Ensayo para asociados a patógenos patrón molecular (PAMP)-Accionados Inmunidad (PTI) en las plantas

Resumen

Una célula de la muerte de ensayo basado en la PTI en plantas de Nicotiana benthamiana se describe.

Resumen

Para percibir los patógenos potenciales en su entorno, las plantas utilizan receptores de reconocimiento de patrones (RRP) presentes en su membrana plasmática. PRR reconoce conserva las características microbianas llamado patógeno patrones moleculares asociados (PAMP) y esto lleva a la detección de PAMP disparado por la inmunidad (PTI), lo que efectivamente previene la colonización de los tejidos de la planta por no patógenos ^1,2. El sistema más estudiado bien en PTI es la vía ³ FLS2-dependiente. FLS2 reconoce la flg22 PAMP que es un componente de la flagelina bacteriana.

Patógenos éxito poseen factores de virulencia o efectores que pueden suprimir la PTI y permitir que el patógeno que causa la enfermedad ^1. Algunas plantas, a su vez poseen los genes de resistencia que detectan los efectores o su actividad, lo que lleva a efectores activados por la inmunidad (ETI) ^2.

Se describe una celda de la muerte de ensayo basado en la PTI modificado a partir de Oh y Collmer ^4. El ensayo fue estandarizado en el N. benthamiana, que se está utilizando cada vez más como un sistema modelo para el estudio de las interacciones planta-patógeno ^5. PTI es inducida por la infiltración de una cepa no patógena de bacterias en las hojas. Siete horas después, una cepa bacteriana que causa la enfermedad o bien que se activa la ETI se infiltra en una zona de solapamiento de la zona de infiltración original. PTI inducida por la primera infiltración es capaz de retrasar o prevenir la aparición de la muerte celular debido a la infiltración segundo desafío. Por el contrario, la aparición de la muerte celular en la zona de solapamiento de la inoculación indica el desglose de PTI.

Cuatro combinaciones diferentes de los inductores del PTI y las inoculaciones desafío fueron estandarizadas (Tabla 1). El ensayo fue probado en no callar N. benthamiana plantas que sirvieron de control y las plantas de silencio para FLS2 que se prevé que se compromete en su capacidad de desarrollar PTI.

Protocolo

Parte 1: crecimiento de las plantas y el mantenimiento

Plantas de Nicotiana benthamiana utilizado en el ensayo debe ser de 7 semanas de edad. Que se debe ajustar por lo menos 4-5 días antes de la prueba para eliminar todas las ramas axilares y flores. Es una buena idea para eliminar ramas axilares poco después de salir a fin de que las plantas sean más manejables.

Parte 2: Cultivo bacteriano

DIA 1:

1. Placas o las culturas de todas las cepas utilizadas en el ensayo se inició al mismo tiempo. Para las especies de Pseudomonas. que incluyen dos inductores y 3 cepas de desafío, las bacterias en placas KBM racha que contienen los antibióticos apropiados de las existencias de glicerol congelado (Tabla 2). Una pequeña cantidad de bacterias debe ser esparcida en el centro de la placa. Incubar la placa a 30 ° C durante aproximadamente 18-24 horas. De Agrobacterium, iniciar un cultivo líquido en LB 2 ml de un plato fresco y crecer durante la noche a 250 rpm, 30 ° C.

DIA 2:

2. Por Pseudomonas, añadir 150-200 l de KBM líquido a las bacterias y los extendió sobre toda la placa con un esparcidor de vidrio estéril. Ponga la placa posterior en la incubadora y se deja crecer por otro 20-24 horas. Debe haber un césped bacteriano en la placa al día siguiente, lo que indica un buen crecimiento. De Agrobacterium, iniciar un cultivo secundario en alrededor de 50-10 ml de LB con 20 acetosiringona M y se deja crecer durante la noche a 20 horas a 250 rpm, 30 ° C.

Parte 3: Plantas de Preparación para el ensayo

DIA 2:

1. Un día antes de la prueba de las plantas debe ser trasladado a una habitación a 22-24 ° C, la luz ~ 35-40% de humedad relativa y constante.
2. Marcar los círculos en las hojas que son al menos 1,5 cm de diámetro con un marcador negro grueso. De dos a cuatro círculos pueden ser marcados por hoja. Los círculos deben estar bien espaciados y, preferentemente, no cruzar una vena grande. Elegir bien amplió las hojas. Evite las hojas más viejas o las hojas que son difíciles o gruesa al tacto y evitar marcando los círculos en las partes bajas de la hoja.

Círculos marcando un día antes de la prueba no es esencial para el protocolo. Sin embargo, se ahorra tiempo si hay un gran número de plantas que están siendo ensayadas, y hace más fácil para lograr una sincronización precisa entre la inducción de la PTI y las inoculaciones desafío.

Parte 4: La inducción de la PTI

DIA 3:

1. Recoger las células de la placa en 10 mM de MgCl ₂ para P. fluorescens y P. putida. De Agrobacterium, se centrifuga la cultura para recoger las células y resuspender en 10 mM de MgCl ₂ + 10 mM MES pH 5,6. Repetir la centrifugación y se resuspenden en el _MgCl2-MES solución. Medir la densidad óptica (DO) de las células a 600 nm. Ajuste la SAO a los valores finales requeridos como se describe en la Tabla 2. Pseudomonas debe ser finalmente resuspendido en 10 mM MgCl ₂ y Agrobacterium en el _MgCl2-MES solución. Un volumen total de 25 ml es suficiente para inocular alrededor de 40-50 puntos.
2. Infiltrarse en los inductores PTI en los círculos de pre-marcado en las hojas con una jeringa de 1 ml sin aguja. Anote el orden en que las plantas fueron infiltradas y el momento exacto en que la infiltración se inició.

Parte 5: Desafío de la inoculación

1. Prepare P. syringae pv. DC3000 tomate, Pst DC3000 hopQ1 Δ-1 y $ pv tabaci. para el desafío, como se describe en el apartado 4.1 y la Tabla 2.
2. Siete horas después de la infiltración inductor, realizar la infiltración de desafío en el mismo orden de las plantas como la inducción se llevó a cabo. Por lo general, un punto en la periferia del círculo primera inoculación puede ser utilizado como el centro del círculo de la segunda inoculación. Si hay múltiples puntos en una hoja de continuación, asegúrese de que las infiltraciones no se superpongan.
3. Placa de diluciones seriadas de todos los cultivos utilizados para el ensayo en placas KBM o LB con los antibióticos apropiados para determinar el número exacto UFC.

Parte 6: Puntaje para la descomposición del PTI

Día 5:

1. Busque la aparición de la muerte celular debido a la ETI en los lugares que fueron inoculados con Pst DC3000. La muerte celular en el interior del área de solapamiento de la infiltración indica el desglose de PTI y debe ser calificado como un fenotipo positivo.

Día 7:

2. Busque la aparición de la muerte celular debido a la enfermedad en los lugares que fueron inoculados con Pst DC3000 hopQ1 Δ-1 o pv Ps. Tabaci . Puntuación de un fenotipo positivo de la misma manera como se describe en la parte 6.1.

Cuando las plantas de control (que no debe verse comprometida por PTI) comienzan a mostrar la muerte celular en la zona de solapamiento de la infiltración, dejar de hacer nuevas observaciones.

Parte 7: Los resultados representativos

La figura 1 muestra el resultado de un ensayo cuando P. fluorescens fue utilizado como el inductor y Pst DC3000 como el desafío.

Figura 1. P. fluorescens fue infiltrado en N. benthamiana hojas (círculo negro) para inducir la PTI y 7 horas más tarde, el acto fue impugnado con Pst DC3000 (círculo blanco). Plantas silenciadas por FLS2 mostró un desglose de PTI en la región donde P. fluorescens fue infiltrado (A), como se ve por la muerte celular. Las plantas de control que no fueron silenciados no mostró la muerte celular en la zona de solapamiento debido a la inducción de la PTI (B). Las flechas rojas indican la falta de presencia o de la muerte celular en el área de superposición de la infiltración. Las fotografías fueron tomadas dos días después de la infiltración. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.

PTI inductor	Provocando la muerte celular-desafío	La naturaleza de la muerte celular	Código
Pseudomonas fluorescens 55	Pseudomonas syringae pv tomate (Pst). DC3000 6	ETI	Pf / DC
P. putida KT2440	Pst DC3000	ETI	Pp / DC
P. fluorescens 55	Pst DC3000 hopQ1 Δ-1 6	Enfermedad	Pf/Q1-1
Agrobacterium tumefaciens GV2260	P. syringae pv. tabaci 11528R	Enfermedad	Agro / PTab

Tabla 1: Combinaciones de inducir la muerte celular PTI y que suscitan los microbios utilizados en el ensayo de la muerte celular por PTI.

Cepa bacteriana	Selección del medio	OD final utilizada en el experimento	Correspondiente UFC / ml
P. fluorescens 55	KBM ampicilina (100 ug / ml)	0.5	1 x 10 9
P. putida KT2440	KBM ampicilina (100 ug / ml)	0.5	1 x 10 8
A. tumefaciens GV2260	LB con rifampicina (100 ug / ml)	0.5	5 x 10 8
Pst DC3000	KBM rifampicina (100 ug / ml)	0.02	2 x 10 7
Pst DC3000 hopQ1 Δ-1	KBM rifampicina (100 ug / ml)	100 veces la dilución de 0,1	1 x 10 6
P. syringae pv. tabaci 11528R	KBM rifampicina (100 ug / ml)	100 veces la dilución de 0,1	1 x 10 6

Tabla 2: Las condiciones de cultivo y los niveles de inóculo utilizado en el ensayo. El OD y los correspondientes niveles UFC pueden variar entre diferentes marcas de espectrofotómetros.

Discusión

Ensayo de la muerte de la célula-basado puede ser utilizada para determinar la participación de un gen en el PTI. Por ejemplo, la pérdida de función de mutantes de un gen de interés se puede probar mediante este ensayo. De las cuatro combinaciones de inductor e inoculaciones desafío en la Tabla 1, es posible que sólo una combinación puede resultar en un fenotipo en el fondo de la planta. Hemos observado que las plantas silenciadas por FLS2 muestran un desglose del PTI en el Pf / DC y Pf/Q1-1 combinaciones de inductor e inoculaciones desafío (Tabla 1).

Es esencial que las condiciones ambientales para el ensayo son lo más cercano posible a los descritos en la parte 3.1. La baja humedad provoca la muerte celular de proceder con demasiada rapidez, haciendo que el ensayo de difícil calificación. Si las condiciones descritas en el protocolo de no trabajar en su laboratorio, y luego tratar de alterar el nivel de inductor o inoculación de desafío. Otro parámetro que se puede modificar es el intervalo de tiempo entre la inducción y la provocación, aunque se ha encontrado que más cortos intervalos de tiempo causó que el ensayo se descomponen muy rápidamente en las plantas de control.

Le recomendamos que por lo menos 4-5 plantas a prueba en un experimento y un fenotipo positivo se debe repetir por lo menos en experimentos independientes 3-4.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES	Fisher Scientific	BP300-100	Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature.
Life Science UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter Inc.	DU 730