, girar las células hacia abajo a 225 xg durante 5 minutos. Resuspender las células CD40-B CD40-B en el medio de cultivo a una concentración de 1 x 10 ⁶ células / ml.
3. Añadir nuevas soluciones de interleucina-4 en una concentración de 50 U / mL y 0,63 mg / ml de ciclosporina A en el medio.
4. Eliminar el sobrenadante de una placa de 6 pocillos pre-incubadas con tCD40L NIH/3T3 células.
5. Lave las células adherentes con 2 ml de PBS por pocillo primera y en una segunda fase con 2 ml de CD40-B medio de lavado.
6. Suavemente agregar 4 ml (1 x 10 ⁶ células / ml) de suspensión CD40-B a cada pocillo de la placa de 6 pocillos.
7. Incubar las placas a 37 ° C con 5% de CO ^2.
8. Las células de la subcultura de nuevo cada 3-4 días para terminar con las células humanas de alta pureza B CD40-activa después de un total de 14 días.

C. Solución de problemas - ¿Qué pasa si las células CD40-B no crecen?

1. ¿Ha revisado para la expresión del ligando CD40 de células alimentadoras?
2. La placa con destino células alimentadoras utiliza para la estimulación no debe ser mayor de 24 horas?
3. Es una contaminación por micoplasma es posible?
4. Era la solución de interleuquina-4 utilizado para la suplementación recién descongelado y tuvo la actividad biológica apropiada?
5. Se añade la ciclosporina A en la concentración correcta?

Figura 1. Por favor, haga clic aquí para una versión ampliada de la figura 1.

Figura 2. Por favor, haga clic aquí para una versión ampliada de la figura 2.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alimentador de medio celular de tipo salvaje		Alimentador de selección de células medianas
Reactivo	Concentración	Reactivo	Concentración
DMEM-Cam / F12		DMEM-Cam / F12
L-Glutamina	365 mg / ml	L-Glutamina	365 mg / ml
FBS	10%	FBS	10%
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamicina	15 mg / ml	Gentamicina	15 mg / ml
		G-418	0,7 mg / ml

CD40-B medio de lavado		CD40-B medio de cultivo
Reactivo	Concentración	Reactivo	Concentración
IMDM		IMDM
L-Glutamina	584 mg / ml	L-Glutamina	584 mg / ml
HEPES	25 mM	HEPES	25 mM
Gentamicina	15 mg / ml	Gentamicina	15 mg / ml
		rh transferrina	50 mg / ml
		La insulina rh	5 mg / ml
		AB-Humanserum	10%

Reactivo	Empresa	El número de orden
DMEM / Ham F12	PAA	Ningún gato: E15-813
IMDM	Invitrogen Gibco ®	REF 21980-032
Dulbecco PBS (10x)	PAA	No gato H15-011
AB-suero humano	Invitrogen	Gato No 34005100
holo-transferrina humana	Sigma	Gato No T0665
La insulina humana	Sigma	Gato No I2643
Gencin ®	Seleccione Delta	Arte No 7395800
La interleucina-4 humana recombinante	Immunotools	Gato No 11130045
La ciclosporina A	Novartis	No NDC 0078-0109-01 gato
FBS	LONZA	Gato No DE14-802C
Tampón HEPES	PAA	No gato S11-001
G-418 Sulfato	PAA	No gato P02-012
Tripsina / EDTA (10 veces)	Invitrogen Gibco ®	REF 15400-054

Reactivo	Empresa	El número de orden
Puntas de pipeta estériles	Sarstedt
6 y placa	NUNC	Gato No 140675
Tubo cónico de 50 ml	BD Falcon ™	Gato No 352070
Frasco de cultivo de tejidos	SARSTEDT	Gato No 83.1813.002